金黄色葡萄球菌的多重PCRMIX快速检测试剂盒及检测方法.pdf

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒及检测方法，该试剂盒主要包括有：PCR MIX，该PCR MIX含有：2×PCR buffer，1.0～3.0mmol/L MgCl2，180～220μmol/L dNTP each，碱基序列为SEQ NO.1和SEQ NO.1的浓度为100～600nmol/L耐热脱氧核糖核酸酶nuc基因引物，碱基序列为SEQ NO.3和SEQ NO.4的浓度为100～600nmol/L血浆凝固酶clfA基因引物，碱基序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的浓度为100～600nmol/L SmaI限制性酶切片断特异序列引物，20～60U Taq酶和溴酚蓝染料。本发明提供的多重PCR检测方法和试剂盒配置简单，易于产业化生产，检测灵敏，周期短、可操作性强，适用于处理大通量的样本，可以广泛应用到食品卫生、环境监测等领域。

1.  一种金黄色葡萄球菌的多重PCR MIX快速检测试剂盒，其特征是，主要包括有：
一管PCR MIX，该PCR MIX含有：1×PCR buffer，1.0～3.0mmol/L MgCl₂，180～220μmol/L dNTP each，浓度为100～600nmol/L、碱基序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2的耐热脱氧核糖核酸酶nuc基因引物对，浓度为100～600nmol/L、碱基序列为SEQNO.3和SEQ NO.4的血浆凝固酶clfA基因引物对，浓度为100～600nmol/L、碱基序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的SmaI限制性酶切片断特异序列引物对，20～60UTaq酶，0.25％溴酚蓝50～200μl。

2.  根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的多重PCR MIX快速检测试剂盒，其特征是，所述耐热脱氧核糖核酸酶nuc基因引物、:血浆凝固酶clfA基因引物、SmaI限制性酶切片断特异序列引物的浓度分别为150～250nmol/L。

3.  根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的多重PCR MIX快速检测试剂盒，其特征是，PCR MIX还包括有阴性对照DNA和阳性对照DNA。

4.  根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒，其特征是，所述阴性对照DNA是来自菌株ATCC8032；阳性对照DNA是来自菌株ATCC6538。

5.  一种金黄色葡萄球菌的速检测方法，其特征是，使用权利要求1-3任一所述的多重PCR-MIX快速检测试剂盒，主要包括以下步骤：
提取样品DNA；
多重PCR扩增，多重PCR扩增反应体系：PCR MIX 22～23μL，DNA模板1～2μL，反应体系25μL；扩增反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min；
扩增后的产物进行检测，分析结果。

6.  根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌的速检测方法，其特征是，在提取样品DNA之前，对样品进行金黄色葡萄球菌的富集培养，培养基为7.5％NaCl肉汤，培养温度为36-38℃，培养时间为9-11个小时。

金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于食品微生物安全监测领域，涉及一种微生物快速检测方法，利用微生物的特异性基因以及多重PCR技术对微生物进行快速检测鉴定，具体地，涉及金黄色葡萄球菌多重PCR-MIX快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术
“民以食为天”，食品是人类赖以生存的物质基础，食品安全是关系人类健康和社会发展的重大问题。近年来，国内外食品安全的恶性事件不断发生，尤其以金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等引起的食源性疾病最为突出。据统计，中美两国由微生物引起的食源性疾病均占总数的50％以上，食源性疾病已成为国内外普遍关心的问题。
金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒居第一位，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则高达45％。我国每年由于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也很多。目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。
在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、AOAC、ISO和GB等标准对金黄色葡萄球菌进行检测，整个过程一般需要3-5天，且操作复杂，已不能满足微生物快速准确检测的现实需要。因此，迫切需要建立新的快速检测技术和方法。
近年来，免疫学、分子生物学等方法的应用，使金黄色葡萄球菌的快速检测有了很大发展。但是，免疫学方法如酶联免疫吸附法、免疫荧光法和乳胶凝集试验等，在操作程序、检测时间和特异性等方面尚不理想；而在分子生物学方法方面，如PCR技术则以敏感、特异、简便、快速等优点被越来越多地应用。迄今，已有文献介绍采用多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌。然而，这些方法大多侧重于耐药性相关基因和毒素基因，基因的缺失以及引物特异性不强容易造成假阳性问题。因此，建立特异性强的多重PCR检测方法显得尤为重要。
针对以上不足，本发明从分子生物学的角度出发，利用金黄色葡萄球菌特异性鉴别基因结合多重PCR技术对其进行快速检测。首先，在分析金黄色葡萄球菌特异性基因的基础上，设计筛选出细菌特异性引物，然后通过多重PCR技术研制出多重PCR体系，同时结合高效的样本前处理技术，建立特异性检测方法，并开发一管法的分子检测试剂盒，用于金黄色葡萄球菌的快速诊断和监控，可大大节省检测成本和时间，具有更广泛的应用前景。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒。
本发明所述的多重PCR-MIX快速检测试剂盒，主要包括有：PCR MIX(混合物)，该PCR MIX含有：1×PCR buffer，1.0～3.0mmol/L MgCl₂，180～220μmol/L dNTP each，一对碱基序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2的、浓度为100～600nmol/L耐热脱氧核糖核酸酶nuc基因引物，一对碱基序列为SEQ NO.3和SEQ NO.4的浓度为100～600nmol/L血浆凝固酶clfA基因引物，一对碱基序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的浓度为100～600nmol/L SmaI限制性酶切片断特异序列引物，20～60U Taq酶和0.25％溴酚蓝50～200μl。优选为包括有：1×PCR buffer，1.0～3.0mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP each，150～250nmol/L耐热脱氧核糖核酸酶nuc基因引物(SEQ NO.1和2)，150～250nmol/L：血浆凝固酶clfA基因引物(SEQ NO.3和4)，150～250nmol/L SmaI限制性酶切片断特异序列引物(SEQ NO.5和6)，25～35U Taq酶，0.25％溴酚蓝100～150μl。
本发明需要解决的另一技术问题是提供一种金黄色葡萄球菌的速检测方法。
本发明所述的检测方法，主要包括以下步骤：
提取样品DNA；
多重PCR扩增，多重PCR扩增反应体系：PCR MIX 22～23μL，DNA模板1～2μL，反应体系25μL；扩增反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min；
扩增后的产物进行检测，分析结果。
优选地，在提取样品DNA之前，对样品进行金黄色葡萄球菌的富集培养，培养基为7.5％NaCl肉汤，培养温度为36-38℃，培养时间为9-11个小时。
本发明通过筛选金黄色葡萄球菌特异性基因及设计引物，建立了金黄色葡萄球菌的多重PCR体系，有较好的特异性，快速、灵敏地实现金黄色葡萄球菌的检测，克服了传统检测方法费时、灵敏度低的缺点；并在此基础上建立了一管法的金黄色葡萄球菌多重PCR检测试剂盒，提高了检测效率；所建立的金黄色葡萄球菌多重PCR检测试剂盒，可对食品和环境中金黄色葡萄球菌进行全面、系统、准确的检测，为微生物快速检测提供了新的途径。
本发明提供的多重PCR检测方法和试剂盒配置简单，易于产业化生产，检测灵敏，周期短、可操作性强，适用于处理大通量的样本，可以广泛应用到食品卫生、环境监测等领域。
附图说明
图1是金黄色葡萄球多重PCR体系电泳结果示意图；
图2是金黄色葡萄球菌特异性验证部分电泳结果示意图；
图3是金黄色葡萄球菌基因组DNA检测灵敏度电泳结果示意图；
图4人工污染样品(奶油面包)灵敏度实验电泳结果示意图；
图5是金黄色葡萄球菌实际样品的检测电泳结果示意图。
具体实施方式
实施例1：金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒的建立
一、多重PCR反应体系的建立
1、引物设计
查阅参考文献，确定实验要研究的相关特异性基因，选择3个以上基因作为研究对象。登陆NCBI站点(www.ncbi.nlm.nih.gov)，在GeneBank数据库中获得致病菌特异基因的登录号及其核苷酸序列，进行基因信息学分析。经过分析，本研究选择了nuc、clfA、SmaI三个特异性鉴别基因。
引物采用Primer Premier 5.0软件设计分析，了解这些引物的动力学特征，包括引物的长度、Tm值、二级结构、上下游引物的错配、3′端的稳定性、GC含量及PCR产物的长度等，选择动力学性质尽可能相近的引物对。所有的引物都在GeneBank上进行Blast查询，确定其特异性。经过多方组合试验验证，筛选出特异性高的3对引物组合如表1所示。
表1.特异性引物序列及PCR扩增产物大小

2、多重PCR反应体系的建立
本研究分别进行了单重PCR的检测；而且对多重PCR各反应参数进行了优化，从而确定了最佳的反应模式(见图1)。图1中，M 100-bp DNA ladders，1 clfA基因，2 SmaI基因，3 nuc基因，4 clfA，SmaI，nuc同时扩增
一支PCR MIX(600μl)，一支阴性对照DNA(30μl)，一支阳性对照DNA(30μl)，1支无菌水(1000μl)，见表1。
表2 金黄色葡萄球菌多重PCR-MIX试剂盒组成
                                      
PCR MIX               1支，600μl
                                      
ddH2O                 1支，1000μl
Negative Control DNA  1支，30μl
(ATCC8032)
Positive Control DNA  1支，30μl
(ATCC6538)
                                      
其中一支PCR MIX的成分包括：1×PCR buffer，1.0～3.0mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTPeach(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，150～250nmol/L耐热脱氧核糖核酸酶nuc基因引物(SEQ NO.1和2)，150～250nmol/L：血浆凝固酶clfA基因引物(SEQ NO.3和4)，150～250nmol/LSmaI限制性酶切片断特异序列引物(SEQ NO.5和6)，25～35U Taq酶，0.25％溴酚蓝100～150μl。以下每个试验中SEQ NO.1和2，SEQ NO.3和4和SEQ NO.5和6的浓度可为：150nmol/L，200nmol/L，250nmol/L，本领域的技术人员可按照常识，根据实际需要，选用合适的浓度，效果一致。
二、引物特异性检测
根据所设计的3对特异性PCR引物对56株常见致病菌进行PCR检测，利用正交反应多次试验，阴性、阳性结果见表2，部分结果见图2。结果显示：10株金黄色葡萄球菌全部扩增出638bp、426bp和279bp的目的片段，其它46株非金黄色葡萄球菌无任何扩增条带；结果表明，3对引物仅对靶细菌特异。
图2中，M 100-bp DNA ladders，1 Staphylococus aureus(CMCC26003)，2 Staphylococusaureus(ATCC6538)，3 分离株(a)，4 分离株(b)，5 分离株(d)，6 分离株(i)，7 分离株(k)，8 分离株(T7)，9 分离株(R8)，10 分离株(T8远)，11 Micrococcus luteus腾黄微球菌，12 Staphylococcus saprophyticus腐生葡萄球菌；13 Staphylococcus intermedius中间葡萄球菌；14 Staphylococcus haemolyticus溶血葡萄球菌；15 Staphylococcus cohnii科氏葡萄球菌；16 Staphylococcus hyicus猪葡萄球菌；17 Staphylococcus equorum马胃葡萄球菌；18Staphylococcus hominis人葡萄球菌；19 negative control(ddH2O)。
表2 Staphylococcus aureus引物特异性供试菌株



三、引物灵敏度检测
1、基因组灵敏度
培养金黄色葡萄球菌ATCC6538，抽提基因组DNA，用核酸蛋白分析仪DU640检测DNA含量，进行10倍梯度稀释，将不同稀释度的DNA分别作PCR扩增，电泳PCR产物，分析结果(详见图3)。从图中可以看出，金黄色葡萄球菌的PCR反应灵敏度达到1.1973ng。图3中：M 100-bp ladder Marker，11197.3ng，2 119.73ng，3 11.973ng，4 1.1973ng，5 0.11973ng，6 11.973pg，7 1.1973pg，8 0.11973pg，9 ddH2O。
2、人工模拟样品的灵敏度
培养金黄色葡萄球菌ATCC 6538，将计数的金黄色葡萄球菌菌液进行梯度稀释，取1mL菌悬液人工污染奶油面包，人工污染奶油面包的起始污染菌量为1.2×10⁴～1.2×10⁰cfu/10g，实验设空白(1mL生理盐水)对照；增菌培养6h和10h，分别取菌悬液提取DNA，PCR检出情况见图4。从图4可以看出，当起始污染菌量为12cfu/10g时，37℃增菌6小时即可检出。图4中，1-5：增菌10h，1104，2103，3102，4101，5100，6-10：增菌6h，6104，7103，8102，9101，10100，11样品对照(未加菌)，12试剂对照(未加模板)，M DL2000Marker。
四、多重PCR-MIX快速检测试剂盒法与传统方法的比较
(1)一共采集43份样品(市场和超市)，样品主要有热狗、生香肠(4份)、批萨、时蔬、水果拼盘、蛋糕(4份)、乌头鱼、鲜肉肠、酿四宝、寿司、基斯、小西点、木瓜汤、猪肉(13份)；牛肉(7份)；鸡肉(2份)，禽内脏(2份)。采用传统方法和多重PCR-MIX快速检测试剂盒法两种不同的检测过程进行金黄色葡萄球菌检测，检测结果为阳性的样本用法国梅里埃细菌鉴定系统-API STAPH生化试剂条和测序进行验证。
国标法：样品—0.85％生理盐水稀释—7.5％NaCl肉汤增菌—涂布血平板—观察溶血—血浆凝固酶实验。
多重PCR-MIX快速检测试剂盒法：样品—7.5％NaCl肉汤增菌—提取DNA—多重PCR扩增—扩增产物电泳检测。
(2)结果分析
43份实际样品中，采用多重PCR-MIX快速检测试剂盒法检测，结果显示有3份样品扩增出638bp、426bp和279bp的目的片段，部分结果见图5，表明检出3份疑似样品；传统方法检出2份疑似样品。多重PCR-MIX快速检测试剂盒法检出的3份疑似样品中，有2份疑似样品(水果拼盘和蛋糕)与传统方法一致，用法国生物梅里埃细菌鉴定系统-API STAPH生化试剂条对疑似的菌落进行最终鉴定，结果表明，分离出的疑似菌落均为金黄色葡萄球菌，API试剂条的验证结果见表3和表4。另外一份疑似样品(酿四宝)由于传统方法未检出，本研究将阳性样品的PCR产物进行测序，对序列进行分析，结果证明与金黄色葡萄球菌的同源性达到98％。
①水果拼盘样品
疑似菌落经API STAPH生化试剂条验证结果表3所示，在细菌鉴定系统的读取结果鉴定是金黄色葡萄球菌(符合率97.8％)。
表3 API生化试剂条读取结果

②蛋糕样品
疑似菌落经API STAPH生化试剂条验证结果表4所示，在细菌鉴定系统的读取结果鉴定是金黄色葡萄球菌(符合率95.5％)。
表4 API生化试剂条读取结果

③酿四宝样品
将酿四宝样品的PCR扩增产物测序，序列比对结果显示与金黄色葡萄球菌的相似性为98％。
以上的试验结果表明，多重PCR-MIX快速检测试剂盒法检出的金黄色葡萄球菌比传统方法多检出一份(结果已用测序验证)，说明使用多重PCR-MIX快速检测试剂盒法对实际样品中的金黄色葡萄球菌进行检测比传统方法更灵敏。而且，相比而言，多重PCR-MIX快速检测试剂盒法的检测时间更短，整个检测过程可在12-20h内报告结果；而传统方法除了增菌时间要18h-24h外，还要对疑似菌落进一步纯化和生化鉴定，整个检测过程至少需要3-5天。
实施例2 多重PCR-MIX快速检测试剂盒检测市场猪肉样品
1、试剂盒组成
一支PCR MIX(600μl，具体成份如实施例1所述，不同的是SEQ NO.1和2，SEQ NO.3和4和SEQ NO.5和6的浓度分别为550nmol/L)，一支阴性对照DNA(30μl)，一支阳性对照DNA(30μl)，1支无菌水(1000μl)。
2、样品检测过程
(1)富集培养
采用无菌操作随机取样10g，加入到90mL含7.5％NaCl肉汤培养液中，37℃培养10小时。
(2)DNA提取
1)1.5mL样品，12000r/min 2min，弃上清；2)将沉淀悬浮于200μL丙酮，振荡混匀，冰浴5min，10000r/min，2min，弃上清；3)沉淀溶于500μL TE缓冲液，振荡混匀，10000r/min，5min，弃上清；4)将沉淀重悬于400μL裂解液，反复吹打均匀，冰浴5min，75℃温育20min；5)加入100μL 5mol/L NaCl，12000r/min，10min；6)取上清，加入100μL酚氯仿，颠倒混匀，10000r/min，10min；7)取上清，加入2倍体积预冷无水乙醇，置4℃冰箱30min，12000r/min，10min，弃上清；8)加入500μL 70％乙醇漂洗，10000r/min，1min；9)DNA沉淀溶于30μL TE缓冲液，于-20℃保存备用。
(3)多重PCR扩增
1)多重PCR扩增反应体系：PCR MIX22～23μL，DNA模板1～2μL，反应体系25μL。2)
扩增反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于20℃下保存。
(4)扩增产物电泳检测
将扩增产物于12g/L琼脂糖凝胶(Gold view染色)电泳检测及UVI凝胶成像系统分析结果，阳性对照有相应的扩增片段，阴性对照没有扩增产物，样品没有扩增产物，说明检测的猪肉中未含金黄色葡萄球菌。
实施例3 多重PCR-MIX快速检测试剂盒检测蛋糕样品
1、试剂盒组成
一支PCR MIX(600μl具体成份如实施例1所述，不同的是SEQ NO.1和2，SEQ NO.3和4和SEQ NO.5和6的浓度分别为300nmol/L)，一支阴性对照DNA(30μl)，一支阳性对照DNA(30μl)，1支无菌水(1000μl)。参加实施例1.
2、样品检测过程
(1)富集培养
采用无菌操作随机取样10g，加入到90mL含7.5％NaCl肉汤培养液中，37℃培养10小时。
(2)DNA提取
1)1.5mL样品，12000r/min 2min，弃上清；2)将沉淀悬浮于200μL丙酮，振荡混匀，冰浴5min，10000r/min，2min，弃上清；3)沉淀溶于500μL TE缓冲液，振荡混匀，10000r/min，5min，弃上清；4)将沉淀重悬于400μL裂解液，反复吹打均匀，冰浴5min，75℃温育20min；5)加入100μL 5mol/L NaCl，12000r/min，10min；6)取上清，加入100μL酚氯仿，颠倒混匀，10000r/min，10min；7)取上清，加入2倍体积预冷无水乙醇，置4℃冰箱30min，12000r/min，10min，弃上清；8)加入500μL 70％乙醇漂洗，10000r/min，1min；9)DNA沉淀溶于30μL TE缓冲液，于-20℃保存备用。
(3)多重PCR扩增
1)多重PCR扩增反应体系：PCR MIX22～23μL，DNA模板1～2μL，反应体系25μL。2)
扩增反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于20℃下保存。
(4)扩增产物电泳检测
将扩增产物于12g/L琼脂糖凝胶(Gold view染色)电泳检测及UVI凝胶成像系统分析结果，阳性对照有相应的扩增片段，阴性对照没有扩增产物，样品扩增出638bp、426bp和279bp的目的片段，说明检测的蛋糕中含有金黄色葡萄球菌。传统方法证实亦检出金黄色葡萄球菌，符合率为95.5％(前面已有生化反应结果)。
实施例4 多重PCR-MIX快速检测试剂盒检测酿四宝样品
1、试剂盒组成
一支PCR MIX(600μl，如实施例1所述)，一支阴性对照DNA(30μl)，一支阳性对照DNA(30μl)，1支无菌水(1000μl)。
2、样品检测过程
(1)富集培养
采用无菌操作随机取样10g，加入到90mL含7.5％NaCl肉汤培养液中，37℃培养10小时。
(2)DNA提取
1)1.5mL样品，12000r/min 2min，弃上清；2)将沉淀悬浮于200μL丙酮，振荡混匀，冰浴5min，10000r/min，2min，弃上清；3)沉淀溶于500μL TE缓冲液，振荡混匀，10000r/min，5min，弃上清；4)将沉淀重悬于400μL裂解液，反复吹打均匀，冰浴5min，75℃温育20min；5)加入100μL 5mol/L NaCl，12000r/min，10min；6)取上清，加入100μL酚氯仿，颠倒混匀，10000r/min，10min；7)取上清，加入2倍体积预冷无水乙醇，置4℃冰箱30min，12000r/min，10min，弃上清；8)加入500μL 70％乙醇漂洗，10000r/min，1min；9)DNA沉淀溶于30μL TE缓冲液，于-20℃保存备用。
(3)多重PCR扩增
1)多重PCR扩增反应体系：PCR MIX22～23μL，DNA模板1～2μL，反应体系25μL。2)
扩增反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火45s、72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于20℃下保存。
(4)扩增产物电泳检测
将扩增产物于12g/L琼脂糖凝胶(Gold view染色)电泳检测及UVI凝胶成像系统分析结果，阳性对照有相应的扩增片段，阴性对照没有扩增产物，样品扩增出638bp、426bp和279bp的目的片段，说明检测的酿四宝中含有金黄色葡萄球菌。传统方法未检出金黄色葡萄球菌，但用PCR产物测序方法证实是含有金黄色葡萄球菌，同源性为98％。说明多重PCR-MIX快速检测试剂盒法比传统方法更灵敏。
                            序列表
<110>广东省微生物研究所
<120>金黄色葡萄球菌多重PCR-MIX快速检测试剂盒及检测方法
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcgattgatg gtgatacggt t                        21
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agccaagcct tgacgaacta aagc                     24
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gcaaaatcca gcacaacagg aaacga                   26
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cttgatctcc agccataatt ggtgg                    25
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
tgcgaaacat ccacgacata                          20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgtttgtgct gatttcccta c                        21