莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用.pdf

本发明提供一种莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的突变体及其制备方法和应用。该突变体为将莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第196位脯氨酸残基取代为丙氨酸的蛋白质。本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的方法是将含莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体。该突变体可应用在RNA合成中。本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶改造所得到的逆转录酶的突变体具有保真功能。

1、  莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，是将莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第196位脯氨酸残基取代为丙氨酸的蛋白质。

2、  根据权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体具有如SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。

3、  权利要求1或2所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码基因。

4、  根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因具有如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。

5、  一种表达权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的方法，其特征在于，将含有权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体。

6、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有权利要求1所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体为具有如SEQ IDNO：2所述的核苷酸序列的质粒pET-28a。

7、  根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为Escherichiacoli BL21。

8、  含有权利要求3或4所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体。

9、  含有权利要求3或4所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的宿主菌。

10、  权利要求1或2所述的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体在合成RNA中的应用。

莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用。
背景技术
逆转录是逆转录病毒基因组RNA复制时，病毒RNA在逆转录酶催化下合成DNA并整合到宿主细胞基因组中的过程。逆转录酶是此类病毒特有的酶类。它行使了以下功能：①依赖RNA或DNA为模板的DNA聚合作用；②链转换作用；③降解RNA-DNA杂合体中RNA的RNase H功能。因此逆转录酶常用于cDNA文库的构建。市场上莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney MurineLeukemia Virus，简称MMLV)逆转录酶的改造主要是针对酶的RNaseH部位进行改造，以达到弱化对DNA-RNA杂和体中RNA的降解的功能。经过改造后，这种酶可以逆转录出更长的单链DNA产物。由于MMLV逆转录酶在合成DNA时会掺入错误碱基，造成了病毒基因组复制过程中的高突变率，因此需要获得具有保真功能的逆转录酶。对逆转录酶进行改造需要保证的是：需要其行使功能的活性部位保持原有的活性和特性，需要弱化的活性部位在改造的同时确保不影响其它功能的实行。理论上，天然酶存在很大的可变性及存在着改进的潜力，如：一个由100个氨基酸组成的酶，拥有20100次方不同序列的可能性，显然自然界是不可能存在所有序列相应的酶。同时，以如此庞大的序列上的差异相应地必然会产生性质不同于现存的酶，也必然会存在某些方面的性质优越于天然的酶的新酶，这种序列上的可变性必然会体现在结构和功能上。在了解催化机制的基础上，人为的提高酶的催化效率是分子酶学工程的主要目标，并由此创造出高催化效率的经济实用的酶。过去20年，用定点突变的技术，工程酶已经取得很大成绩，几乎所有结构与功能关系清楚的酶都被该技术改进了。这是由于突变的定向性与取代残基的可选择性，对高级结构的干扰性不影响或影响较小，检验手段的可靠性。这种方法可以明确指出酶分子中的某个氨基酸残基是否参与底物结合和催化，把从其它方法得出的候选活性部位的可疑氨基酸残基进一步验证，得出可信的结论。
目前现有的MMLV逆转录酶晶体结构包括非催化状态下含有DNA的全长逆转录酶的晶体结构和催化状态下不含DNA的逆转录酶N端的晶体结构，因此在基于结构和机制的酶改造方面有一定的困难。HIV-1逆转录酶的结构研究较多，已有催化状态下含模板/引物、dNTP三重复合体的晶体结构。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的突变体，同时提供了该突变体的制备方法及其应用。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
将莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的自N端第196位脯氨酸残基取代为丙氨酸的蛋白质。
所述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体具有如SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。
本发明提供的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码基因具有如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。
本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体的方法是将含莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，培养阳性克隆，表达得到莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体。
上述含有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体为具有如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列的质粒pET-28a。
所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21。
本发明还保护含有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的表达载体及莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体编码基因的宿主菌。
上述莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体可应用在RNA合成中。
本发明的另一个目的是提供一种表达莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的突变体的方法。
本发明的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶改造所得到的逆转录酶的突变体具有保真功能。
附图说明
图1为单核苷酸的错掺实验结果图；
图2为单核苷酸的错配后延伸实验结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：活性状态下含有模板-引物、dNTP的MMLV逆转录酶结构模型的构建及其结构分析
构建含模板/引物及dNTP的结构模型：目前现有的MMLV晶体结构包括含有DNA的MMLV全长的晶体结构，此DNA远离催化位点，以及催化状态下不含DNA的MMLV逆转录酶N端的晶体结构，因此在基于结构的酶功能改造方面有一定的困难。HIV-1逆转录酶的结构研究较多，已有催化状态下含模板/引物、dNTP三重复合体的晶体结构。MMLV逆转录酶和HIV-1逆转录酶的结构高度同源，我们结合HIV-1逆转录酶三重复合体(包括酶、模板-引物、dNTP)的晶体结构(PDB(protein data bank)号：1rtd)和催化状态下MMLV逆转录酶N端的晶体结构(PDB(protein data bank)号：1mml)构建了活性状态下含有模板-引物、dNTP的MMLV逆转录酶结构模型。具体方法如下：将HIV-1逆转录酶的第6、9和10条β折叠以及第E和F条α螺旋的C_α原子与MMLV逆转录酶的第7、10和11条β折叠以及第H和I条α螺旋的C_α原子重叠。通过GROMOS 96进行能量最小化，使HIV-1逆转录酶的C_α原子的催化羧基与MMLV逆转录酶对应位置羧基的均方根(root mean square，简称r.m.s)偏离小于采用Swiss-PdbViwer和InsightII分子模拟软件针对引物结合位点进行分析，模拟各类突变型逆转录酶，通过AMBER 99力场分析进行迭代的最小化(iterative minimizations)直到能量变化小于0.0001kcal/mol per预测第196位点氨基酸与MMLV逆转录酶保真性相关。
实施例2：定点突变MMLV逆转录酶的196位脯氨酸(P)为丙氨酸(A)
定点突变MMLV逆转录酶(Genebank：AF033811)的196位脯氨酸(P)为丙氨酸(A)。采用融合PCR的方法进行。首先设计MMLV逆转录酶基因的上下游引物RTUp和RTDown：
RTUp：5’ATGCATATGACATGGCTGTCTGATTTT 3’
RTDown：5’ATTACTCGAGTTAGAGGAGGGTAGAGGTGTCTGGAGTC  3’
以及在突变位点设计引物196Up和196Down：
196Up 5’CCA CAG GGT TTC AAA AAC AGT GCC ACC CTG TTT  3’
196Down 5’AAA CAG GGT GGC ACT GTT TTT GAA ACC CTG TGG 3’
以RTUp和196Down作为引物，MMLV逆转录酶基因片段为模板扩增N端DNA片段。然后以RTDown和196Up为引物扩增C端DNA片段。将PCR扩增的N端和C端DNA片段分别回收后共同作为模板，同时利用RTup和RTDown外向引物扩增突变的全长MMLV逆转录酶。
实施例3：MMLV逆转录酶突变体的表达纯化
克隆：将MMLV突变型逆转录酶基因(P196A)纯化后用Nde I/Xho I酶切后克隆到pET-28a载体中，使得MMLV逆转录酶基因后加入His标签，产生pET-28a-RTP196A表达质粒。重组表达质粒经过测序鉴定正确。表达：重组表达质粒转化至在E.coli BL21。挑取单菌落37℃培养至OD600值为0.6时，用0.2mM IPTG诱导3小时，4200rpm离心35分钟，收集菌液，-80℃保存。纯化：用含10mM咪唑的缓冲液I(50mM NaH₂PO₄(pH 7.8)，5％甘油，0.3M NaCl)悬浮菌液，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上孵育30分钟裂解。裂解菌液35，000rpm离心40分钟。上清过镍柱(Ni-NTA columns)，用含20mM咪唑的缓冲液I洗柱两次。再用含250mM咪唑的缓冲液I洗脱蛋白，收集蛋白，用滤器Amicon 30 centricons将缓冲液I更换成缓冲液II(200mMNaCl，50％甘油)。用Bradford法测定蛋白浓度。
实施例4：MMLV逆转录酶突变体的忠实性鉴定
确定酶活性单位：以poly(rA)-(dT)18为模板-引物，³²P标记的dTTP为底物进行反应。反应体系总体积为6μL，包括50mM Tris HCl(pH 8.0)，100μg/mL BSA，5mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl，100nM模板-引物，100μMdTTP，10nM MMLV突变型逆转录酶和50μM ³²P标记的dTTP(0.4μCi/nmol)。反应在37℃下孵育15min，加入6μL上样缓冲液终止反应，反应物在90℃加热5分钟后进行1.4％琼脂糖凝胶电泳，用X光片曝光。
单核苷酸的错掺：以24bp的单链DNA，5′GCA CCG GCG CTC GAACAG GGA CTG 3’，为模板；以³²P标记的21bp的单链DNA，3′GGC CGC GAGCTT GTC CCT GAC 5′，为引物，进行单核苷酸的错掺实验。反应体系为2.5nM模板/引物，50mM Tris-HCl(pH 7.8)，1mM DTT，0.01％BSA，60mM KCl，5mM MgCl₂，和500μM dATP，至总体积5μL。反应在25℃进行30min后，加入5μl上样缓冲液终止反应。反应物通过12％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用X光片曝光。图1为单核苷酸的错掺的实验结果图，由图1可见，196突变酶和野生型酶掺入错误碱基的能力相似。
3’单核苷酸的错配后延伸：以24bp的单链DNA，5’GCA CCG GCG CTCGAA CAG GGA CTG 3’，为模板；以³²P标记的21bp的单链DNA，3’CGC CGCGAG CTT GTC CCT GAC 5’为引物，进行单核苷酸的错配后延伸实验。反应体系为2.5nM模板/引物，50mM Tris-HCl(pH 7.8)，1mM DTT，0.01％BSA，60mM KCl，5mM MgCl₂，和500μM dATP或dTTP，至总体积5μL。反应在25℃进行30min后，加入5μl上样缓冲液终止反应。反应物通过12％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用X光片曝光。图2显示为单核苷酸错配后延伸的实验结果图，图2中，1、2为野生型酶，3、4为193突变酶，5、6为196突变酶。以dATP为底物进行反应(1、3、5、)，或以观察dTTP为底物进行反应产物(2、4、6、)。可以观察到错配后野生型酶可以一定程度延伸；193突变酶可以继续延伸，因而可以在模板上插入突变；196突变酶几乎不能延伸，较难在模板上插入突变。由此看来196突变酶比野生型具有更高的保真性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<120>莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>672
<212>PRT
<213>Moloney Murine Leukemia Virus
<400>1
Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu
1                  5                     10                     15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala
             20                      25                     30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu
         35                     40                     45
Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr
     50                      55                       60
Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg
65                     70                      75                   80
Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr
                  85                     90                     95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val
             100                     105                    110
Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr
        115                     120                     125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln
     130               135                        140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu
145                   150                     155                   160
His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
                  165                     170                    175
Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe
              180                    185                     190
Lys Asn Ser Ala Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
        195                     200                   205
Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp
    210                     215                     220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
225                   230                    235                   240
Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
                 245                    250                     255
Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu
             260                     265                    270
Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val
         275                    280                   285
Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu
    290                   295                     300
Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met
305                   310                     315                   320
Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp
                  325                     330                   335
Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu
            340                     345                      350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
         355                    360                     365
Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys
    370                     375                    380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp
385                   390                     395                   400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile
                  405                     410                   415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu
              420                    425                    430
Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro
         435                     440                     445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu
    450                   455                     460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro
465                  470                     475                    480
Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu
                  485                    490                         495
Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln
             500                     505                    510
Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Leu
         515                    520                     525
Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr
    530                    535                    540
Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg
545                     550                     555                  560
Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys
                    565                   570                   575
Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His
             580                    585                     590
Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
          595                    600                    605
Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
    610                     615                     620
Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys
625                  630                        635                   640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala
                   645                   650                     655
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile
              660                     665                     670
<120>莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其表达方法和应用
<170>PatentIn version 3.2
<210>2
<211>2016
<212>DNA
<213>Moloney Murine Leukemia Virus
<400>2
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