技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用。
背景技术
肺癌是世界范围内肿瘤相关死亡的最常见的原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有的肺癌病例的80％-85％。肺腺癌(LUAD)和肺鳞状细胞癌(LUSC)是非小细胞肺癌的两种主要形式。虽然在临床治疗非小细胞肺癌中有最新进展，但非小细胞肺癌患者的生存率仍然是令人失望的。因此，更好地了解非小细胞肺癌的发病机理和分子机制对非小细胞肺癌的诊断和治疗至关重要。
最近，大量的原癌基因和抑癌基因已经被鉴定出来作为NSCLC肿瘤发生和发展的关键调控者。除了蛋白编码基因，lncRNA也变为NSCLC相关研究领域的关键分子。lncRNA的长度超过200nt，蛋白质编码的能力有限，众所周知，lncRNA在多个水平上调控基因表达，包括染色质修饰，转录和转录后加工。除此之外，已经报道出lncRNA的失调能够改变多种多样的细胞生物学过程和导致各种人类疾病，特别是癌症。证据表明，lncRNA在非小细胞肺癌的发生发展过程中发挥着重要的作用。例如，lncRNA PANDAR的低表达预示着NSCLC不良预后，并通过调控Bcl-2影响细胞凋亡。在NSCLC中，基因间的长非编码RNA 00673的上调通过LSD1的相互作用和NCALD的抑制来促进肿瘤增殖。显然，在非小细胞肺癌中lncRNAs的几种分子机制已经被详细讨论过，但lncRNAs对NSCLC的整体病理生理贡献至今仍然不明。
鉴于lncRNAs在NSCLC中的重要性，我们探究了基因间的非蛋白编码RNA961(LINC00961)，通过TCGA RNA序列数据分析和qPCR的检测，与邻近正常组织相比，LINC00961在非小细胞肺癌组织是显著减少的。我们进一步发现，NSCLC中LINC00961的下调与较大的肿瘤体积和更高的临床分期有关；低表达水平的LINC00961患者预后相对较差。值得注意的是，LINC00961受组蛋白去甲基化酶LSD1表观遗传抑制。而且，功能实验表明异位过表达LINC00961能够抑制NSCLC细胞侵袭和转移，部分通过调控β-catenin表达来实现的，但对NSCLC细胞增殖没有影响。研究表明，LINC00961是非小细胞肺癌发病机制的一个抑制调控者，并促进由lncRNA介导的诊断和治疗的发展。
发明内容
本发明的目的是提供用于诊断非小细胞肺癌(NSCLC)预后情况或作为治疗非小细胞肺癌药物靶点的非蛋白编码RNA 961(LINC00961)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，
SEQ ID NO.1：
AACCAGGACAGAGGCTGCAGCACCCAGGGAGGAACGCCGTGGTCCCTGGGACGGCCACCAGGCCAGGAGGCTGCAGCACCAGGGAATCTGTGCTCACGTCTTCCAGGACAGTGCTTCTTCTAGAAGCTGACATGGAGCTGACCACAGCTCTTGGAGGCATGGCCTGAGGCTTAGAAAATAGACAGAGATCATCTGAGATTTCAGCAGTGGGGCCACGTGGCAGCGCCCGAAGGCCTGGAGCAGGAGCGACCCAGGGACTCAGAGCAGCATCTTCTTAGGAGACGGAAGGAGAGCCGCCGGAGGAGCACGGGGCACCTGCGATCGCGAAGAGCCTCCTGTTCTGGATGGGAGCGAAGGCTCCGAGAGGACCTAAGGTTGCTCAGTGGGCCATGGAAACGGCAGTGATTGGGGTGGTGGTGGTGCTGTTCGTGGTGACTGTGGCCATCACCTGCGTCCTCTGCTGCTTCAGCTGTGACTCAAGGGCCCAGGATCCTCAGGGGGGTCCTGGCCGCAGCTTCACGGTGGCCACGTTTCGCCAGGAAGCTTCTCTCTTCACGGGGCCTGTTCGCCATGCCCAGCCAGTGCCAAGTGCCCAGGACTTCTGGACCTTCATGTGACGCCCGAGTCCCCAGGATTTGCTGTGCTGATGGGTCAGACTCACCCGCTCCTCAGCAAGCCTTCCCTGGCCTTCCCCTCCTCCCAGGGCCTTCTCCCTGTCCTTCCCCTCCAGTAACCTGTGAACTTCCCGTCTCCTCCCATTCCAGCCTTCTGTGCCCTCCAGCCTCAGGGATCCTTGTTATTGGGACAGCCCAGCTGGGGTTGACCCACAGGATGGGGCTTAGGAGAGCTCTGAGGAGTGAGTGAACAGACAGCGCCGGAGTGCACGGTGGGCCGGCTCTGCTGATCTACACCAGGAACTGAAATATCACTGGAATTTATTGTAAACGGTGTGCCTATGATGCTGGTTCTGTTGCCACCTGGGCACGCAGCACCCTCAAGTGGACATTTCTAGAAACCGCTTCTTACTTGCTCCTAATTGATTACTTTTGCACATTGCACAGAACCCAACCTCGAGGCCTGCTCCCTGCCAGTTGCCTGAAATCAGCCCTGAAATTCTGAAACCAAAGAGCTGCTTCCTGAGAACAAGTTATTTACCTTAGAATTGAAAATGTATATCCTTTTATGGGCCTTTCCAAATCTGATTAGAAAAACCACAAAAGGAAACAGAAGAGAAAATAAGAGCCACAGAAAGTACAATATGTTTTATTAACAGGAAAGCCAGAAATAAGATATTTTAAACATATTTTTAATGAGACTTTATTGCTATATTCCAACAGGTCACTCCTATTCTTAGAGAATGTGAATGACTTGTGTCACTTCGGAGTGACAGAAAAATCAGGAACTGAAAGATAATTCCAGACAAGTTAAAATGTTATGTTACATTCAAAGCTCTTGTTTTCATCACAAATAAGGGGATATTCAGTTTTTATTAACAGAAAACCCATTCTCCCATGGCCATGGAATAAATGCCATGCTATATTTAAGG
本发明还涉及识别所述的长非编码RNA的标记物在制备判断非小细胞肺癌治疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：
(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；
(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；
(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。
优选的，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，
Primer F(SEQ ID NO：2)：
5’-CTGTTCTGGATGGGAGCGAA-3’，
Primer R(SEQ ID NO：3)：
5’-ACAGTCACCACGAACAGCAC-3’。
本发明还涉及包含所述的识别所述的长非编码RNA的标记物的用于判断非小细胞肺癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。
本发明还涉及所述的识别所述的长非编码RNA的标记物或包含所述标记物的试剂或试剂盒在判断非小细胞肺癌的治疗预后情况中的应用。
本发明还涉及所述的长非编码RNA在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用；
本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选判断非小细胞肺癌预后情况的诊断试剂中的应用。
本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
技术方案
组织收集
48对NSCLC和对应的邻近的非肿瘤样本是从病人中获得，这些病人是在2011年到2012年间，在东南大学医学院附属江阴医院和南京医科大学第二附属医院进行手术。所有病例根据组织病理学评价确认为非小细胞肺癌。非小细胞肺癌患者的临床病理的特点总结在表1。这些病人手术前没有进行局部的或系统的治疗。所有收集的组织样本立即速冻在液氮里，并储存在-80℃备用。我们的研究通过了东南大学医学院附属江阴医院和南京医科大学第二附属医院的研究伦理委员会。并从所有的病人中获得书面知情同意。
表1非小细胞肺癌病人LINC00961表达与临床病理学特征之间的关联性
*P<0.05为显著差异
细胞培养
五个腺癌非小细胞肺癌细胞系(SPC-A1,A549,PC9,NCI-H1299,NCI-H1975)，一个非小细胞肺癌鳞状细胞癌细胞系(SK-MES-1)，和一个正常的人类支气管上皮细胞系(16HBE)，这些是从中国科学院生物化学和细胞生物学研究所购买(上海，中国)。NCIH1299，NCI-H1975，SK-MES-1和16HBE细胞在RPMI 1640培养基中培养；SPC-A1和PC9细胞用含有10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的链霉素的DMEM培养基在37℃5％CO2培养。
RNA提取和定量PCR分析
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa Prime Script试剂盒(TaKaRa，大连，中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。
质粒构建
LINC00961序列合成并细胞克隆到pcDNA3.1载体中。LINC00961的异位过表达是通过pcDNA-LINC00961转染获得的，以一个空的pcDNA载体为对照。qRT-PCR检测LINC00961的表达水平。
细胞转染
根据操作说明用X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染质粒载体(pcDNA3.1-LINC00961和空的pcDNA载体)。小干扰RNAs si-EZH2和si-LSD1转染到A549和PC9细胞中。A549和PC9细胞融合满了就接种到六孔板里，然后根据操作说明，用Lipofectamine 2000进行转染。转染48小时后，收集细胞，用于qRT-PCR或免疫印迹分析。
细胞增殖活性检测
MTT实验，将处理后的细胞按每孔2500个细胞接种于96孔培养板。待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。
细胞迁移和侵袭实验
24孔板中放置8μm孔径大小的Transwell小室。细胞侵袭实验，用50mg/l BD Matrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1x105。取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。细胞迁移实验，调整细胞密度至1-10x104。取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。取小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。
免疫印迹分析和抗体
细胞蛋白裂解产物通过10％SDS-PAGE分离开，转移到0.22μm NC膜，用特定的抗体孵育。放射自显影用密度测定法从而被量化。GAPDH抗体被用来作为对照。E-cadherin，N-cadherin，波形蛋白，β-catenin抗体(1:1000)从CST公司购买。
染色质免疫沉淀
A549和PC9细胞用甲醛处理并孵育十分钟形成DNA-蛋白质交联。细胞溶解产物经超声处理后形成200-300bp染色质片段。与LSD1和H3K4me2特异性的抗体或IgG免疫沉淀，IgG作为对照。沉淀过的染色质DNA可重新获得，并用qRT-PCR分析。
数据处理
实验数据皆用SPSS16.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。DFS和OS分析用Kaplan-Meier方法。生存数据还用单因素和多因素Cox比例风险模型分析。基于Cox回归分析，单因素分析中p<0.05的随后再使用多因素分析。计算双尾p值，选取a＝0.05的检验水准。
附图说明
图1.LINC00961在NSCLC组织中表达下调，并与病人预后差密切相关
1A、1B：LINC00961在NSCLC组织表达较正常组织下调；
1C：LINC00961在人的NSCLC组织(n＝48)与相对的非肿瘤组织比较的相对表达；
1D：LINC00961表达被分为两组(E,F)Kaplan-Meier无病生存和总的生存曲线根据LINC00961表达水平*P<0.05,**P<0.01。
图2.LINC00961对NSCLC细胞增殖的影响
2A：NSCLC细胞系(SPC-A1,A549,SK-MES-1,PC9,NCI-H1299,NCI-H1975)与正常的支气管上皮细胞系(16HBE)相比表达差异的情况，当与正常的支气管上皮细胞系(16HBE)相比，LINC00961在A549和PC9细胞中表达显著下调；
2B：pcDNA-LINC00961载体和空载体转染到A549和PC9细胞，用qRT-PCR分析LINC00961的表达的结果，显示在pcDNA-LINC00961载体转染的细胞中是上调的；
2C：MTT实验表明，与他们配对的细胞相比，过表达LINC00961对A549细胞的生长没有影响；
2D：MTT实验表明，与他们配对的细胞相比，过表达LINC00961对A549和PC9细胞的生长没有影响。
图3.Transwell小室实验结果证明过表达LINC00961能够抑制NSCLC细胞侵袭和迁移部分
3A、3B：过表达LINC00961能够抑制A549细胞的侵袭和迁移能力；
3C、3D：过表达LINC00961能够抑制A549细胞的侵袭和迁移能力；
3E、3F：过表达LINC00961可降低β-catenin蛋白水平的表达；
图4.QRT-PCR用来检测敲低EZH2或LSD1后LINC00961表达水平
4A、4B：A549和PC9细胞用EZH2siRNAs进行处理，QRT-PCR分析表明下调EZH2对LINC00961表达没有影响；
4C、4D：在A549和PC9细胞下调LSD1后，LINC00961的表达反而上升了。
图5.LINC00961在NSCLC细胞是LSD1的一个直接的转录靶点
LSD1介导的H3K4me2修饰在抑制LINC00961表达中发挥作用
5A、5B：LSD1能够直接结合到LINC00961启动子区并介导H3K4me2修饰；
5C、5D：LSD1表达的下调减少LSD1结合和增加H3K4me2修饰。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
一般性说明：
实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
本发明的材料：本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
实施例1 检测LINC00961在组织和细胞中的表达情况
取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×107细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。
紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入1μl溴化乙锭(EB，10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TAE缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1：4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。
Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：
实时定量PCR
NSCLC组织及癌旁组织标本，NSCLC细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。逆转录反应体系如下：
反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，
QPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：
反应条件：
结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。
LINC00961的引物如下：
Primer F(SEQ ID NO：2)：
5’-CTGTTCTGGATGGGAGCGAA-3’，
Primer R(SEQ ID NO：3)：
5’-ACAGTCACCACGAACAGCAC-3’
结果表明，LINC00961在NSCLC组织表达较正常组织下调(图1A、1B)。利用实时定量PCR检测了48对NSCLC组织/癌旁正常组织中LINC00961的表达水平。结果显示与癌旁正常组织相比，LINC00961的表达在癌组织中较正常组织表达降低(倍数>1.5，P<0.01)(图1C)。。
下调的LINC00961与NSCLC入侵性的肿瘤特点和不良预后有显著相关
为了检测LINC00961表达与临床病理特点的相关性，48个NSCLC病人根据肿瘤组织中相对LINC00961表达的中值率被分为两组：LINC00961相对低表达组和LINC00961相对高表达组(图1D)。48个NSCLC患者的临床病理特点总结在表1。显而易见的是，NSCLC中LINC00961低表达与TNM分期(p＝0.001)，淋巴结转移(p＝0.019)和肿瘤大小(p＝0.005)显著相关。然而，LINC00961的表达与别的参数如性别(p＝0.551)和年龄(p＝0.383)等(表1)不相关。为了确定LINC00961的表达与NSCLC患者预后之间的关系，无进展生存期(PFS)和总生存率(OS)曲线各自根据Kaplan-Meier分析和对数秩检验中LINC00961的表达水平而作图。(图1E和1F)。这些结果表明低表达LINC00961三年总的生存率是25％，然而高表达LINC00961是37.5％。低表达的LINC00961中位生存期是21个月，然而高表达的LINC00961是28个月(图1E，Log rank p＝0.009)。然而，低表达LINC00961的3年无进展生存期是16.7％，然而高表达LINC00961是29.1％。低表达LINC0096的中位生存期是16个月，然而高表达的LINC00961是26个月(图1F，Log rank p＝0.006).这些结果提示NSCLC中LINC00961表达下调与患者的存活时间显著相关。
实施例2 LINC00961对NSCLC细胞增殖的影响
为了研究LINC00961在NSCLC细胞中的功能角色，首先，我们利用qRT-PCR来检测LINC00961在不同的NSCLC细胞系中的表达。具体方法同前。如图2A所示，当与正常的支气管上皮细胞系(16HBE)相比，LINC00961在A549和PC9细胞中表达显著下调。为了控制NSCLC细胞中LINC00961水平，pcDNA-LINC00961载体和空载体转染到A549和PC9细胞中。转染48小时后，用QRT-PCR分析，显示LINC00961的表达在pcDNA-LINC00961载体转染的细胞中是上调的(图2B)。接下来，MTT实验检测过表达LINC00961对A549和PC9细胞生长的影响，具体步骤如下：
1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液配成单个A549/LINC00961、PC9/LINC00961(对照分别为A549/lnc-NC、PC9/lnc-NC)细胞悬液，以每孔2500个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。
2)培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及相对湿度条件下培养，培养3天。
3)呈色：培养第6h、24h、48h、72h、96h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。加入150μl DMSO(二甲基亚砜)振荡10min，使结晶物充分溶解。
4)比色：490nm波长处测定光密度值(OD)，每组3个复孔，重复三次实验。计算生存率。生存率＝实验组OD值/对照组OD值×100％。
按如上方法将A549/LINC00961、PC9/LINC00961(对照分别为A549/lnc-NC、PC9/lnc-NC)细胞株种在96孔板上，2500个细胞/孔。培养第6h、24h、48h、72h、96h后MTT染色法监测细胞活力。
MTT实验表明，与他们配对的细胞相比，过表达LINC00961对A549和PC9细胞的生长没有影响(图2C和2D)，表明LINC00961参与到其他的NSCLC生物学过程。
实施例3 过表达LINC00961抑制NSCLC细胞侵袭和迁移
除了细胞增殖，细胞侵袭和迁移在肿瘤的发展发展过程中也发挥着重要作用。因此，我们用Transwell小室实验来评价LINC00961对NSCLC细胞侵袭和迁移的影响。具体步骤如下：
1)24孔板中放置8μm孔径大小的Transwell小室。细胞侵袭实验，用50mg/l BD Matrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。
2)消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1x105。取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。
3)细胞迁移实验，调整细胞密度至1-10x104。取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。
4)取小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。
结果如图3A和3C,所示，过表达LINC00961能够抑制A549和PC9细胞的侵袭和迁移能力；与对照细胞相比，侵袭和迁移的细胞数目是显著减少的(图3B和3D)。为了探究LINC00961导致NSCLC细胞表现型的分子机制，我们检测了参与肿瘤侵袭和迁移的潜在靶点。具体步骤如下：
蛋白免疫印迹实验检测LINC00961对非小细胞肺癌细胞株A549侵袭和迁移相关蛋白β-catenin，E-cadherin，N-cadherin和vimentin表达的影响。具体方法如下：
1.提取细胞总蛋白
2.SDS-PAGE电泳
1)清洗、安装玻璃板，陶瓷片。
2)配制灌注分离胶，37℃静置25min。
3)配制灌注浓缩胶，室温静置20min。
4)加蛋白样品和分子量marker，每个时期蛋白上样量均为40μg。
5)恒压电泳(浓缩胶80V，分离胶160V)。
2.半干式转膜
1)电泳结束后，戴手套，根据目的蛋白分子量范围参照分子量marker切胶(切角标记)，切相同大小硝酸纤维素膜(切角标记)一张和滤纸2张。
2)转膜缓冲液中浸泡胶、膜和滤纸10min。
1)在转膜仪上从下至上平铺：滤纸，膜，凝胶，滤纸，赶除气泡，尤其注意膜和凝胶之间禁留气泡。擦干多余液体，0.8mA×膜面积(cm2)电流转膜1.5小时。
3.免疫印迹
1)转膜结束，检验marker是否已转至膜上(或丽春红染色)以判定转膜效果。TBST清洗膜后，5％脱脂奶粉(TBST配制)室温摇动2h。
2)加一抗bax、bcl-2单克隆抗体(1:1000)(购自cell signal公司)，4℃封闭过夜。
3)TBST漂洗3次，每次5min。
4)加二抗(1:10000)(购自cell signal公司)，室温摇动2h。
5)TBST漂洗3次，每次10min。
4.ECL检测
1)AB液混合，待膜不滴水后，平铺其上。
2)反应5min后，根据荧光强度暗室压片5～30min。
3)显影15～30s，水洗，定影1～3min。
4)图片扫描和定量分析。
5)按上述方法，A549/LINC00961(对照为A549/lnc-NC)，培养48h后提取细胞总蛋白检测侵袭和迁移相关蛋白β-catenin，E-cadherin，N-cadheri n和vimentin表达水平。
蛋白质免疫印迹分析表明，过表达LINC00961减少β-catenin蛋白水平，但对E-cadherin,N-cadherin和vimentin表达没有影响(图3E和3F)。这些结果暗示LI NC00961能够部分通过调控β-catenin的表达来抑制NSCLC细胞侵袭和迁移可作为肿瘤治疗的干预靶点。
实施例4 LSD1通过H3K4me2修饰抑制LINC00961表达.
近年来，组蛋白表观修饰被认为在抑制lncRNA转录中发挥着重要作用。例如，孙明等人的研究表明lncRNA SPRY4intronic transcript 1(SPRY4-IT1)在NSCL C细胞中通过由组蛋白甲基转移酶EZH2介导的直接转录抑制发生表观沉默。为了探究LINC00961受抑制是否是通过EZH2修饰，首先，A549和PC9细胞用EZH2siRNAs进行处理，QRT-PCR分析表明下调EZH2对LINC00961表达没有影响(图4A和4B)，表明LINC00961转录不受EZH2介导的沉默调控。而且，为了探究是否是由组蛋白去甲基化酶LSD1介导修饰导致LINC00961表达的减少，我们设计LSD1siRNAs转染NSCLC细胞。结果显示在A549和PC9细胞下调LS D1后，LINC00961的表达反而上升了(图4C和4D)。而且ChIp实验用来研究NS CLC细胞中LINC00961是否是LSD1的一个直接的转录靶点。具体步骤如下：
(一)
1.将3.33mL的4％多聚甲醛加入含10mL培养基的大皿中(终浓度为1％，注意使用高质量多聚甲醛)，摇晃均匀。
2.摇床上室温孵育10min；
3.同时准备预加入5μL cocktail的1mL PBS在离心管中，置于冰上；
4.将1.33mL的10×甘氨酸(Glycin)加入培养皿中；
5.摇床上摇晃均匀室温孵育5min；
6.将培养皿放冰上待用；
7.吸取培养基，尽量吸取，不要碰触到A549和PC9细胞；
8.加入10mL的PBS清洗细胞×2次，弃上清；
9.加入预冷好的1mL PBS(含有cocktail)；
10.将A549和PC9细胞刮到新的离心管中；
11.800×g，4℃离心5min(离心期间准备500μL含有2.5μL cocktail的细胞裂解液(Cell lysis buffer))；
12.弃上清(固定好的细胞可以在这步用液氮快速冻好，放-80℃冰箱保存数月)；13.使用准备好的500μL细胞裂解液重悬细胞；
14.冰上孵育15min，每5min轻轻涡旋细胞裂解液；
15.800×g，4℃离心5min(离心期间准备500μL含有2.5μL cocktail的核裂解液(Nucleus lysis buffer))；
16.离心后弃上清，以500μL的核裂解液重悬细胞。
(二)：
1.冰上超声，条件：超声10s后接休息50s，共重复10次，处于超声的时间为1min40s，振幅为30％；
2.12,000×g，4℃离心10min，上清装入新的1.5mL离心管中(可以取5μL跑琼脂糖凝胶看超声效果)；
3.将上清每50μL分装到离心管中(每个体系含有1×106个细胞，足够一次IP，这部分可放在-80℃保存3mo.)；
4.另取5μL上清作为Input待第四部分用。
(三)
1.每个反应管中加入预冷的含0.5μL cocktail的100μL Dilution buffer，先取20μL混匀好的磁珠加入其中，再加入1～10μg LSD1和H3K4me2特异性的抗体、rIgG或mIgG(根据目的抗体的来源)，使用混旋仪室温孵育30min；
2.加入2.3中的50μL反应液和含1.75μL cocktail的350μL Dilution buffer，4℃孵育1h～3h(或过夜)；
3.将管子放在磁力架上，弃上清
4.用以下500μL Buffer涡旋清洗磁珠-抗体，严格按照顺序：
A.加入预冷的Low salt buffer，4℃旋转5min，在磁力架上弃上清；
B.加入预冷的High salt buffer，4℃旋转5min，在磁力架上弃上清；
C.加入预冷的LiCi buffer，4℃旋转5min，在磁力架上弃上清；
D.加入TE buffer，室温旋转5min，在磁力架上弃上清；
(四)
1.将蛋白酶K和ChIP Elution buffer放室温，每个反应需要溶于100μL Elution buffer的1μL蛋白酶K)；
2.水浴锅中62℃摇晃孵育2h(消化蛋白质；如没有水浴摇床，则每15min进行一次涡旋)→变性炉上95℃孵育10min(使酶失活)；
3.将冷却的离心管放在磁力架上，将上清分离到新的离心管中。
(五)
1.将吸附柱放到收集管中，每个反应需要一个收集管；
2.每个IP和Input反应中加入500μL的Bind reagent A，混合均匀；
3.将混合好的反应液加入吸附柱中，12,000×g离心30s，弃收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；
4.加500μL Wash reagent B；12,000×g离心30s，弃收集管中的液体，吸附柱放回收集管中；
5.12,000×g离心3min，将吸附柱转移到新的离心管中；
6.将50μL Elution buffer C加到吸附柱的中心并静置2min，12,000×g离心30s，即得到所需DNA；
7.如需要更彻底洗脱，可再加50μL Elution buffer C进行洗脱。
结果显示如图5A和5B，表明LSD1能够直接结合到LINC00961启动子区并介导H3K4me2修饰，这可以由LSD1表达的下调减少LSD1结合和增加H3K4me2修饰得到支持(图5C和5D)。这些数据启示LSD1介导的H3K4me2修饰在抑制LINC00961表达中发挥一个关键的作用。