肠道病毒71型人免疫球蛋白及其制备方法.pdf

本发明公开了一种肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中，肠道病毒71型抗体效价大于等于1∶512，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，蛋白质含量小于等于180g/L。其制造方法为：在符合国家采血标准的供血浆者中，取其中肠道病毒71型病毒中和抗体IgG效价大于等于1∶64，蛋白质含量大于等于55g/L者的血浆为肠道病毒71型人免疫球蛋白的制备原料血浆，并将所得血浆混合；再将所得的原料血浆按低温乙醇或层析法蛋白分离工艺，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置、除菌分装等工序制成人免疫球蛋白。其可用于预防手足口病及其并发症。

1、  一种肠道病毒71型人免疫球蛋白，其特征在于，其EV71病毒中和抗体效价大于等于1∶512，免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，蛋白质含量小于等于180g/L。

2、  根据权利要求1所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白仅与抗人血清产生沉淀线，与抗马、牛、猪、羊血清不产生沉淀线。

3、  根据权利要求1所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白与正常人血清比较，主要沉淀线为IgG。

4、  根据权利要求1所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的IgG单体及二聚体含量之和大于等于90％。

5、  根据权利要求1所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的剂型为液体剂型或冻干剂型。

6、  根据权利要求5所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其特征在于，所述液体剂型的规格为：2.5ml/瓶、5.0ml/瓶。

7、  权利要求1至5任意一种所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.中和试验法筛选出符合国家标准的献血者中，肠道病毒71型中和抗体效价滴度大于等于1∶8的原料血浆；
b.每批次的混合原料血浆由不少于100名供血浆者的原料血浆混合而成，以中和试验法测混合原料血浆EV71抗体中和滴度，选择大于等于1∶64的用于制备肠道病毒71型人免疫球蛋白；
c.将b步骤所得的混合原料血浆用低温乙醇蛋白分离法或层析法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置、除菌分装等工序制成人免疫球蛋白。

肠道病毒71型人免疫球蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物免疫制品，特别是涉及一种肠道病毒71型人免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术
肠病毒在病毒学上的分类是属于微小病毒科(picornaviridae)中的肠病毒群(enterovirus)，肠道病毒71简写为EV 71。EV 71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。EV71作为手足口病(HFMD)的主要病原体之一，感染性强、致病率高，其神经毒性仅次于脊髓灰质炎病毒。除引发上述手足口症状外，还可以引起疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样的麻痹性疾病、神经源性肺水肿或肺出血、心肌炎、急性呼吸道疾病等多种疾病。其中枢神经系统症状主要表现为肌震颤、共济失调、颅神经受累乃至心肺功能衰竭，患儿可能留下永久性神经系统后遗症甚至死亡。而另一类严重并发症为肺水肿或出血，表现为患儿发病后数天内突然发生心动过速、呼吸困难、紫绀和休克，出现双侧对称性非心源性肺水肿，这可能与脑干组织特定结构被破坏、植物神经功能紊乱有关。这也是最近中国内地EV71疫情中部分重症患儿的主要死因。
根据国家卫生部数据，2008年我国手足口病例达50万人，至2009年4月份，发病人数达20余万例，重症800余人，死亡60余例，5岁以下儿童占94.8％，形势严竣。目前我国手足口病疫情正处于上升阶段，今后一段时间每周报告病例数将会呈增加趋势，预计将在5月至9月份间达到高峰。中国疾病预防控制中心副主任杨维中说，从目前情况看，近期的上升势头还是比较猛，每天全国增加报告10000多例，而今后一个较长的时间里，还会更多地增加。
HFMD至今仍无有效的疫苗和特异性治疗手段，治疗轻症病例以门诊对症治疗为主。重症病例出现神经系统症状或心血管系统症状等应接收住院，重点救治。治疗原则主要是对症处理，可应用维生素B、C及抗病毒药物，但特异性差，疗效也不能充分肯定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可有效防治肠道病毒71型感染的疾病的人免疫球蛋白及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，EV71病毒中和抗体效价不小于1∶512，蛋白质含量小于等于180g/L。
本发明所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白仅与抗人血清产生沉淀线，与抗马、牛、猪、羊血清不产生沉淀线。
本发明所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白与正常人血清比较，主要沉淀线为IgG。
本发明所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白的IgG单体及二聚体含量之和大于等于90％。
本发明所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中，所述免疫球蛋白的剂型为液体剂型或冻干剂型。
本发明所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白，其中，所述剂型的规格为：2.5ml/瓶、5.0ml/瓶。
本发明所述的肠道病毒71型人免疫球蛋白的制作方法，其中，包括以下步骤：
a.用中和试验法筛选出符合围家标准的献血者中，中和效价滴度大于等于1∶8，且血浆质量应符合下列各项要求：蛋白质含量应大于等于55g/L，丙氨酸氨基转移酶应不高于25单位，乙型肝炎表面抗原应为阴性，梅毒应为阴性，HIV-1/HIV-2抗体应为阴性，HCV抗体应为阴性的血浆为肠道病毒71型人免疫球蛋白原料血浆，原料血浆应低温冰冻储存，保存期不超过2年；
b.每批次的混合原料血浆由不少于100名供血浆者的原料血浆混合而成，以中和试验法测混合原料血浆EV71抗体中和滴度，选择大于等于1∶64的用于制备肠道病毒71型人免疫球蛋白，如所得血浆EV71抗体中和滴度小于1∶64，则该批次血浆不能使用，只能另作它用；
c.将b步骤所得的混合原料血浆用低温乙醇蛋白分离法或层析法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置、除菌分装等工序制成人免疫球蛋白。
本发明的肠道病毒71型人免疫球蛋白适用于预防包括手足口病在内的肠道病毒71型感染的疾病。预防手足口病的使用量以0.2ml/kg体重计算，肌肉注射。肠道病毒71型人免疫球蛋白的规格为：2.5ml/瓶、5.0ml/瓶。
本发明的优点：本发明提供的肠道病毒71型人免疫球蛋白，EV71病毒中和抗体效价不小于1∶512，可以针对性的对EV71病毒进行预防，是控制EV71病毒暴发的有效药物，具有较大的社会效益和经济效益。
具体实施方式
实施例1
1、供血浆者的血浆筛选采集：
选择100名符合国家献血标准的供血者血浆：以中和实验法来检测血浆中的EV71中和抗体，中和效价滴度大于等于1∶8；蛋白质含量(双缩脲法)大于等于55g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法)不高于25单位；乙型肝炎表面抗原阴性，梅毒阴性，HIV-1/HIV-2抗体阴性，HCV抗体阴性等均合格的为肠道病毒71型人免疫球蛋白原料血浆，低温冰冻储存，保存期不超过2年。中和实验法的测定方法为：以人横纹肌肿瘤细胞(从军事医学科学院购得，第13代)(RD)作为指示细胞，培养液为含10％胎牛血清的DMEM，配制细胞浓度为1×10^4～6个/ml的RD细胞悬液，于6孔细胞板中每孔接RD细胞悬液3ml，置于37℃、5％二氧化碳培养箱培育2-3天后接种病毒。将肠道病毒71型人免疫球蛋白供试品及培养液在细胞板中连续2倍系列稀释，共6-10个稀释度。取肠道病毒71型以DMEM稀释至浓度(100×TCID50/0.1ml)等量加入供试品中，37℃孵育2小时，将中和病毒液接种于6孔细胞培养板中，每个稀释度接种2孔，0.1-0.2ml/孔，并设立病毒及正常细胞对照，将细胞板置于37℃吸附90分钟后，补加3ml病毒培养液，置37℃、5％二氧化碳培养箱培育7天。每次试验均须有病毒对照和细胞对照。病毒对照必须出现病变。细胞对照必须正常。结果判定：以能保护50％细胞不出现病变的供试品稀释度为中和效价。本专利文件中所有提到的中和试验法均是以上述相同的方式进行，以下简称中和试验法。
2、肠道病毒71型人免疫球蛋白的制备，该批生产的肠道病毒71型静注人免疫球蛋白的批号为：20090401
(1)将上述符合条件的100名供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为57000ml，用中和试验法，检测混合原料血浆中和抗体效价为1∶64；
(2)混合原料血浆，在2℃下离心去除冷沉淀6Kg；
(3)去除冷沉淀后的血浆为51L，将其用5.1L生理盐水稀释，再用4.0醋酸缓冲液195ml调节反应液pH值至6.5，加95％乙醇12L至反应液中，使最终乙醇浓度为20％，反应液终体积为68L，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离得沉淀10kg；
(4)将步骤(3)所得的沉淀用0℃ 0.01mol/L NaCl溶液90L搅拌溶解，最终溶液体积为100L；
(5)在步骤(4)所得的液体中加50％乙醇34L至反应液中，使最终乙醇浓度为17％，以醋酸缓冲液336ml调节反应液pH值至5.1，反应液终体积为134L，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离除去沉淀，收集上清液为125L；
(6)将步骤(5)所得的液体进行超滤透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast Flow弱阴离子交换层析，反应液温度为10℃，收集流出液105L；
(7)将步骤(6)所得的流出液进行再超滤，用2mol/L的冰醋酸652ml调节pH值为4.0，温度至10℃。透析8遍后浓缩至8L(蛋白含量：7.25％、pH：3.41)；
(8)将步骤(7)所得的浓缩液用2mol/L的冰醋酸10ml调pH至3.85，加入30％麦芽糖3.3L使最终浓度在10％，补加0.7L生理盐水使蛋白含量为5.8％；
(9)将上述步骤(8)所得原液在24～25℃下孵放21天之后用纳米膜过滤的双病毒灭活处理；21天后将肠道病毒71型人免疫球蛋白病毒处理液再返回经超滤、脱醇、脱盐、浓缩，得到肠道病毒71型人免疫球蛋白原液2800ml，以中和试验法测定EV71病毒中和抗体效价为1∶2048；
(10)加入1mol/L的碳酸氢钠溶液480ml调节原液pH值至6.8，并加入30％葡萄糖溶液420ml至原液中葡萄糖终浓度为4％，补加生理盐水40ml调节原液，以中和试验法测定，肠道病毒71型人免疫球蛋白中和抗体效价为1∶512，配制液经0.45um滤膜过滤得半成品3740ml；
(11)分装为成品(共计1056瓶)，取样25瓶交质量检定部检定，该批生产的肠道病毒71型肌注人免疫球蛋白的批号为20090401。
3、检定上述步骤所得的批号为20090401的肠道病毒71型人免疫球蛋白：
肠道病毒71型人免疫球蛋白检验报告书


结论：本品按肠道病毒71型人免疫球蛋白制造检定规程检验，结果符合规定。
实施例2、肠道病毒71型人免疫球蛋白用于预防手足口病及其并发症：
在肠道病毒71型高发区某幼儿园，随机选择6个班共120人。实验组60人，平均年龄3.5岁，其中男35人，女25人；均应用实例1制备的肠道病毒71型人免疫球蛋白肌肉注射2.5ml/人.次，观察4个月，无一例发生肠道病毒71型感染，发病率为0％。空白对照组60人，平均年龄3.8岁，其中男37人，女23人；观察4个月，21例发生肠道病毒71型感染，感染率为35％。
结论：实例1制备的肠道病毒71型人免疫球蛋白可以很好的预防手足口病及其并发症。