技术领域
本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法、疾病预测方法以及多态性检测用试剂盒。
背景技术
一直以来，作为高尿酸血症的治疗靶标分子，已知作为尿酸重吸收转运子的Urate转运子(URAT1/SLC22A12)、葡萄糖转运子9(GLIT9/SLC22A12)。
近年来，明确了由也被称为BCRP(breast cancer resistance protein)的ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2)基因编码高容量性的排尿转运子。
另外，受到ABCG2基因的多态性的存在与痛风的发病风险的增加有关的启发，明确了ABCG2基因是痛风的主要致病基因(例如，参见实验医学2010年，第28卷，第8号，p.1285-1289)。
另外，还受到ABCG2基因的多态性的存在与胎盘中的蛋白质表达异常有关联(例如，参见Drug.Metab.Dispos.，2005年，第33卷，第1号，p.94-101)的启示启发，人们期待短时间、低成本并且简便地测定ABCG2基因的多态性的方法。
作为测定基因的多态性的方法，已知有使用被设计为扩增含有想要测定的碱基的部分的引物进行PCR，用能够以该特定碱基中有无突变来区分是否切断的限制性内切酶来切断，之后用电泳检测是否切断了的方法(PCR-RFLP法)(例如，参见Genet.Mol.Res.，2010年，第9卷，第1号，p.34-40)。
另外，还已知有在用PCR法扩增了含有突变的区域之后，使用荧光染 料标记的核酸探针进行熔解曲线分析，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变的方法(例如，参见日本专利文献特开2002-119291号公报)。
但是，在PCR-RFLP法中，在PCR反应之后需要提取扩增产物来进行限制性内切酶处理。因此，扩增产物有可能混入下一反应体系，由此有可能获得假阳性、假阴性的结果。另外，由于在PCR结束后用限制性内切酶进行处理，之后进行电泳，因此有时到检测为止需要的时间非常长。而且，由于操作复杂，难以自动化。
因此，期望进一步开发用于ABCG2基因多态性检测的技术。
发明内容
发明要解决的问题
本发明要解决的问题在于提供能够高灵敏度且简便地检测ABCG2基因的多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外，本发明要解决的问题在于提供使用了该检测方法的药效评价方法和疾病预测方法。此外，本发明要解决的问题还在于提供使用了该检测用探针的多态性检测用试剂盒。
用于解决问题的手段
用于解决上述问题的具体手段如下。
<1>一种ABCG2基因的多态性检测用探针，含有从包括下述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸：
(P1)寡核苷酸，其为与含有在序列编号1所示的碱基序列中的第301位～第311位碱基的碱基长为11～50的碱基序列互补的序列，该序列相对于除了与第311位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号1互补的序列具有至少80％以上的同一性，并且与第311位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P1’)寡核苷酸，其为与含有在序列编号1所示的碱基序列中的第301位～第311位碱基的碱基长为11～50的碱基序列互补的序列，该序列与除了与第311位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有与序列编号1相同的 碱基的序列在严谨条件下杂交，并且与第311位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P2)寡核苷酸，其为与含有序列编号2所示的碱基序列中的第234位～第251位碱基的碱基长为18～50的碱基序列互补的序列，该序列相对于除了与第251位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号2互补的序列具有至少80％以上的同一性，并且与第251位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P2’)寡核苷酸，其为与含有序列编号2所示的碱基序列中的第234位～第251位碱基的碱基长为18～50的碱基序列互补的序列，该序列与除了与第251位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有与序列编号2相同的碱基的序列在严谨条件下杂交，并且与第251位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P3)寡核苷酸，其为与含有序列编号3所示的碱基序列中的第152位～第161位碱基的碱基长为10～50的碱基序列互补的序列，该序列相对于除了与第152位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号3互补的序列具有至少80％以上的同一性，并且与第152位碱基对应的碱基用荧光染料标记；以及
(P3’)寡核苷酸，其为与含有序列编号3所示的碱基序列中的第152位～第161位碱基的碱基长为10～50的碱基序列互补的序列，该序列与除了与第152位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有与序列编号3相同的碱基的序列在严谨条件下杂交，并且与第152位碱基对应的碱基用荧光染料标记。
<2>根据<1>所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的被荧光染料标记的第311位碱基位于从5’末端起数第1位～第3位的任何位置，所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的被荧光染料标记的第251位碱基位于从5’末端起数第1位～第3位的任何位置，所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的被荧光染料标记的第152位碱基位于从3’末端起数第1位～第3位的任何位置。
<3>根据<1>或<2>所述的ABCG2基因的多态性检测用探针，其中， 所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的被荧光染料标记的第311位碱基位于5’末端，所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的被荧光染料标记的第251位碱基位于5’末端，所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的被荧光染料标记的第152位碱基位于3’末端。
<4>根据<1>～<3>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少或增加。
<5>根据<1>～<4>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述荧光标记寡核苷酸与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少。
<6>根据<1>～<5>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长为11～40，所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为18～40，所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为10～40。
<7>根据<1>～<6>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长为11～28，所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为20～30，所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为15～30。
<8>根据<1>～<7>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长为14～18，所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为22～26，所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长为18～22。
<9>根据<1>～<8>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针为熔解曲线分析用的探针。
<10>一种ABCG2基因的多态性检测方法，其使用<1>～<9>中任一项所述的多态性检测用探针。
<11>根据<10>所述的多态性检测方法，其使用从包括<1>～<9>中任一项所述的所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的组中选择的至少两种多态性检测用探针。
<12>根据权利要求10或11所述的多态性检测方法，包括：
(I)使<1>～<9>中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值。
(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的ABCG2基因中的多态性的存在。
<13>根据权利要求12所述的多态性检测方法，还包括在所述(I)的获得杂交体之前或者与(I)的获得杂交体的同时扩增核酸。
<14>一种药剂的药效判定方法，包括：通过<10>～<13>中任一项所述的多态性检测方法来检测ABCG2基因的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。
<15>一种疾病预测方法，包括：通过<10>～<13>中任一项所述的多态性检测方法来检测ABCG2基因的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来预测疾病的罹患风险。
<16>一种多态性检测用试剂盒，包含权利要求1至9中任一项所述的多态性检测用探针。
<17>根据<16>所述的多态性检测用试剂盒，还包含下述引物对中的至少一者：
能够扩增含有序列编号1所示的碱基序列中的、与所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物对；
能够扩增含有序列编号2所示的碱基序列中的、与所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物对；以及
能够扩增含有序列编号3所示的碱基序列中的、与所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物对。
发明效果
通过本发明，能够提供可高灵敏度且简便地检测ABCG2基因的多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外，通过本发明，能够提供使用了该检测方法的药效评价方法和疾病预测方法。此外，通过本发明还能够提供使用了该检测用探针的多态性检测用试剂盒。
附图说明
图1的(A)是示出核酸混合物的熔解曲线的示例的图，以及图1的(B)是示出微分熔解曲线的示例的图；
图2的(A)和(B)是使用本发明实施例1-1涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图3是使用本发明实施例1-2涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图4的(A)～(H)是使用本发明实施例2涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图5的(A)～(C)是使用本发明实施例3涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图6的(A)～(C)是使用本发明实施例4涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图7的(A)～(C)是使用本发明实施例4涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图8的(A)和(B)是使用本发明比较例1涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图9是使用本发明比较例1涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图10的(A)～(H)是使用本发明比较例2涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线；
图11的(A)～(C)是使用本发明比较例3涉及的多态性检测用探针而获得的熔解曲线。
具体实施方式
本发明的探针是ABCG2基因的多态性检测用探针，其含有从包括P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸。
通过本发明，能够高灵敏度且简便地检测ABCG2基因的多态性。
ABCG2基因的碱基序列相当于与GeneID：9429、GenBank登录号No.000004(版本：000004.11)相当的序列中的第89011415位碱基～第89080010位碱基的序列。本说明书中，将该第89011415位碱基～第89080010位碱基的序列作为“ABCG2基因的碱基序列”。
本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或者引物的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，在本领域技术人员的技术常识的范围内，由该互补的序列识别的序列视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。
在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。即，当加热含有双链核酸、例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，全部双链核酸DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。
在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第1～3位”时为以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。同样地，当称为“从5’末端起数的第1～3位”时为以寡核苷酸链的5’末端为第1位起数的。
在本说明书中，“步骤”一词不仅包含独立的步骤，即使在不能与其他的步骤明确区别的情况下只要达到了本步骤预期的效果，则包含在本术语之内。
另外，在本说明书中，使用“～”表示的数值范围为将“～”的前后记载 的数值分别作为最小值和最大值包含的范围。
另外，在本发明中，组成物中的各成分的量在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量的意思。
下面说明本发明。
<多态性检测用探针>
本发明的多态性检测用探针(以下，有时仅称为“探针”)包含从由包括下述P1’、P2、P2’、P3和P3’的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸(以下，有时仅称为“荧光标记寡核苷酸”)。
(P1)寡核苷酸，其为与含有序列编号1所示的碱基序列中的第301位～第311位碱基的碱基长为11～50的碱基序列互补的序列，该序列和除了与第311位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号1互补的序列具有至少80％以上的同一性，并且与第311位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P1’)寡核苷酸，其为与含有序列编号1所示的碱基序列中的第301位～第311位碱基的碱基长为11～50的碱基序列互补的序列，该序列和除了与第311位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有与序列编号1相同碱基的序列在严谨条件下杂交，并且与第311位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P2)寡核苷酸，其为与含有序列编号2所示的碱基序列中的第234位～第251位碱基的碱基长为18～50的碱基序列互补的序列，该序列相对于除了与第251位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号2互补的序列具有至少80％以上的同一性，并且与第251位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P2’)寡核苷酸，其为与含有序列编号2所示的碱基序列中的第234位～第251位碱基的碱基长为18～50的碱基序列互补的序列，该序列和除了与第251位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有与序列编号2相同碱基的序列在严谨条件下杂交，并且与第251位碱基对应的碱基用荧光染料标记；
(P3)寡核苷酸，其为与含有序列编号3所示的碱基序列中的第152位～第161位碱基的碱基长为10～50的碱基序列互补的序列，该序列相对于除了与第152位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号3互补的序列具有至少80％以上的同一性，并且与第152位碱基对应的碱基用荧光染料标记；以及
(P3’)寡核苷酸，其为与含有序列编号3所示的碱基序列中的第152位～第161位碱基的碱基长为10～50的碱基序列互补的序列，该序列和除了与第152位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有与序列编号3相同碱基的序列在严谨条件下杂交，并且与第152位碱基对应的碱基用荧光染料标记。
通过含有至少一种上述特定的荧光标记寡核苷酸，能够更高灵敏度且简便地第检测ABCG2基因的多态性。
序列编号1所示的碱基序列为ABCG2基因的碱基序列的一部分，对应于ABCG2基因的第1位～第68595位碱基中的第18597位～第19196位的601个碱基。
在ABCG基因的野生型中，与序列编号1所示的碱基序列的第301位对应的碱基为G(鸟嘌呤)，而在突变型中突变成A(腺嘌呤)。
另外，在野生型的ABCG2基因中，ABCG2转运子的氨基酸序列中的第12位的氨基酸为缬氨酸(Val)，而在突变型的ABCG2基因中，为蛋氨酸(Met)(以下称为“V12M突变”)。
另外，在所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸中，“与第311位碱基对应的碱基”是与序列编号1所示的碱基序列中的第311位碱基G(鸟嘌呤)互补的碱基C(胞嘧啶)。
在所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的互补的碱基C能够存在于从5’末端起数第1位～第3位的任何位置。另外，能够存在于5’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进一步提高。另外，能够生产性良好地获得P1荧光标记寡核苷酸。
所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸是能够检测序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的多态性的探针。该碱基的野生型为G，突变型为A。
所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长需为11～50。在碱基长为10以下或51以上的情况下，ABCG2基因多态性的检测灵敏度降低。另外，从多态性检测灵敏度的观点来说，所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长可以为11～40、11～28或14～18。
另外，通过改变所述P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将由P1或P1’荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节到期望的值。
本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸与除了第311位的碱基为鸟嘌呤之外和序列编号1所示的碱基序列互补的序列具有同源性。
具体地，本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号1所示的碱基序列互补的碱基序列具有80％以上的同一性。
另外，从检测灵敏度的观点来说，也可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。
在将本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸和下述与序列编号1互补的序列进行比较时的同一性低于80％的情况下，对含有突变型的ABCG2基因的试样核酸的检测灵敏度变低，所述与序列编号1互补的序列是除了与第311位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号1互补的序列。
本发明的所述P1’荧光标记寡核苷酸与除了第311位碱基为鸟嘌呤之外具有和序列编号1相同的碱基的序列在严谨条件下杂交。
杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。
严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM～约50mM以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl2下进行杂交的条件，但不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参考 被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择这样的条件。
以下，在表1中示出本发明的P1或P1’荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但本发明不限于这些。
在表1中，与序列编号1的第301位碱基对应的碱基用大写字母表示，并且一并示出与该序列编号1的第301位碱基对应的碱基为C、T、A或G时的寡核苷酸与各荧光标记寡核苷酸之间的杂交体的Tm值。
这里Tm值是使用Meltcalc 99 free(http://www.meltcalc.com/)在设定条件：Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件下计算的。
表1
碱基数 Tm(mt(A)) Tm(WT(G)) Δ 序列编号 agccattggtgtttccttgtgacaCtgggataaaaacttcgacattactg 50 65.9 68.1 2.2 4 cattggtgtttccttgtgacaCtgggataaaaacttcgac 40 61.8 64.8 3 5 ggtgtttccttgtgacaCtgggataaaaactt 32 56.7 60.9 4.2 6 ccttgtgacaTtggga 16 46.5 39.6 6.9 7 ccttgtgacaAtggga 16 38 41.6 3.6 8 cttgtgacaGtggg 14 22.1 24.5 2.4 9
Δ…Tm(mt(A))和Tm(WT(G))之差
在本发明中，和具有与P1或P1’荧光标记寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸杂交时的Tm值(表1中的Tm(mt(A)))、与和只有与序列编号1的第301位碱基对应的碱基为非互补的DNA杂交时的Tm值(表1中的Tm(WT(G)))之差，例如能够为1.0℃以上、2.0℃以上或3.0℃以上等。通过使所述Tm值的差为4.0℃以上，例如能够更高灵敏度地检测序列编号1的第301位碱基的突变。
序列编号2所示的碱基序列是ABCG2基因的碱基序列的一部分，对应于ABCG2基因的第1位～第68595位碱基中的第26821位～第27300位的480个碱基。
在ABCG2基因的野生型中，与序列编号2所示的碱基序列的第234位对应的碱基为C(胞嘧啶)，但在突变型中突变成T(胸腺嘧啶)。
另外，在野生型的ABCG2基因中，ABCG2转运子的氨基酸序列中的第126位的氨基酸为谷氨酰胺(Gln)，而在突变型的ABCG2基因中为终止密码子(X)(以下称为“Q126X突变”)。
另外，在所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸中，“与第251位碱基对应 的碱基”是与序列编号2所示的碱基序列中的第251位碱基G(鸟嘌呤)互补的碱基C(胞嘧啶)。
在所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸中，该被荧光标记的互补的碱基C能够存在于从5’末端起数第1位～第3位中的任何位置。另外，能够存在于5’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进一步提高。另外，能够生产性良好地获得P2或P2’荧光标记寡核苷酸。
所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸是能够检测序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的多态性的探针。该碱基的野生型为C，突变型为T。
所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长需为18～50。在所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长为17以下或51以上的情况下，多态性检测灵敏度降低。另外，从多态性检测灵敏度的观点来说，所述P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基长可以为18～40、20～30或22～26。
另外，通过改变所述P2或P2’的荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将由P2或P2’荧光标记寡核苷酸与其靶标序列形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节至期望的值。
本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸与除了第251位的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号2所示的碱基序列互补的序列具有同源性。
具体地，本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号2所示的碱基序列互补的碱基序列显示80％以上的同一性。
另外，从检测灵敏度的观点来说，也可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。
在将本发明的所述P2荧光标记寡核苷酸和下述与序列编号2互补的序列进行比较时的同一性低于80％的情况下，对含有突变型的ABCG2基因的试样核酸的检测灵敏度变低，所述与序列编号2互补的序列是除了与第251位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号2互补的序列。
本发明的所述P2’荧光标记寡核苷酸与除了与第251位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有和序列编号2相同碱基的序列在严谨条件下杂交。此外，关于进行杂交的方法以及严谨条件，使用与所述P1’荧光标记寡核苷 酸同样的方法在同样的条件下进行即可。
以下，在表2中示出本发明涉及的P2或P2’荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但本发明不限于这些。
在表2中，与序列编号2的第234位碱基对应的碱基用带下划线的大写字母表示，并且一并示出与该序列编号2的第234位碱基对应的碱基为A、G、T或C时的寡核苷酸与各荧光标记寡核苷酸之间的杂交体的Tm值。Tm值是通过与上述同样的方法计算的。另外，用不带下划线的大写字母表示的碱基表示与序列编号2的第245位的W对应的碱基。
表2
碱基数 Tm(mt(T)) Tm(WT(C)) Δ 序列编号 gaaacagaggaaacagaaaatgcaaacccactAatacttacttAtaccac 50 64.2 63.2 1 10 aacccactAatacttacttAtaccacgtaacctgaattac 40 60.4 58.4 2 11 cccactAatacttacttAtaccacgtaacctgaattac 38 59.5 57.4 2.1 12 aacccactAatacttacttAtaccacgtaacctg 34 59.1 52.9 6.2 13 cccactTatacttacttAtaccac 24 49.8 45 4.8 14 cccactTatacttacttGtaccac 24 52.3 46.8 5.5 15 tacttTtaccac 12 12 10.2 1.8 16 TatacttacttCtaccac 18 29.3 27.1 2.2 17
Δ…Tm(mt(T))和Tm(WT(C))之差
在本发明中，和具有与P2或P2’荧光标记寡核苷酸互补的碱基序列的DNA杂交时的Tm值(表2中的Tm(mt(T)))、与和只有与序列编号2中的第234位碱基对应的碱基为非互补的寡核苷酸杂交时的Tm值(表2中的Tm(WT(C)))之差，能够为1.0℃以上、2.0℃以上、3.0℃以上。通过使所述Tm值之差为4.0℃以上，例如能够更高灵敏度地检测序列编号2的第234位碱基的突变。
序列编号3所示的碱基序列是ABCG2基因的碱基序列的一部分，对应于ABCG2基因的第1位～第68595位的碱基中的第27528位～第27868位的341个碱基。
在ABCG2基因的野生型中，与序列编号3所示的碱基序列的第161位对应的碱基为C(胞嘧啶)，但在突变型中突变成A(腺嘌呤)。
另外，在野生型的ABCG2基因中，ABCG2转运子的氨基酸序列中的第141位氨基酸为谷氨酰胺(Gln)，而在突变型的ABCG2基因中为赖氨酸(Lys)(以下称为“Q141K突变”)。
另外，在所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸中，“与第152位碱基对应 的碱基”是与序列编号3所示的碱基序列中的第152位碱基G(鸟嘌呤)互补的碱基C(胞嘧啶)。
在所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸中，该荧光标记的互补碱基C可以存在于从3’末端起数第1位～第3位的任何位置。另外，能够存在于3’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进一步提高。另外，能够生产性良好地获得P3或P3’荧光标记寡核苷酸。
所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸是能够检测序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基的多态性的探针。该碱基的野生型为C，突变型为A。
所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长需为10～50。所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长可以为10～40、15～30或18～22。通过该范围的碱基长，例如多态性检测灵敏度进一步提高。
通过改变所述P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将由P3或P3’的荧光标记寡核苷酸与其靶标序列形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节至期望的值。
本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸与除了第152位的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号3所示的碱基序列互补的序列具有同源性。
具体地，本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号3所示的碱基序列互补的碱基序列显示80％以上的同一性。
另外，从检测灵敏度的观点来说，也可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。
在将本发明的所述P3荧光标记寡核苷酸和下述与序列编号3互补的序列进行比较时的同一性低于80％的情况下，对含有突变型的ABCG2基因的试样核酸的检测灵敏度变低，所述与序列编号3互补的序列是除了与第152位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外与序列编号3互补的序列。
本发明的所述P3’荧光标记寡核苷酸与除了第152位碱基对应的碱基为鸟嘌呤之外具有和序列编号3相同碱基的序列在严谨条件下杂交。此外，关于进行杂交的方法以及严谨条件，使用与所述P1’荧光标记寡核苷酸同样的方法在同样的条件下进行即可。
以下，在表3中示出本发明的P3或P3’荧光标记寡核苷酸的碱基序列的示例，但本发明不限于这些。
在表3中，与序列编号3的第161位碱基对应的碱基用大写字母表示，并且一并示出与该序列编号3的第161位对应的碱基为T、G和A、C时的寡核苷酸与各荧光标记寡核苷酸之间的杂交体的Tm值。Tm值是通过与上述同样的方法计算的。
表3
碱基数 Tm(mt(A)) Tm(WT(C)) Δ 序列编号 ttgcaagccgaagagctgctgagaactGtaagttttctctcaccgtcagag 51 69.3 71.1 1.8 18 gccgaagagctgctggagaactGtaagttttctctcaccgt 40 65.9 68.3 2.4 19 gagctgctgagaactGtaagttttctctca 30 56.1 60.1 4 20 gctgagaactTtaagttttc 20 46.6 39.6 7 21 ctAtaagttttc 12 5.1 2.6 2.5 22 ctCtaagttttc 12 0 1.2 1.2 23
Δ…Tm(mt(A))和Tm(WT(C))之差
本发明中，和具有与P3或P3’荧光标记寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸杂交时的Tm值(表3中的Tm(mt(A)))、与和只有与序列编号3中的第161位碱基对应的碱基为非互补的DNA杂交时的Tm值(表3中的Tm(WT(C)))之差，例如能够为1.0℃以上、2.0℃以上、或3.0℃以上等。通过使所述Tm值之差为4.0℃以上，例如能够以更高灵敏度检测序列编号3的第161位碱基的突变。
作为本发明的所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’荧光标记寡核苷酸，也包括所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’中的任何荧光标记寡核苷酸被插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。
该经插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述P1～P3中的任何荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。作为插入、缺失或取代的碱基的数量可以举出1个碱基或2个碱基以上，例如可以举出1个碱基至10个碱基、1个碱基至5个碱基等。
所述荧光标记寡核苷酸例如可以为与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以为与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓Q Probe(注 册商标)。其中可以举出如下寡核苷酸：该寡核苷酸被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并且该末端的C用荧光染料被标记使其靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。
除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。
作为所述荧光染料无特别限制，例如可以为荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述荧光染料的市售产品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。
所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在波长445～480nm下检测，TAMRA能够在波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520～555nm下检测。
如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。
另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。因为通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应的反应液中。
即，通过在荧光标记寡核苷酸的3′末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。另外通过在所述探针的3’末端添加前述那样的标记物质(荧光染料)，也能够得到同样的效果。
下面示出具有上述碱基序列、并且5’末端或3’末端的C用荧光染料标记了的寡核苷酸的具体例子(大写字母的碱基表示突变点，P表示磷酸基。另外，Pacific Blue、FL和TAMRA分别表示所述荧光染料)。但是， 本发明的荧光标记寡核苷酸不限于下述荧光标记寡核苷酸。
表4
名称 序列 (mer) 5PB-ABCG2 V12M-A-R1 (Pacific Blue)-ccttgtgacaTtggga-(P) 16 5FL-ABCG2 Q126X-T-R1 (FL)-cccactTatacttacttAtaccac-(P) 24 3T-ABCG2-mt-R1 gctgagaactTtaagttttc-(TAMRA) 20
所述荧光标记寡核苷酸能够用作检测ABCG2基因的多态性、尤其是检测V12M突变、Q126X突变或者Q141K突变的多态性检测用探针。
另外，ABCG2基因多态性检测用探针能够用作熔解曲线分析用的探针。
此外，本发明涉及的所述P1～P3荧光标记寡核苷酸能够按照寡核苷酸的合成方法已知的公知方法，例如特开2002-119291号公报等记载的方法来制备。
<多态性检测方法>
多态性的检测方法只要是使用所述荧光标记核苷酸来检测ABCG2基因的多态性的方法则无特别限制。作为使用所述荧光标记核苷酸的多态性检测方法的示例，以下说明利用了Tm分析的多态性检测方法。
本发明的多态性检测方法是检测ABCG2基因的多态性的方法，其特征在于包括下述步骤(I)～(IV)。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的结构和条件等不限于以下的记载。
(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体。
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动。
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值。
(IV)基于所述Tm值来检测ABCG2基因中的多态性的存在。
此外，本发明涉及的检测方法除了上述步骤(I)～(IV)之外，还可以包括下述工程(V)。
(V)基于所述多态性的存在，检测所述试样中的单链核酸中具有多态性的单链核酸的丰度比。
在本发明中，除了所述步骤(I)～(IV)或所述步骤(I)～(V)之外，还可以包括：在获得步骤(I)的杂交体之前或者与获得步骤(I)的杂交体的同时扩增核酸。
在所述(III)中测定Tm值时，例如，不仅评价杂交体的解离温度，还可以包括评价在杂交体形成体熔解时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。根据微分值的大小能够评价具有多态性的碱基序列(DNA)的丰度比。
在本发明中，所述试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。在所述核酸为双链核酸的情况下，例如能够在与所述荧光标记寡核苷酸杂交之前，通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核酸。通过将双链核酸解离成单链核酸，可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂交。
在本发明中，试样中包含的作为检测对象的核酸例如可以是生物试样中本来含有的核酸，但从能够提高检测精度的角度考虑，可以举出以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过PCR等扩增法扩增含有ABCG2基因的突变了的位点的区域而得到的扩增产物。所述扩增产物的长度无特别限制，例如可以设为50～1000mer或者80～200mer。另外，试样中的核酸例如可以是从源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。
在本发明中，本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA，例如可以为1倍以下。另外，从确保充分的检测信号的观点来说，可以将本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以下。
这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样中的核酸中的所述检测对象核 酸的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)可使所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)为10倍以下。另外，可以将所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，设为5倍以下或3倍以下。另外，其下限无特别限制，但是可以设为0.001倍以上，0.01倍以上或0.1倍以上。
本发明的多态性检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。
在本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定可以基于前述那样的原理，通过260nm的吸光度测定来进行，可以测定如下信号：所述信号是基于所述多态性检测用探针上添加的标记的信号的信号，并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体形成的状态而变动。因此，可以使用前述的荧光标记寡核苷酸来作为所述多态性检测用探针。作为所述荧光标记寡核苷酸例如可以是与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸，或者与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。
如果是前者那样的探针，在该探针和检测对象序列形成了杂交体(双链DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热探针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。
另外，如果是后者的探针，则通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示荧光信号，通过加热而探针解离时荧光信号减少(消失)。因此，通过在所述荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地进行熔解的发生以及Tm值的确定。
接着，关于本发明的多态性检测方法，举出检测基于荧光染料的信号的变化的方法的具体例来进行说明。使用所述多态性检测用探针本身即为本发明的多态性检测方法的特征，其他的步骤和条件没有任何限制。
作为含有进行核酸扩增时的模板的试样，只要是含有核酸尤其是 ABCG2基因即可，无特别限制。例如大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。
例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。
下面示出能够在本发明的多态性检测方法中使用的单链核酸的碱基序列的示例。此外，这些仅是示例而已，不限制本发明。
作为用于检测所述序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的多态性的单链核酸，可以使用从包括下面的碱基序列的组中选择的至少一种单链核酸。
表5
名称 序列 (mer) 序列编号 ABCG2-V12M-50-F-WT cagtaatgtcgaagtttttatcccaGtgtcacaaggaaacaccaatggct 50 24 ABCG2-V12M-50-F-mt cagtaatgtcgaagtttttatcccaAtgtcacaaggaaacaccaatggct 50 25 ABCG2-V12M-50-R-WT agccattggtgtttccttgtgacaCtgggataaaaacttcgacattactg 50 26 ABCG2-V12M-50-R-mt agccattggtgtttccttgtgacaTtgggataaaaacttcgacattactg 50 27
另外，作为用于检测所述序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的多态性的单链核酸，可以使用从包括以下的碱基序列的组中选择的至少一种单链核酸。
表6
名称 序列 (mer) 序列编号 ABCG2-Q126X-50-F-WT caaatgtaattcaggttacgtggtaCaagtaagtatTagtgggtttgcat 50 28 ABCG2-Q126X-50-F-mt caaatgtaattcaggttacgtggtaTaagtaagtatTagtgggtttgcat 50 29 ABCG2-Q126X-40-F-WTC ggttaCgtggtaCaagtaagtatCagtgggtttgcatttt 40 30 ABCG2-Q126X-40-F-mtC ggttaCgtggtaTaagtaagtatCagtgggtttgcatttt 40 31
另外，作为用于检测所述序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基 的多态性的单链核酸，可以使用从包括以下的碱基序列的组中选择的至少一种单链核酸。
表7
名称 序列 (mer) 序列编号 ABCG2-mt-F-40 acggtgagagaaaacttaAagttctcagcagctcttcggc 40 32 ABCG2-WT-F-40 acggtgagagaaaacttaCagttctcagcagctcttcggc 40 33
接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针。
所述多态性检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。作为所述溶剂无特别限制，例如可以举出Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。
所述多态性检测用探针的添加时机无特别限制，例如在进行后述的PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物中，也可以在扩增处理前添加。
如此在利用PCR等进行扩增处理前添加所述检测用探针的情况下，例如，如前所述，优选在所述检测用探针的3’末端添加荧光染料，或者添加磷酸基。
核酸扩增的方法例如可以是利用聚合酶的方法等。作为其示例，有PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过使用聚合酶的方法进行扩增的情况下，优选在本发明探针存在的情况下进行扩增。根据使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等，对本领域技术人员来说是容易的。由此，在核酸扩增后分析探针的Tm值即可评价多态性，因此在反应结束之后，不需要处理扩增产物。由此，不用担心所述扩增产物带来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器，容易自动化。
另外，作为使用PCR法的DNA聚合酶，可以无特别限制地使用通常所用的DNA聚合酶。例如可以为GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。
作为聚合酶的使用量可以采用通常使用的浓度，无特别限制。例如，在使用Taq聚合酶的情况下，相对于反应溶液量50μl，例如可以为0.01U～100U的浓度。由此，具有ABCG2基因多态性的检测灵敏度变高等的倾向。
另外，PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。
此外，在扩增时，例如也可以通过实时PCR来监视扩增，调查试样中包含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即，随着DNA(检测对象序列)通过PCR而扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光强度发生变动。通过对此进行监视，能够评价试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变DNA)的拷贝数和丰度比。
在本发明的多态性检测方法中，使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触，来使两者杂交。试样中的单链核酸例如可以通过将前述那样得到的PCR扩增产物解离而制备。
所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度无特别限制，只要是所述扩增产物能够解离的温度即可。例如为85～95℃。加热时间也无特别限制。加热时间例如可以为1秒～10分钟，或1秒～5分钟。
另外，解离的单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件例如为40～50℃。
杂交步骤的反应液中的各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体例，所述反应液中的DNA的浓度例如可以为0.01μM～1μM，或0.1μM～0.5μM。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于所述DNA的添加比例的范围，例如可以为0.001μM～10μM，或0.001μM～1μM。
然后，将所得的所述单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交体慢慢加热，测定随温度上升的荧光信号的变动。例如，在使用Q Probe的情况下，在其与单链DNA杂交的状态下，与解离状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如只要将荧光减少(或淬灭)的杂交体形成体慢慢加热，测定随温度上升的荧光强度的增加即可。
测定荧光强度变动时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室 温～85℃，或25～70℃。结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/秒。
接着，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧光强度计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。此外，在作为标记探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。
另外，本发明中，如前所述，对杂交体进行加热，并测定伴随温度上升的荧光信号变动(优选荧光强度的增加)，但是替代该方法，例如也可以检测杂交体形成时的信号变动。即，检测降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体时的随所述温度下降的荧光信号变动。
作为具体例，在使用Q Probe的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交体形成体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加热的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。
另一方面，在使用由于杂交体形成而信号增加的标记探针的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭)，但是在由于温度下降而形成杂交体时，荧光强度增加。因此，例如可以慢慢降低所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的增加。
在本发明的多态性检测方法中，只要能够扩增含有作为目标的碱基的区域，作为扩增的方法则无特别限制，例如可以使用既述的PCR法。
含有作为目的的碱基的区域例如可以举出所述含有序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的碱基序列或者所述含有序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的碱基序列或者所述含有序列编号3所述的碱基序列的第141位碱基的碱基序列中，碱基长分别为50～500的区域、50～300的区域、或者50～200的区域。
应用于PCR法的引物只要能够扩增能够与本发明的多态性检测用探针杂交的区域则无特别限制，本领域技术人员能够基于序列号1所示的碱基序列来适当设计。所述引物的长度和Tm值例如可以设为12mer～40mer和40℃～70℃，或者16mer～30mer和55℃～60℃。
另外，引物对的各引物的长度例如可以不相同，但是两个引物的Tm值可以设为大致相同(或者两个引物的Tm值之差为5℃以内)。
以下示出在本发明的多态性检测方法中能够用于扩增含有与本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物的示例。此外，这些仅是例示而已，并不限制本发明。
作为用于扩增所述序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的多态性的引物，可以是下述P4和P5所示的寡核苷酸中的至少一者。
(P4)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1所示的碱基序列中的第198位～第230位碱基的碱基长为33～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性。或者，作为所述P4寡核苷酸，也可以是和含有与序列编号1所示的碱基序列中的第198位～第230位碱基对应的碱基的碱基长为33～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。作为所述P4寡核苷酸，也可以是所述P4寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
(P5)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号1所示的碱基序列中的第332位～第353位碱基的碱基长为22～50的碱基序列互补的序列具有至少80％以上的同一性。或者，作为所述P5寡核苷酸，也可以是和含有与序列编号1所示的碱基序列中的第332位～第353位碱基对应的碱基的碱基长为22～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。作为所述P5寡核苷酸，也可以是所述P5寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
下面示出在本发明的多态性检测方法中能够用于扩增含有所述序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的区域的引物的示例。
表8
名称 序列 (mer) 序列编号 ABCG2-V12M-F2 gcaatctcatttatctggactatcaacttacta 33 34 ABCG2-V12M-R1 ttcaggtcattggaagctgtcg 22 35
另外，为了检测所述序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的多态性，能够将所述P4和P5所示的各寡核苷酸用作一对引物对。
作为用于检测所述序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的多态性的引物，可以是下述P6和P7所示的寡核苷酸中的至少任意一者。
(P6)寡核苷酸，其相对于含有序列编号2所示的碱基序列中的第132位～第157位碱基的碱基长为26～50的碱基序列具有80％以上的同一性。另外，作为所述P6寡核苷酸，可以是和含有与序列编号2所示的碱基序列中的第132位～第157位碱基对应的碱基的碱基长为26～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。作为所述P6寡核苷酸，也可是所述P6寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
(P7)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号2所示的碱基序列中的第268位～第295位碱基的碱基长为28～50的碱基序列互补的序列具有至少80％以上的同一性。另外，作为所述P7寡核苷酸，也可以是和含有与序列编号2所示的碱基序列中的第268位～第295位碱基对应的碱基的碱基长为28～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。作为所述P7寡核苷酸，也可以是所述P7寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
下面，示出在本发明的多态性检测方法中，能够用于扩增含有所述序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的区域的引物的示例。
表9
名称 序列 (mer) 序列编号 ABCG2-Q126X-F2 gtcttagctgcaaggaaagatccaag 26 36 ABCG2-Q126X-R1 aaagcacttacccatatagaaacagagg 28 37
另外，为了检测所述序列编号2所示的碱基序列的第234位的碱基的多态性，能够将所述P6和P7所示的各寡核苷酸用作一对引物对。
作为用于检测所述序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基的多态 性的引物，可以是下述P8或P9所示的寡核苷酸中的至少一者即可。
(P8)寡核苷酸，其相对于含有序列编号3所示的碱基序列中的第121位～第145位碱基的碱基长为25～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性。另外，作为所述P8寡核苷酸，也可以是和含有与序列编号3所示的碱基序列中的第121位～第145位碱基对应的碱基的碱基长为25～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。作为所述P8寡核苷酸，也可以是所述P8寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
(P9)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号3所示的碱基序列中的第214位～第235位碱基的碱基长为22～50的碱基序列互补的序列具有至少80％以上的同一性。作为所述P9寡核苷酸，可以是和含有与序列编号3所示的碱基序列中的第214位～第235位碱基对应的碱基的碱基长为22～50的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的寡核苷酸。作为所述P9寡核苷酸，也可以是所述P9寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
下面，示出在本发明的多态性检测方法中，能够用于扩增含有所述序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基的区域的引物的示例。
表10
名称 序列 (mer) 序列编号 ABCG2-F1 tgatgttgtgatgggcactctgacg 25 38 ABCG2-R2 aatgaccctgttaatccgttcg 22 39
另外，为了检测所述序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基的多态性，能够将所述P8和P9所示的各寡核苷酸用作一对引物对。
关于进行杂交的方法，可以按照对探针进行说明的部分中记载的方法，关于严谨条件，也可以适用与对探针进行说明的部分中记载的条件相同的条件。另外，关于同一性的范围、插入、缺失或取代，也可以适用与对探针进行说明的部分中记载的范围相同的范围。
在本发明的多态性检测方法中，也可以并用两种以上从包括所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的组中选择的荧光标记寡核苷酸来作为本发明的 多态性检测用探针。由此能够同时并且简便地检测ABCG2基因的多态性。
另外，通过并用两种以上从包括所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的组中选择的荧光标记寡核苷酸，来检测从包括V12M突变、Q126X突变以及Q141K突变的组中选择的至少两种突变，例如能够更高精度地预测源自ABCG2基因的ABCG2转运子的功能。例如，作为组合的示例，可以举出所述P1和所述P2的荧光标记寡核苷酸的组合、所述P2和所述P3荧光标记寡核苷酸的组合，可以举出所述P1和所述P3荧光标记寡核苷酸的组合。
<药效判定方法>
本发明的药效判定方法包括：通过上述的多态性检测方法来检测ABCG2基因的多态性；以及基于所述检测结果来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。
通过本发明的ABCG2基因的多态性检测方法，能够检测ABCG2基因的突变的有无和种类，尤其能够高灵敏度且简便地检测V12M突变、Q126X突变或Q141K突变。
由此基于多态性的有无、突变序列和正常序列的丰度比，能够判定对药剂的耐受性或药剂的药效。因而，本发明的药效判定方法在基于有无突变、突变序列的丰度比来确定疾病的治疗方针中有用，例如增加药剂施与量、改为其他治疗药等治疗方针的更改。
作为所述判定对象的药剂，具体可以举出痛风治疗药、高尿酸血症治疗药等，尤其可以举出痛风治疗药、高尿酸血症治疗药。
<疾病预测方法>
本发明的疾病预测方法包括：通过上述的多态性检测方法来检测ABCG2基因的多态性，以及基于所述检测结果来预测疾病的罹患风险。
通过本发明的ABCG2基因的多态性检测方法，能够检测ABCG2基因的突变的有无和种类，尤其能够高灵敏度且简便地检测V12M突变、Q126X突变或Q141K突变。
因此，通过本发明，能够基于检测到的多态性的有无，预测疾病的罹 患风险。关于ABCG2基因型的组合和疾病的发病风险等，具体可通过参考实验医学2010年，第28卷，第8号，p.1285-1289，British Journal of Clinical Pharmacology Volume 64，Issue 5，Article first published online：17MAY 2007等中记载的内容来进行预测。
另外，作为预测对象的疾病，具体可以举出痛风、高尿酸血症、卟啉病等，尤其可以举出痛风和高尿酸血症。
<多态性检测用试剂盒>
本发明的多态性检测用试剂盒包含下述探针中的至少一种：能够检测所述序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的突变的多态性检测用探针；能够检测所述序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的突变的多态性检测用探针；以及能够所述序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基的突变的多态性检测用探针。由此，本发明的多态性检测用试剂盒能够检测ABCG2基因的多态性。
另外，本发明涉及的多态性检测用试剂盒也可以包含两种以上的所述荧光标记寡核苷酸。
在包含两种以上荧光标记寡核苷酸作为所述多态性检测用探针的情况下，各个荧光标记寡核苷酸既可以以混合的状态被包含，也可以单独被包含。
两种以上的所述荧光标记寡核苷酸也可以通过发光波长互不相同的荧光染料被标记。
通过如此改变荧光物质的种类，即使在相同的反应体系中也能够进行针对各个荧光标记寡核苷酸的检测。
另外，本发明中的检测用试剂盒也可以还包含能够扩增含有作为上述检测对象的ABCG2基因多态性的序列的引物。由此，本发明的多态性检测用试剂盒能够高精度地进行ABCG2基因多态性的检测。
另外，所述探针、所述引物和其他试剂类，可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成混合物。
此外，对于多态性检测用试剂盒中可包含的探针及引物，能够直接适用前述的事项。
本发明涉及的多态性检测用试剂盒可以包含检测序列编号1所示的碱基序列的第301位碱基的多态性的试剂(301检测试剂)。作为试剂，可以举出所述P1荧光标记寡核苷酸、以及包括P4和P5所示的引物的组中的至少一者。
本发明涉及的多态性检测用试剂盒也可以包含检测序列编号2所示的碱基序列的第234位碱基的多态性的试剂(234检测试剂)。作为试剂，可以举出所述P2荧光标记寡核苷酸、以及包括P6和P7所示的引物的组中的至少一者。
本发明涉及的多态性检测用试剂盒也可以包含检测序列编号3所示的碱基序列的第161位碱基的多态性的试剂(161检测试剂)。作为试剂，可以举出所述P3荧光标记寡核苷酸、以及包括P8和P9所示的引物的组中的至少一者。
本发明涉及的多态性检测用试剂盒既可以单独使用所述301检测试剂、所述234检测试剂或所述161检测试剂中的一种，也可以并用两种以上。
另外，所述P1荧光标记寡核苷酸具体也可以由具有序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7、序列编号8或序列编号9所示的碱基序列的寡核苷酸构成。
所述P2荧光标记寡核苷酸具体也可以由具有序列编号10、序列编号11、序列编号12、序列编号13、序列编号14、序列编号15、序列编号16和序列编号17所示的碱基序列的寡核苷酸构成。
具体地，所述P3荧光标记寡核苷酸具体也可以由具有序列编号18、序列编号19、序列编号20、序列编号21、序列编号22和序列编号23表示的碱基序列的寡核苷酸构成。
本发明中的检测用试剂盒除了所述探针和所述引物之外，还可以包含进行本发明的检测方法中的核酸扩增所需的试剂类，尤其是用于使用DNA聚合酶进行扩增的引物。
另外，探针、引物和其他的试剂类，可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成混合物。
此外，“单独收容”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。
通过包含用于扩增含有多态性位点的序列(与探针杂交的区域)的引物对，例如能够更高灵敏度地检测多态性。
另外，本发明的多态性检测用试剂盒还可以包含记载了使用所述多态性检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测ABCG2基因中的多态性的使用说明书，或者是记载了检测用试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书。
实施例
下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
<实施例1>
实施例1-1：单链核酸和探针的Tm分析
使用全自动SNPs检查装置IS-5310(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)和下述表11记载的处方的检查用试剂进行了Tm分析。
表11
处方
(反应液量：50μL) 1×PCR缓冲液 dNTP 0.2mM MgCl2 1.5mM Taq聚合酶(爱科来公司制) 1.88U 探针：5PB-ABCG2 V12M-A-R1 0.2μM 单链核酸 0.2μM
单链核酸
ABCG2-V12M-50-F-WT ABCG2-V12M-50-F-mt
在Tm分析中，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高到75℃，并测定了其间荧光强度的 随时间的变化。将激发波长设为365nm～415nm，将测定波长设为445nm～480nm，分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
其结果确认了能够检测到野生型(序列编号1的第301位碱基为G)和突变型(V12M、序列编号1的第301位碱基为A)两者的峰。野生型的Tm值为49℃，突变型的Tm值为56℃。
图2中示出了通过Tm分析而获得的野生型(A)和突变型(B)的曲线图。此外，纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
实施例1-2：人类基因组和探针的Tm分析
使用人类基因组(Roche公司制)作为突变的检测对象试样，进行了PCR和Tm分析。该人类基因组通过通常方法从全血精制并使用了1μl(100cp/μl)的量。
使用全自动SNPs检查装置IS-5310(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表12记载的处方的检查用试剂，进行了PCR和Tm分析。
在PCR中，在95℃处理60秒之后，以95℃、1秒以及60℃、30秒作为一个循环，反复进行了50个循环。
另外，在Tm分析中，在PCR之后，在95℃下处理1分钟、在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高到75℃，并测定了其间荧光强度随时间的变化。此外，将激发波长设为365nm～415nm，将测定波长设为445nm～480nm，来分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
表12
处方
(反应液量：50μL) 1×PCR缓冲液 dNTP 0.2mM MgCl2 1.5mM Taq聚合酶(爱科来公司制) 1.88U ABCG2 V12M-F2 1μM
[0282] ABCG2 V12M-R1 0.5μM 5PB-ABCG2 V12M-A-R1 0.1μM 精制人类基因组 1000拷贝
结果可以确认：在使用从全血精制的人类基因组作为检测对象试样的情况下，也能够检测到野生型(序列编号1的第301位碱基为G)和突变型(V12M、序列编号1的第301位碱基为A)两者的峰。Tm值为47℃和52℃。图3中示出通过Tm分析获得的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
另外，下面示出上述记载的探针、引物和单链核酸的详细。此外，探针中的P表示3’末端被磷酸化。
表13
<实施例2>
在实施例1-1中，除了将单链核酸和探针变更为下述表14中记载的单链核酸和探针，以及将Tm分析的激发波长设为420nm～485nm、测定波长设为520nm～555nm之外，与实施例1-1同样地进行了Tm分析。
表14
下面示出上述记载的探针和单链核酸的详细。
表15
结果可以确认：能够检测到野生型(序列编号2的第234位碱基为G)1和2、以及突变型(Q126X、序列编号2的第234位碱基为C)1和2两者的峰。另外，确认了在使用了将人类基因组类型的野生型的单链核酸和突变型的单链核酸以1∶1混合的混合型1～4的情况下，也能够检测到峰。
野生型1和野生型2的Tm值均为50℃，突变型1和突变型2的Tm值均为57℃。
另外，混合型1的Tm值为50℃和56℃，混合型2的Tm值为50℃和56℃，混合型3的Tm值为48℃和56℃，混合型4的Tm值为49℃和57℃。
图4中分别示出通过Tm分析而获得的野生型1(A)、野生型2(C)、突变型1(B)、突变型2(D)、混合型1(E)、混合型2(F)、混合型3(G)和混合型4(H)的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
<实施例3>
在实施例1-1中，除了将单链核酸和探针变更为下述表16记载的单链核酸和探针，以及将Tm分析中的激发波长设为520nm～555nm、测定波长设为585nm～700nm之外，与实施例1-1同样地进行了Tm分析。
表16
下面示出上述记载的探针和单链核酸的详细。
表17
结果可以确认：能够检测到野生型(序列编号3的第161位碱基为C)以及突变型(Q141K、序列编号2的第161位碱基为A)两者的峰。而且，在使用了将人类基因组类型的野生型的单链核酸和突变型的单链核酸以1∶1混合的混合型的情况下，也能够检测到峰。
野生型的Tm值为56℃，突变型的Tm值为64℃，混合型的Tm值为55℃和63℃。
图5中示出通过Tm分析而获得的野生型(A)、突变型(B)和混合型(C)的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
<实施例4>
使用全自动SNPs检查装置IS-5310(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)和下述表18中记载的处方的检查用试剂，进行了Tm分析。
表18
处方)
(反应液量：50μl) 1×PCR缓冲液 dNTP 0.2mM MgCl2 1.5mM Taq聚合酶(爱科来公司制) 1.88U ABCG2-F1 1μM ABCG2-R2 0.5μM ABCG2-Q126X-F2 1μM ABCG2-Q126X-R1 0.5μM ABCG2-V12M-F2 1μM ABCG2-V12M-R1 0.5μM 5PB-ABCG2-V12M-A-R1 0.2μM 5FL-ABCG2Q126X-T-R1 0.1μM 3T-ABCG2-mt-R1 0.1μM
下面示出上述记载的引物和探针的详细。
表19
Tm分析条件为：在95℃下处理1分钟之后，以95℃、1秒以及60℃、30秒为一个循环，反复进行了50个循环。之后，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高至60℃，并测定了其间荧光强度随时间的变化。分别在激发波长和测定波长分别为365nm～415nm和445nm～480nm(Pacific Blue)、420nm～485nm和520nm～555nm(BODIPY FL)、520nm～555nm和585nm～700nm(TAMRA)的情况下，测定了源自测定荧光标记探针的荧光强度的变化。
作为模板分别使用了全血和精制基因组(2000拷贝/test(测试))。 此外，全血的制备方法如下所述。
将全血10μl加入70μl的稀释液1中，充分混合之后，将10μl的该混合液加入至70μl的稀释液2中。将17μl的该混合液在95℃下加热10分钟得到了4μl的经前处理的全血。将其用作每1test的模板。
表20
稀释液1 Tris-HCl(pH8.0) 10mM EDTA(pH8.0) 0.1mM SDS 0.30％
表21
稀释液2 Tris-HCl(pH8.0) 10mM EDTA(pH8.0) 0.1mM
其结果，在使用全血作为模板时以及使用精制人类基因组作为模板时，均能够确认到V12M突变、Q126X突变和Q141K突变全部的峰。
在全血的情况下，以及精制人类基因组的情况下，V12M突变的Tm值均为47℃和52℃，Q126X突变的Tm值为45℃，Q141K突变的Tm值为50℃。
图6中示出通过Tm分析而获得的全血(V12M突变)(A)、全血(Q126X突变)(B)以及全血(Q141K突变)(C)的曲线图，图7中示出精制人类基因组(V12M突变)(A)、精制人类基因组(Q126X突变)(B)以及精制人类基因组(Q141K突变)(C)的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
<比较例1>
除了将探针和单链核酸变更为以下探针和单链核酸之外，与实施例1-1同样地进行了Tm分析。
表22
探针 单链核酸 5PB-ABCG2 V12M-A-F1 ABCG2-V12M-50-R-WT
[0330] ABCG2-V12M-50-R-mt
上述记载的探针和单链核酸的详细如下述表23所述。
表23
结果确认了：能够检测到野生型(序列编号1的第301位碱基为G)、突变型(V12M、序列编号1的第301位碱基为A)两者的峰。野生型的Tm值为49℃，突变型的Tm值为57℃。
图8中示出通过Tm分析而获得的野生型(A)和突变型(B)的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
另外，除了将探针从5PB-ABCG2 V12M-A-R1变更为5PB-ABCG2V12M-A-FI之外，通过与实施例1-2同样的方法进行了人类基因组和探针的Tm分析。
其结果，在使用从全血精制的人类基因组作为检测对象试样的情况下，虽能够检测到突变型的Tm值为55℃，但不能检测到野生型的Tm值。
通过Tm分析而获得的曲线图如图9所示。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
<比较例2>
在实施例2中，除了将探针从5FL-ABCG2 Q126X-T-RI变更为3FL-ABCG2 Q126X-T-R2之外，与实施例2同样地进行了Tm分析。
下面示出上述记载的探针的详细。
表24
结果确认了：在野生型1和2、突变型2、混合型1～4中检测到峰。另一方面，在突变型1中，在野生型的Tm值附近确认了假峰，提示存在误认为混合型的可能性。
野生型1的Tm值为52℃、野生型2的Tm值为49℃、突变型1的Tm值为57℃、突变型2的Tm值均为56℃、混合型1的Tm值为51℃和57℃、混合型2的Tm值为49℃和56℃、混合型3的Tm值为51℃和56℃、混合型4的Tm值为50℃和57℃。
图10中分别示出通过Tm分析而获得的野生型1(A)、野生型2(C)、突变型1(B)、突变型2(D)、混合型1(E)、混合型2(F)、混合型3(G)和混合型4(H)的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
<比较例3>
在实施例3中，除了将探针从3T-ABCG2-mt-R1变更为5T-ABCG2-mt-R2之外，与实施例3同样地进行了Tm分析。
下面示出上述记载的探针的详细。
表25
其结果，在野生型(序列编号3的第161位碱基为C)、突变型(Q141K、序列编号2的第161位碱基为A)、混合型中均不能确认峰。
图11中示出通过Tm分析而获得的野生型(A)、突变型(B)和混合型(C)的曲线图。纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。
由上述可知，通过使用本发明的多态性检测用探针，能够高频率地检测到ABCG2基因的多态性中的V12M突变、Q126X突变和Q141K突变，能够使用一种试剂同时简便地检测多个多态性，而且能够不精制全血、直接简便地检测ABCG2基因的多态性。
日本申请特愿2011-102987(申请日2011年5月2日)公开的全部内容通过参考被并入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请以及技术规格与每个文献、专利申请以及技术规格通过参考并入的具体且分别记载的情况同等程度地通过参考被并入本说明书中。