技术领域
本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行植物源性成分快速检测的方法，具体是一种大蒜成分的实时荧 光PCR检测用的引物和探针序列。
背景技术
全球经济一体化和贸易国际化的的不断扩大，对于发展中的中国，是机遇也是挑战。目前，我国已成 为世界上第五大农产品出口国，农产品进出口贸易持续增长。美国、欧盟、日本等发达国家和地区为了维 护本国的经济利益，争夺国际市场，竭力通过名目繁多的检验项目和严格甚至苛刻的技术标准，对进口农 产品设置贸易障碍，导致我国农产品出口增长遭受较大压力。就进出口的农产品而言，合格的产品，不仅 要无毒无害，满足安全卫生要求；而且要无搀杂搀假，满足品质要求。其中品质合格，又主要包含两方面的 含义：1.原料来源与标签一致。2.组分含量与标签一致。欧盟自2006年1月1日起开始实施新的食品卫 生法规，新法规突出了食品生产过程中的可追溯管理与食品的可追溯性，强调食品的身份鉴定标识与健康 标识。我国国家标准GB 7718-94《食品标签通用标准》和国家出入境检验检疫局发布的《进出口食品标签 管理办法》，也明确提出食品标签标注内容应与食品相符。为此，国家质检总局专门发文，要求严厉打击 制假制劣的违法行为，对假冒伪劣产品要依法没收并监督销毁，追查生产源头和去向，严防流入消费环节。
在食品和饮料的生产与销售中，产品无标签或标签不规范，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费 者谋取暴利的事件，国内、国外均屡屡发生。各种原料被加工成食品和饮料成品后，已无法从外观对其组 成进行鉴定。生产者受利益驱动，擅自改变产品组成，或掺入价廉的替代品，或直接减少原料用量，导致 产品的真实属性与标签不符。这种造假行为不仅仅涉及经济、营养价值，更直接影响着消费者的健康，可 能引发食源性过敏反应。
大蒜，又名蒜头、独蒜、胡蒜，为单子叶植物百合科葱属植物蒜的鳞茎。大蒜营养价值十分丰富，据 测定大蒜的新鲜鳞茎每100g中含蛋白质4.4克，脂肪0.2克，碳水化物23.6丸，钙5毫克，铁0.4 毫克，硫胺素0.24毫克，尼克酸0.9毫克，抗坏血酸3毫克。大蒜中含有17种氨基酸，其中6种为人 体必须氨基酸，尤以精氨酸含量最高，占氨基酸总量的20.4％，其次是谷氨酸，占氨基酸总量的19.75％。 大蒜中还含有元素锗(73.4mg/100g)和硒(0.3-0.8mg/100g)。它既能调味，又能助消化和促进食欲， 还是神奇的良药，具有散寒化湿、杀虫解毒、防癌、保肝、降血脂、降压等多种功效。随着人们对大蒜医 疗保健作用认识的不断提高，以大蒜为原料或添加剂开发出的新型食品和饮料在市场上日趋增多。大蒜虽 营养丰富，但同时也是一种常见的食物过敏原。因食用大蒜引发的过敏反应时有报道。鉴于此，尽快建立 可靠有效的大蒜成分检测方法，确保食物标签真实准确，对于减少食源性过敏反应发生，加强食品过敏原 标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。
食品中植物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对 象的方法相比，在食物成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受食物基质的影响较小；此外，DNA 比较稳定，不象蛋白质组成那样受地理条件、季节变化和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法 中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到 研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。
发明内容
本发明的目的是针对大蒜蒜氨酸酶基因，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种快速检测大蒜 DNA方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性，为大蒜成分检测提供有效工具，从 而确保食品标签的一致性和消费者的饮食安全。
本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物(上游引物：5′-GGAAATGCTGCGAACTATGTGA -3′和下游引物：5′-TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3′)和一条Taqman探针(序列为：5′-FAM- TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-TAMRA-3′)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95 ℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团， 3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信 号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3′→5′外切核酸酶活性就会 将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段 成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
本发明涉及的大蒜成分实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下：
(1)上游引物：5′-GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3′；
(2)下游引物：5′-TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3′；
(3)TaqMan探针：5′-TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集 团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团；
在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的体积比为：1∶1∶1；
使用上述试剂盒检测食品中大蒜成分的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)待检样品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
(2)大蒜成分的实时荧光PCR扩增
A.在反应管中加入2×PCR Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物各1-2μL，Taqman探针0.5-1μL， 100ng/μL待测样品的DNA 1-2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
94-95℃ 5min，1个循环，预变性；
94-95℃ 10-20sec；60℃ 20-40sec，45个循环，PCR扩增。
扩增时，应设立三个对照：阳性对照(取新鲜大蒜提取的基因组DNA)、阴性对照(非大蒜基因组DNA)、 空白对照(不含DNA模板，可以水代替)。
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即 阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增)，则可判定该样品检出大蒜成分。
如待测样品Ct值大于或等于45，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该样品未检出大 蒜成分。
如待测样品Ct值在41-45之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于45，且阴 性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出大蒜成分；再次扩增后的结果Ct值大于 45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品未检出大蒜成分。
大蒜素(Allicin)是百合科葱属植物大蒜的主要功效成分，其杀菌力强，抗菌谱广，且具有抗肿瘤、 降胆固醇、抗血小板聚集、预防心血管疾病、降血压等生理学功能。但是大蒜素并不是大蒜中天然存在的 活性成分，它是由大蒜中的蒜氨酸酶(Alliinase)催化底物蒜氨酸形成。蒜氨酸酶是存在于大蒜中的一种内源 酶，其化学名称是S-烷基-L-半胱氨酸亚砜酶，约占蒜中可溶性蛋白质的10％-12％，其分子质量约为10.2-10.4 万D，含2个分子质量约为5.15万D的亚基。正常情况下蒜氨酸存在于大蒜细胞的液泡中，而蒜氨酸酶 存在于细胞质中。当大蒜完整细胞受损时，二者相遇发生酶解反应产生大蒜素。鉴于蒜氨酸酶在大蒜素生 成过程中的重要作用，国内为学者对大蒜中的蒜氨酸酶进行了分离纯化和基因克隆。本发明根据大蒜蒜氨 酸酶基因的保守序列，使用Biodet软件和Primer Express 3.0软件进行了序列分析和引物、探针设计。该 保守基因序列通过对Genebank登录的大蒜、洋葱、韭菜、葱等葱属植物的蒜氨酸酶的核酸序列的比对获 得，并对设计出的引物和探针进行了在线Blast比对查询，可保证大蒜的检出。本发明采用实时荧光PCR 技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的加工食品和饮料中大蒜成分的 检测。
附图说明
图1为用实时荧光PCR技术检测某待测蒜蓉辣酱样品DNA，样品的扩增图谱；图2为阴性对照(大 豆DNA)的扩增图谱；图3为空白对照(水)的扩增图谱；图4为阳性对照(大蒜DNA)扩增图谱。
图5为用实时荧光PCR技术检测某待测豆瓣酱样品DNA，样品的扩增图谱；图6为阴性对照(大 豆DNA)的扩增图谱；图7为空白对照(水)的扩增图谱；图8为阳性对照(大蒜DNA)扩增图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
按下列配方制作大蒜成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
(1)2×PCR Master Mix
包括0.05u/μL Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/L dNTP(dATP，dCTP，dGTP， dTTP)；
其中反应缓冲液含有20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉 通X-100；
(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3′；
(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3′；
(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3′，其5′端标记 FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。
按照以下程序进行检测：
(1)待测蒜蓉辣酱样品DNA的提取
A.称取0.1g蒜蓉辣酱，加至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65℃水 浴保温10min；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min 后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μL RNA酶，37℃放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37℃溶解沉淀，5min 后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
E.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g 离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70％乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
I.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37℃放置2min 后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。
(2)待测蒜蓉辣酱DNA的实时荧光PCR扩增
A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物各 1μL，Taqman探针0.5μL，100ng/μL待测样品的DNA 1μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
94℃ 5min，1个循环，预变性；
94℃ 30sec；60℃ 30sec，45个循环，PCR扩增。
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
样品出现阳性扩增曲线，Ct值为28.4，阴性对照(大豆DNA)和空白对照(水)无扩增，阳性对照 (大蒜DNA)产生典型阳性扩增曲线，见图1、图2、图3、图4，据此可判定该样品检出大蒜成分。
实施例2
按下列配方制作大蒜成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下：
(1)2×PCR Master Mix
包括0.05u/μL Taq DNA聚合酶Polymerase，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/L dNTP(dATP， dCTP，dGTP，dTTP)；
其中反应缓冲液含有20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉 通X-100；
(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3′；
(3)下游引物：10μmol/L，序列为：5′-TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3′；
(4)Taqman探针：10μmol/L，序列为：5′-TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3′，其5′端标记 FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团。
按照以下程序进行检测：
(1)待测豆瓣酱样品DNA的提取
A.称取0.1g豆瓣酱，加至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65℃水浴 保温10min；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min 后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μL RNA酶，37℃放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37℃溶解沉淀，5min 后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
E.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g 离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70％乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
I.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37℃放置2min 后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。
(2)待测豆瓣酱DNA的实时荧光PCR扩增：
A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2×PCR Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物各 1μL，Taqman探针0.5μL，100ng/μL待测样品的DNA 1μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
94℃ 5min，1个循环，预变性；
94℃ 30sec；60℃ 30sec，45个循环，PCR扩增。
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
样品未出现阳性扩增曲线，阴性对照(玉米DNA)和空白对照(水)无扩增，阳性对照(大蒜DNA) 产生典型阳性扩增曲线，见图5、图6、图7、图8，，据此可判定该样品未检出大蒜成分。