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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610412117.X (22)申请日 2016.06.13 (71)申请人 辽宁大学 地址 110000 辽宁省沈阳市沈北新区道义 南大街58号 (72)发明人 刘宏生邓芳博赵健朱俊丰 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 金春华 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12N 1/06(2006.01) C12N 15/80(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种桦褐孔。
2、菌原生质体的制备和转化方法 (57)摘要 本发明公开一种桦褐孔菌原生质体的制备 和转化方法。 所述制备方法， 包括如下步骤： 采用 溶壁酶和崩溃酶组成的混合酶液对桦褐孔菌菌 丝膜进行酶解， 对酶解液用8层擦镜纸过滤， 收集 滤液、 离心， 所得沉淀即为桦褐孔菌原生质体。 所 述转化步骤： 将质粒pAN7-1通过PEG/CaCl2介导， 转化至桦褐孔菌原生质体中， 得到含有质粒 pAN7-1的桦褐孔菌。 采用本方法制得的桦褐孔菌 原生质体产率高达5107个/mL， 再生率为7。 本发明的制备和转化方法为后期对该菌进行遗 传操作改造， 提高三萜化合物及其前体的产量， 进而提高桦褐孔菌的药用价值， 。
3、满足市场的需求 奠定了基础。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105969671 A 2016.09.28 CN 105969671 A 1.一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 包括制备步骤： 采用溶壁酶 和崩溃酶组成的混合酶液对桦褐孔菌菌丝膜进行酶解， 得到桦褐孔菌原生质体。 2.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述 的制备步骤具体如下： 1)原生质体的制备： 无菌接种环撩起桦褐孔菌菌丝膜， 加入离心管中， 用无菌水和渗透 压稳定剂洗涤， 用无菌滤纸片吸干水分， 按每100mg桦褐孔菌菌丝膜加1-1.5ml混合酶液的 比。
4、例， 加入混合酶液， 于30-35， 90rpm， 酶解2-3h， 得酶解液； 2)原生质体纯化： 酶解液用8层无菌擦镜纸过滤， 将滤液收集到离心管中， 4000rpm离心 10min， 弃去上清液， 取沉淀， 即为桦褐孔菌原生质体。 3.根据权利要求1或2所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述的混合酶液是： 按质量比,溶壁酶:崩溃酶1.5-2.5:1， 混合后， 由渗透压稳定剂溶解， 经0.22 m微孔滤膜过滤， 混合酶液中， 酶的总浓度为25-35mg/ml。 4.根据权利要求3所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述 的混合酶液是： 按质。
5、量比,溶壁酶:崩溃酶2:1， 混合后， 由渗透压稳定剂溶解， 经0.22 m微 孔滤膜过滤， 混合酶液中， 酶的总浓度为30mg/ml。 5.根据权利要求2所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述 的渗透压稳定剂是KCl水溶液。 6.根据权利要求1或2所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 包括转化步骤： 将质粒pAN7-1通过PEG/CaCl2介导， 转化至桦褐孔菌原生质体中， 得到含有 质粒pAN7-1的桦褐孔菌。 7.根据权利要求6所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述 的转化步骤具体如下： 用STCbuffer稀释桦。
6、褐孔菌原生质体至浓度为1107个/ml， 得桦褐 孔菌原生质体悬液， 每150 l桦褐孔菌原生质体悬液与10 l线性化质粒pAN7-1轻轻混匀， 随 后依次加入100 l、 300 l、 500 l、 600 l的PEGsolution， 并轻轻混匀， 冰浴20min， 室温放置 20min后加入4mlSTCbuffer， 于4， 3000rpm/min离心20min， 弃上清液， 取沉淀加入4ml液 体再生培养基， 孵育12-14h， 4000rpm/min离心10min， 留少许上清液， 使沉淀悬浮， 取150 l 沉淀涂布到含有潮霉素B抗性的再生培养基平板上， 28培养得阳性菌落， 然后。
7、提取阳性菌 落的基因组， 以潮霉素B作为筛选标记基因， 筛选阳性克隆， 得到含有质粒pAN7-1的桦褐孔 菌。 8.根据权利要求2或7所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述的STCbuffer组成为： 1.2M山梨醇、 50mMCaCl2、 10mMTris-HCl， PH7.5。 9.根据权利要求2或7所述的一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 其特征在于： 所述的再生培养基的配方为： 葡萄糖20g、 蛋白胨10g、 酵母提取物5g、 磷酸二氢钾1g、 MgSO47H2O1g， 蒸馏水1000ml， PH6.8， 琼脂18g。 权利要求书 1/1 页 2 CN 1。
8、05969671 A 2 一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及真菌生物学， 具体涉及一种桦褐孔菌原生质体的 制备方法和转化方法。 背景技术 0002 桦褐孔菌(Inonotusobliquus)是一种珍贵的药用真菌， 早在16世纪， 东欧民间就 广泛用桦褐孔菌防治多种疑难杂症， 如胃癌、 肠癌及心血管类疾病。 桦褐孔菌药用价值的主 要活性成分是三萜化合物， 具有抗氧化、 抗肿瘤和抗菌活性。 随着野生资源的日益枯竭及对 桦褐孔菌需求量的日益增加， 应用现代生物技术提高人工培养桦褐孔菌菌丝体三萜类化合 物的产量来满足人们对桦褐孔菌的需求尤为重要。。
9、 因此， 十分有必要建立桦褐孔菌的遗传 转化体系， 以便于后期对该真菌进行遗传操作改造， 提高三萜化合物及其前体的产量， 进而 提高桦褐孔菌的药用价值， 满足市场的需求。 而目前没有对桦褐孔菌转化方法的报道。 桦褐 孔菌在实验室主要以菌丝繁殖， 但孢子极难获得， 为获得遗传转化所需的单细胞材料， 制备 高质量的桦褐孔菌原生质体是以上研究的基础和关键步骤。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种制备高质量桦褐孔菌原生质体的方法和一种适合桦褐 孔菌的转化方法。 0004 本发明通过如下技术方案予以实现： 一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法， 包括制备步骤和转化步骤。 0005 (一)制备步骤。
10、： 采用溶壁酶和崩溃酶组成的混合酶液对桦褐孔菌菌丝膜进行酶 解， 得到桦褐孔菌原生质体。 具体如下： 0006 1)原生质体的制备： 无菌接种环撩起桦褐孔菌菌丝膜， 加入离心管中， 用无菌水和 渗透压稳定剂洗涤， 用无菌滤纸片吸干水分， 按每100mg桦褐孔菌菌丝膜加1-1.5ml混合酶 液的比例， 加入混合酶液， 于30-35， 90rpm， 酶解2-3h， 得酶解液； 0007 2)原生质体纯化： 酶解液用8层无菌擦镜纸过滤， 将滤液收集到离心管中， 4000rpm 离心10min， 弃去上清液， 取沉淀， 即为桦褐孔菌原生质体。 0008 优选的， 所述的混合酶液是： 按质量比,溶壁酶:。
11、崩溃酶1.5-2.5:1， 混合后， 由渗 透压稳定剂溶解， 经0.22 m微孔滤膜过滤， 混合酶液中， 酶的总浓度为25-35mg/ml。 0009 更优选的， 所述的混合酶液是： 按质量比,溶壁酶:崩溃酶2:1， 混合后， 由渗透压 稳定剂溶解， 经0.22 m微孔滤膜过滤， 混合酶液中， 酶的总浓度为30mg/ml。 0010 优选的， 所述的渗透压稳定剂是KCl水溶液。 0011 (二)转化步骤： 将质粒pAN7-1通过PEG/CaCl2介导， 转化至桦褐孔菌原生质体中， 得到含有质粒pAN7-1的桦褐孔菌。 具体如下： 0012 用STCbuffer稀释桦褐孔菌原生质体至浓度为110。
12、7个/ml， 得到桦褐孔菌原生 质体悬液， 每150 l桦褐孔菌原生质体悬液与10 l线性化质粒pAN7-1轻轻混匀， 随后依次加 说明书 1/4 页 3 CN 105969671 A 3 入100 l、 300 l、 500 l、 600 l的PEGsolution， 并轻轻混匀， 冰浴20min， 室温放置20min后 加入4mlSTCbuffer， 于4， 3000rpm/min离心20min， 弃上清液， 取沉淀加入4ml液体再生 培养基， 孵育12-14h， 4000rpm/min离心10min， 留少许上清液， 使沉淀悬浮， 取150 l沉淀涂 布到含有潮霉素B抗性的再生培养基平板。
13、上， 28培养得阳性菌落， 然后提取阳性菌落的基 因组， 以潮霉素B作为筛选标记基因， 筛选阳性克隆， 得到含有质粒pAN7-1的桦褐孔菌。 0013 优选的， 所述的STCbuffer组成为： 1.2M山梨醇、 50mMCaCl2、 10mMTris-HCl， PH 7.5。 0014 优选的， 所述的再生培养基的配方为： 葡萄糖20g、 蛋白胨10g、 酵母提取物5g、 磷酸 二氢钾1g、 MgSO47H2O1g， 蒸馏水1000ml， PH6.8， 琼脂18g。 0015 所述的质粒pAN7-1是一种大肠杆菌:真菌穿梭载体， 全长6756bp， 含有双抗性基 因-氨苄青霉素(Amp)和潮。
14、霉素(hph)抗性基因， hph基因的启动子是构巢曲霉gpdA基因的启 动子， 终止子是构巢曲霉trpC基因的终止子， 为现有技术中的已知产品。 0016 本发明的有益效果是： 采用本发明的方法制得的桦褐孔菌原生质体， 质量好， 原生 质体的释放量达5107个/mL， 再生率为7， 处于较高的水平。 附图说明 0017 图1是用溶壁酶和崩溃酶混合酶液制备的桦褐孔菌原生质体酶解液图。 0018 图2是用8层擦镜纸过滤后的原生质体图。 0019 图3是桦褐孔菌原生质体再生出的菌落图。 0020 图4是以阳性菌株的基因组为模板,扩增hph基因的PCR产物鉴定图,其中泳道1为 DL2000DNAMar。
15、ker， 泳道2、 3分别为以阳性菌落的基因组和质粒为模板扩增得到的PCR产 物。 具体实施方式 0021 下面的实施例是对本发明的进一步说明， 但并不因此而限制本发明。 0022 实施例1一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法 0023 (一)桦褐孔菌菌丝膜的制备 0024 将桦褐孔菌菌丝接种于含0.08MgSO4的PDA固体培养基上， 培养6天后， 用接种环 挑取菌落片层到含有无菌水和玻璃珠的50ml离心管中(玻璃珠和50ml离心管均已灭菌)， 涡 旋振荡， 直至成为很小的菌丝片段， 用移液枪吸取1ml菌丝片段到含0.08MgSO4的200ml PDA液体培养基中， 静置培养12天， 得到桦。
16、褐孔菌菌丝膜。 0025 (二)混合酶液的制备 0026 分别称取60mg溶壁酶和30mg崩溃酶， 加入3ml渗透压稳定剂(0.6mol/LKCl溶液)， 待酶完全溶解之后， 用0.22 m滤膜过滤， 取滤液， 用渗透压稳定剂制成浓度为30mg/ml的混 合酶液， 置于无菌间备用， 当天使用。 0027 (三)原生质体的制备 0028 取50ml空离心管， 用无菌接种环撩起制备好的桦褐孔菌菌丝膜至该离心管中， 用 无菌水和渗透压稳定剂各洗两次， 用无菌滤纸片吸干水分， 按每100mg桦褐孔菌菌丝膜加 1ml混合酶液的比例， 加入混合酶液， 于32， 90rpm， 酶解2h， 得到的酶解液， 显。
17、微镜镜检结 说明书 2/4 页 4 CN 105969671 A 4 果如图1所示， 由图1可见， 原生质体数量较多， 大小均一， 质量较高。 0029 (四)原生质体的纯化 0030 酶解液用8层无菌擦镜纸过滤， 去除菌丝， 将滤液收集到离心管中， 结果如图2所 示， 由图2可见， 并无菌丝碎片剩余， 可以排除再生的菌落是由菌丝碎片生长出的菌落而非 原生质体再生的可能性， 4000rpm离心10min， 弃去上清液， 沉淀用4预冷的渗透压稳定剂 和STCbuffer(1.2M山梨醇、 50mMCaCl2、 10mMTris-HCl， PH7.5)各洗2次， 最后用STC buffer稳定液悬。
18、原生质体， 即制得桦褐孔菌原生质体悬液， 冰浴备用。 0031 采用血球计数板对所得原生质体进行计数， 计数结果表明， 桦褐孔菌原生质体的 浓度为5107个/mL， 将制得的原生质体涂布到再生培养基上， 再生出的菌落如图3所示， 经 计算， 再生率约为7。 0032 (五)桦褐孔菌原生质体转化 0033 用STCbuffer稀释桦褐孔菌原生质体悬液至浓度为1107个/ml， 每150 l稀释后 的桦褐孔菌原生质体悬液与10 l线性化质粒pAN7-1轻轻混匀， 随后依次加入100 l、 300 l、 500 l、 600 l的PEGsolution， 并轻轻混匀， 冰浴20min， 室温放置20。
19、min后加入4mlSTC buffer， 于4， 3000rpm/min离心20min， 弃上清液， 取沉淀加入4ml液体再生培养基(葡萄糖 20g、 蛋白胨10g、 酵母提取物5g、 磷酸二氢钾1g、 MgSO47H2O1g， 蒸馏水1000ml， PH6.8， 琼 脂18g)， 孵育12h， 4000rpm/min离心10min， 留少许上清液， 使沉淀悬浮， 取150 l沉淀涂布到 含有潮霉素B抗性的再生培养基平板上， 28培养得阳性菌落， 然后提取阳性菌落的基因 组， 以潮霉素B作为筛选标记基因， 筛选阳性克隆， 得到含有质粒pAN7-1的桦褐孔菌。 0034 (六)阳性克隆的鉴定 0。
20、035 将含有质粒pAN7-1的桦褐孔菌转接于50 g/ml潮霉素B的再生培养基中， 28培养 10天， 用接种环挑取菌丝片段， 提取其基因组。 以所得基因组为模板， 以HPH-F( 5 ACGTCTGTCGAGAAGTTTC-3 )和HPH-R(5 -CACAGCCATCGGTCCAG-3 )为引物， 进行PCR扩增， 验 证质粒pAN7-1是否导入桦褐孔菌的原生质体中。 0036 其反应体系如下： 0037 0038 PCR扩增程序如下： 说明书 3/4 页 5 CN 105969671 A 5 0039 0040 PCR反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳鉴定。 结果如图4所示。 由图4可见， 。
21、以阳性转 化子的基因组为模板， 与阳性质粒所得结果一致。 0041 实施例2混合酶液对桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法的影响 0042 方法同实施例1， 区别在于， 混合酶液的配制方法如下： 0043 分别称取45mg溶壁酶和30mg崩溃酶， 加入3ml渗透压稳定剂(0.6mol/LKCl溶液)， 待酶完全溶解之后， 用0.22 m滤膜过滤， 取滤液， 用渗透压稳定剂制成浓度为25mg/ml的混 合酶液， 置于无菌间备用， 当天使用。 0044 桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法及释放量测定与实施例1相同， 经测定后， 本 实施例方法制得的桦褐孔菌原生质体的浓度为9106个/ml。 将制得的原生。
22、质体涂布到再 生培养基上， 再生率约为6.87。 0045 实施例3混合酶液对一种桦褐孔菌原生质体的制备和转化的影响 0046 方法同实施例1， 区别在于， 混合酶液的配制方法如下： 0047 分别称取75mg溶壁酶和30mg崩溃酶， 加入3ml渗透压稳定剂(0.6mol/LKCl溶液)， 待酶完全溶解之后， 用0.22 m滤膜过滤， 取滤液， 用渗透压稳定剂制成浓度为35mg/ml的混 合酶液， 置于无菌间备用， 当天使用。 0048 桦褐孔菌原生质体的制备和转化方法及释放量测定与实施例1相同， 经测定后， 本 实施例方法制得的桦褐孔菌原生质体的浓度为2.5107个/ml。 将制得的原生质体涂布到 再生培养基上， 再生率约为6.38。 说明书 4/4 页 6 CN 105969671 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 105969671 A 7 图3 图4 说明书附图 2/2 页 8 CN 105969671 A 8 。