技术领域
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种丙型肝炎病毒基因分型 的试剂盒及方法，用于检测国内发生的丙型肝炎病毒的型别1a，1b，2a，2b，3a，6a感染的辅 助诊断。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)，丙型肝炎呈世界性分布，人群普遍易 感，是严重危害人类健康、流行范围广泛的传染病。其病原体为丙型肝炎病毒(hepatitisC virus，HCV)。目前，其感染率为0.1％-10％，平均为3％。全球有超过1.7亿人感染HCV，其中 每年有超过10万例HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO2002年年 报，在2001年，慢性肝病引起1400万例死亡，包括79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发 性肝癌引起。
HCV是正性单链RNA黄病毒，包括9400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开 放阅读框，基因结构由5’-NCR-C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3’组成，编码一具有 3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构 蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达1.4-1.9×10-3/核苷酸/年)和本身具有负选择 作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-proneRDRP，EP-RDRP) 的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为：病毒基因组中各种基 因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部 分基因组的系统进化分析，HCV分为6种主要的基因型(以1-6表示)，各型又分亚型(以a、b、c 等表示)。HCV亚型已经超过100个，其中最常见的是1a，1b，2a，2b，3a，6a，各型核酸序列之间 相差31－34％，氨基酸序列相差大约30％，而亚型序列之间相差约20－23％。有几种HCV病 毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCV10a型(目前被列入 HCV3型)，由于其系统进化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。
研究表明，HCV不同型别之间对干扰素治疗的敏感度不一，特别是1型较其它型别 敏感度尤为差。不同型别HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原发 性肝癌发生率都有不同，HCV基因型与丙型肝炎患者临床病情及其严重程度密切相关。鉴于 不同HCV基因型感染者的临床表现、肝病严重程度及慢性化病程进展均有差异，抗病毒治疗 的效果也不同。因此检测HCV基因型有助于判断治疗的难易程度、制定个体化抗病毒治疗方 案。
目前对HCV基因分型方法主要有：限制性长度多态性分析法(RFLP)，基因型特异性 引物PCR法，基因型特异性探针核酸杂交分析法，直接测序法等方法，但是这些方法大多存 在操作繁琐，对设备要求高，检测时间长，通量低，还存在灵敏度低，特异性不高等缺点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性的丙型 肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法，可以一次性对多个样本中HCV进行准确分 型检测，节省检测时间。
本发明技术方案为提供一种丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，主要包括PCR反应 液和DNA杂交膜条，所述DNA杂交膜条包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可 分别与丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示：
针对HCV1a型设计探针Y1：5’-AATTGCCAGGACGACCGG-3’；
针对HCV1b型设计探针Y2：5’-AATTGCCAGGATGACCGGG-3’；
针对HCV1b型设计探针Y3：5’-CCCGGAATTGCCAGGAC-3’；
针对HCV2a型设计探针Y4：5’-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3’；
针对HCV2a型设计探针Y5：5’-CAATGCCTGGAGATTTGGGC-3’；
针对HCV2b型设计探针Y6：5’-CTCAATGCCTGGAGATTTGG-3’；
针对HCV2b型设计探针Y7：5’-GCTCAATGCCTGGAGATTTGG-3’；
针对HCV3a型设计探针Y8：5’-CAATGCCTGGAGATTTGGG-3’；
针对HCV3a型设计探针Y9：5’-CGAGGTAGACGTCAGCC-3’；
针对HCV3a型设计探针Y10：5’-ACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’；
针对HCV6a型设计探针Y11：5’-AACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’；
针对HCV6a型设计探针Y12：5’-GCAACCTCGAGGTAGACGT-3’；
针对HCV6a型设计探针Y13：5’-TAGACGTCAGCCTATCCCCAA-3’；
针对HCV1-6型设计通用探针(即阳性探针HP)Y14：5’-TAGACGCCAGCCTATTCCCA-3’；
阴性探针HN:5’-GGTCCTGTTTAACTGGCG-3’；
所述各探针5’端进行氨基标记以与尼龙膜偶联。
优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述尼龙膜上还设置有显色控 制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示：5’-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述cc探针 5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述PCR反应液包括扩增丙型肝 炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示：
逆转录引物RT：5’-CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’；
上游引物F：5’-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’；
下游引物R：5’-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’。
所述上游引物F的5’端进行生物素标记。
优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述PCR反应液还包括内参系 统，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，包括：
内参引物F1：5’-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3’；
内参引物R1：5’-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3’；
内参探针PC：5’-TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’；
所述内参引物F1的5’端进行生物素标记。
优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述探针浓度为5-20μM。
本发明的另一技术方案为提供一种丙型肝炎病毒基因分型的方法，该方法包括 下述具体步骤：
a、设计分型引物与探针，所述探针如权利要求1探针Y1-Y14所示，所述引物包括逆 转录引物RT：5’-CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’；
上游引物F：5’-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’；
下游引物R：5’-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’；
b、用活性氨基标记步骤a所述探针的5’端，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测 膜条，对所述下游引物R的5’端进行生物素标记；
c、利用步骤a中所述引物进行HCVDNA扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧 化物酶与四甲基联苯胺显色；
d、采用扫描仪，扫描杂交信号，判断基因分型结果。
优选的，上述的丙型肝炎病毒基因分型的方法，所述尼龙膜上还设置有显色控制 探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示：5’-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述显色控制 探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
优选的，上述的丙型肝炎病毒基因分型的方法，所述步骤a中的引物还包括：
内参引物F1：5’-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3’；
内参引物R1：5’-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3’；
所述步骤a中的探针还包括：
内参探针PC：5’-TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’；
所述内参引物F1的5’端进行生物素标记。
本发明的丙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法具有快速、灵敏、准 确、高通量的特点，一次杂交反应可以检测多种靶序列，取材方便，无需特殊设备，仪器投入 低，具有快速简便、敏感度高和特异性强的特点。
附图说明
图1：本发明的HCV探针在尼龙膜上的排列示意图；
图2：1型HCV病毒样本检测结果扫描图；
图3：2型HCV病毒样本检测结果扫描图；
图4：3型HCV病毒样本检测结果扫描图；
图5：6型HCV病毒样本检测结果扫描图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
本发明的目的是制备一种丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA杂交膜条，以满足大量 血液样品进行HCV快速准确分型的需要。
为此，本发明采用以下技术方案：采用反向点杂交技术(ReverseDotBlot，RDB)， 用尼龙膜作为固相载体，针对HCV不同基因型设计的特异性寡核苷酸探针，将HCV各特异性 探针以圆点的方式固定在膜条上，制备成DNA杂交膜条，以生物素标记引物，扩增待检样本 的目的核酸片断，获得带有生物素标记的扩增产物；再与固定各种寡核甘酸探针的膜条杂 交，通过酶联反应和显色，扫描后以专业的斑点分析软件对图像进行识别、去除背景、进行 客观的信号值分析，从而判断扩增产物中是否有针对各种寡核甘酸探针的基因序列，在结 果判断中减少了人为识别的主观性因素，更适用于临床检测应用。
本发明针对HCV不同型别的基因序列，设计一套特异性寡核苷酸探针(如表1所示 为寡核苷酸探针序列以及所检测的型别)，采用自动点样仪，将探针印制在一张尼龙膜的特 定区域，根据显色位点的不同来判断HCV的型别。
在上述的DNA杂交膜条的基础上再配以其它必要的组份，如PCR引物(如表2所示为 本发明所用的引物序列)，即组成完整的产品。在实际检测时，取提取的HCV核酸样本溶液， 采用生物素标记引物和不对称PCR方法，扩增出可能存在的HCV基因组生物素标记靶标片 段。取DNA杂交膜条一张，加入PCR产物45μL进行杂交，杂交温度设定为45℃，杂交时间60分 钟，经过杂交-洗涤-显色。取出膜条晾干，放入扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像 信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本HCV型别结果。
根据本发明的另一个优选实施方案，在用于样本扩增的PCR体系中引入了内参引 物，以及内参模板，并在膜条制备时引入了可与内参模板进行杂交的探针，可以对PCR过程 进行有效质量控制。
根据本发明的另一个优选的实施方案，在制备膜条时引入了显色控制探针(CC.)， 即在探针的一端标记-NH2，以与尼龙膜偶联，另一端引入生物素标记，可直接进行显色。CC 的引入可以对显色过程进行有效质量控制。
根据本发明另一个优选的实施方案，DNA杂交膜条的片基载体可以是玻片、尼龙膜 或其它可以附着探针的载体。
表1
表2
实施例
1、在HCV基因组中5’UTR区设计RT及PCR引物，采用不对称RT-PCR体系，扩增分型所 需要的目标片段；如表1所示，在目标片段范围内，设计1型探针3条，2型探针4条，3型探针3 条，6型探针三条和通用探针1条。
2、请参阅图1将尼龙膜按设计好的格式打印方格，采用自动点膜仪，将14条分型探 针和2条对照探针点制到膜条的特定区域，制成DNA杂交膜条。
点样探针溶液：将探针稀释到5×SSC、0.05％SDS溶液中，终浓度为10μM；
点样矩阵：将探针点制在膜条上，每个探针点样0.5pM，每行8点，共2行(参见图1)。
3、使用本发明产品检测临床样本
取各型别的临床样本6例和阴、阳性对照各一份，提取RNA，按照表3配制RT-PCR反 应体系，各引物如表3所示，进行PCR扩增，获得DNA杂交模板。
表3
试剂 1人份(μL) 纯水 21.5 10×PCR buffer 5 25mM MgCl2 6 dNTP(10mM) 1 10μM F 2 10μM R 1 10μM F1 2 10μM R1 1 逆转录酶/Taq酶 0.5 RNA模板 10 总量 50
PCR扩增程序如下：
采用本发明的HCV基因分型杂交膜条，对以上样本进行检测。
取一张杂交膜条，标记样本编号，放入杂交管中，分别取8管PCR产物各45μL加到对 应编号的管中，设定杂交温度45℃，杂交时间60分钟。杂交后进行洗涤、偶联、显色和风干。 具体操作如下：
1)杂交：
取15mL离心管，放入标记膜条1张，加5-8ml预热A液(2*SSC、0.5％SDS)、对应的 40ulPCR产物，盖紧管盖，放入振荡水槽，50℃轻摇(100～150转/分)，40分钟。弃去液体。
2)偶联：(每次可同时处理5张膜条)
取50mL离心管，预热B液(0.5*SSC,0.5％SDS)20ml，C液(0.01％TMB)1ml，混匀，放 入杂交膜条，50℃轻摇(40～50转/分)10分钟，弃去液体；
加预热B液(0.5*SSC,0.5％SDS)40ml，50℃轻摇3分钟，弃去液体；加D液(0.5M柠檬 酸钠，pH5.5)40ml，50℃轻摇3分钟，弃去液体。
3)显色：(每次可同时处理5-10张膜条)
取50mL离心管，加D液(0.5M柠檬酸钠，pH5.5)20ml，E液1ml(0.025％POD)，F液 (0.3H2O2)1ml，混匀即为显色液，放入膜条在室温避光静置8分钟，弃去液体；
加D液(0.5M柠檬酸钠，pH5.5)40ml，轻摇3分钟，弃去液体。杂交完成。
采用扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图(见图2-图5)，并将图像转换成 数据。
采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，同时，将8份 样本DNA测序，作为检测结果对照。结果表明，8份样本检测结果与样本测序结果完全相符 (见表4)。
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势，一次可做任意数目的样本；检 测准确性方面的可靠性(检测结果与样本测序结果完全相符)。
表4
样本编号 测序结果 本次试验结果 是否相符 01 1型 1型 是 02 2型 2型 是 03 1型 1型 是 04 3型 3型 是 05 3型 3型 是 06 6型 6型 是 07 1型 1型 是 08 6型 6型 是
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技 术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。