一种高危型HPV荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒.pdf

本发明提供了一种高危型HPV的荧光PCR筛查方法及其引物、探针和试剂盒。该方法针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时进行。反应条件为90-95℃1-5分钟，热循环为90-95℃5-20秒，50-62℃30-60秒，共30-40个循环。该试剂盒包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：25所示序列中的至少一种或包含本发明中的引物对中的至少一对。与现有技术相比，本发明的高危型HPV的荧光PCR筛查方法及其引物、探针和试剂盒针对14种高危型HPV的筛查，其特异性和敏感性高，可操作性强，能同时检测14种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群众的需求。

1、  一种高危型HPV荧光PCR筛查方法，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时进行：
第一管采用的引物如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示序列，采用的探针如SEQ ID NO：19所示序列；
第二管采用的引物如SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：14所示序列，采用的探针如SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：23所示序列；
第三管采用的引物如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：18所示序列，采用的探针如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示序列。

2、  根据权利要求1所述的一种高危型HPV荧光PCR筛查方法，其特征在于，所述方法的反应条件为90-95℃1-5分钟，热循环为90-95℃5-20秒，50-62℃30-60秒，共30-40个循环。

3、  根据权利要求1所述的一种高危型HPV荧光PCR筛查方法，其特征在于，所述方法的反应条件为94℃2分钟，热循环为94℃10秒，55℃35秒，共40个循环。

4、  高危型HPV荧光PCR筛查引物，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18所示序列中的至少一种。

5、  高危型HPV荧光PCR筛查引物对，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，选自以下所示序列的引物对中的至少一对：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16和
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。

6、  高危型HPV荧光PCR筛查探针，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，选自SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：25所示序列中的至少一种。

7、  一种高危型HPV荧光PCR筛查试剂盒，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：25所示序列中的至少一种。

8、  一种高危型HPV荧光PCR筛查试剂盒，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，所述试剂盒包含以下所示序列的引物对中的至少一对：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16和
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。

一种高危型HPV荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种人类乳头瘤病毒(HPV)的筛查方法，特别是针对高危型HPV的荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒。
背景技术
宫颈癌是女性的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，严重威胁着女性的健康和生命。国际宫颈癌生物学研究(IBSCC)机构报道，93％以上的宫颈癌组织中可检出HPV-DNA。研究表明HPV是引起宫颈癌的主要因素，流行病学研究显示HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。大量临床资料表明，HPV感染是引发宫颈病变的重要原因。
HPV是一类特异感染人皮肤、黏膜的非均质、双股环形DNA病毒，基因约8kb长。根据其功能的活动时段可分为3个编码区，即早期区、晚期区和长控区。迄今已发现120多种HPV亚型，依致病力大小，将HPV分为低危型和高危型两种。低危型主要导致生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣、宫颈扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CIN I级)，主要亚型有HPV6、11、42、43、44等。高危型主要导致高度子宫颈上皮内瘤样变，即CIN II、III级和宫颈癌，主要亚型有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68这13种亚型。
现常用的HPV的检测方法如下：
PCR检测：包括常规PCR检测、实时荧光定量PCR检测(FQ-PCR)和PCR结合反向点杂交技术检测等。它们不仅可以对HPV感染者进行准确的早期诊断，而且能对HPV快速分型，方法简便、灵敏度高、特异性强。但荧光定量PCR检测主要针对HPV6、11、16和18亚型感染，其他亚型感染则会漏诊。
杂交捕获DNA分析：该分析是由Digene公司推出的非放射性HPV-DNA分析系统，联合应用高效液相杂交法和敏感的化学发光信号扩增系统。现为第2代杂交捕获法(HC II)，能检测13种高危型HPV(HR-HPV)(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)和5种低危型HPV(LR-HPV)(6、11、42、43和44)。灵敏度和特异性均较高，操作相对简便，条件要求低，目前已广泛应用。HC II的缺点为仅能定量不能分型。高危型HPV检测(HC II)联合细胞学检查对于CIN I患者诊断的灵敏度、特异度分别高达100％、97.2％，因此临床意义重大。但两种方法联合使用价格比较贵，不适于广大普通人群筛查。
原位杂交技术：使用放射性或非放射性DNA或RNA探针标记细胞或组织，能够定位，且假阳性率低。但对病毒复制较少的宫颈癌及浸润癌，其敏感性较低，仅为40％～50％。
组合靶基因自动检测：应用基因芯片和电传感技术对HPV进行快速分型检测，基因芯片可对HPV多种亚型同时检测，是多种亚型感染检测的好方法，但应进一步完善以提高其敏感性和特异性。
针对宫颈癌的筛查，现在还没有一种价格便宜，灵敏度高，特异性好的适于广大普通人群采用的方法。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查方法。该方法针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时进行：
第一管采用的引物如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示序列，采用的探针如SEQ ID NO：19所示序列；
第二管采用的引物如SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：14所示序列，采用的探针如SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：23所示序列；
第三管采用的引物如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：15至SEQID NO：18所示序列，采用的探针如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：25所示序列。
收集50μl样品，采用常规提取DNA的方法或试剂盒提取纯化核酸后，加入20μl灭菌水或TE等。
在八排管中加入20μl反应液及5μl纯化后的核酸并混匀后，再放置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件为90-95℃1-5分钟，热循环为90-95℃5-20秒，50-62℃30-60秒，共30-40个循环。
优选的，所述方法的反应条件为94℃2分钟，热循环为94℃10秒，55℃35秒，共40个循环。
本发明的第二个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查引物，这类引物是针对高危型HPV基因序列的，选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18所示序列中的至少一种。
本发明还提供了高危型HPV荧光PCR筛查引物对，针对高危型HPV基因序列，选自以下所示序列的引物对中的至少一对：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、SEQID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
本发明的第四个目的是提供高危型HPV荧光PCR筛查探针，该类探针是针对高危型HPV基因序列，选自SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：25所示序列中的至少一种。
本发明的第五个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查试剂盒，该试剂盒针对高危型HPV，包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：25所示序列中的至少一种。
本发明的第六个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查试剂盒，该试剂盒针对高危型HPV，包含以下所示序列的引物对中的至少一对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQID NO：5、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
上述的高危型HPV包含14种亚型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67和68型。
与现有技术相比，本发明的针对14种高危型HPV的荧光PCR筛查方法及其引物、探针和试剂盒针对14种高危型HPV的筛查，其特异性和敏感性高，可操作性强，能同时检测14种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群众的需求。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
以下实施例主要是通过将本发明的筛查高危型HPV的荧光PCR的方法与HC2高危HPV DNA检测方法进行对照实验。其中所用到的引物序列如SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：18所示，探针序列如SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：25所示。具体见序列表。
HC2(Hybrid Capture 2)高危HPV DNA检测试剂盒是Digene公司开发的针对13种高危HPV的DNA检测试剂盒，是目前获美国FDA批准唯一可在临床使用的HPV DNA检测技术，并获欧洲CE组织认证及中国药监局SDA注册。该试剂盒可对HPV高危亚型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13种进行检测，其基本原理是在分子水平采用基因杂交-化学发光-信号放大的检测技术对HPV DNA进行定量检测。
试验步骤如下：
1、样品DNA双链被释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链。
2、DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体。
3、第一抗体(特异性抗体)与DNA-RNA杂交复合物固定在微孔壁上。
4、偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA-DNA杂合体结合。
5、碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量。(检测结果解释判定标准：RLU/Cutoff≥1为阳性，＜1为阴性。)
本发明的高危HPV荧光PCR检测技术采用Taqman探针技术，可检测14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67、68)，该技术精心设计七条探针，皆采用FAM/BHQ标记方法，在不影响特异性的情况下尽可能的对上述14种亚型进行合并，具体引物探针见表1所示。
表1


对上述亚型引物探针组合与HC2 HPV试剂盒对比实验，阳性实验结果完全一致，阴性实验结果中242号标本(RLU/Cutoff为0.8)荧光PCR结果(CT：34.6434)为阳性，检出率高于HC2HPV试剂盒，具体实验结果见表2、表3，表2是HC2 HPV阳性品使用荧光PCR对比实验结果，表3是HC2 HPV阴性品使用荧光PCR法对比实验结果。
表2