重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200910088489.1

申请日:

2009.07.02

公开号:

CN101591635A

公开日:

2009.12.02

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效|||公开

IPC分类号:

C12N1/21; C12N15/76; C12P21/02; C12R1/465(2006.01)N

主分类号:

C12N1/21

申请人:

中国科学院微生物研究所

发明人:

谭华荣; 廖国建; 李金娥

地址:

100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号

优先权:

专利代理机构:

北京纪凯知识产权代理有限公司

代理人:

关 畅;任凤华

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内容摘要

本发明公开了一种重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用。该重组圈卷产色链霉菌,是将尼可霉素生物合成基因簇导入圈卷产色链霉菌得到的重组菌。其中,尼可霉素生物合成基因簇可通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌。与圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321相比,本发明的重组圈卷产色链霉菌可使尼可霉素Z的产量提高1.8倍左右,尼可霉素X的产量提高3倍左右。本发明显著地提高了尼可霉素的产量,为大规模生产尼可霉素提供了必要的技术准备。

权利要求书

1、  一种重组圈卷产色链霉菌,是将尼可霉素生物合成基因簇导入圈卷产色链霉菌得到的重组菌。

2、
  如权利要求1所述的重组圈卷产色链霉菌,其特征在于:所述尼可霉素生物合成基因簇通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌;
所述重组质粒pNIK按照以下方法制备:
1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化,回收40-50kb的DNA片段,同时用BamHI酶切科斯质粒,将回收的DNA片段连入所述科斯质粒,得到重组科斯质粒,用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库,筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒的阳性克隆A;筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒的阳性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG,sanV,sanU,sanT,sanS,sanR,sanQ,sanP,sanO,sanN,sanM,sanL,sanK,sanJ,sanH,sanI,sanF,sanA,sanB,sanC和部分sanDE;所述部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段;
所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI,sanF,sanA,sanB,sanC,sanDE,sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段;
2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP,得到重组质粒pLXP-NRPS,使用BamHI酶切pLXP-NRPS,将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中,得到pNIK;
所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株;
所述pLXP按照如下方法构建:用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒,回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9;然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9,回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript IIKS(-)连接,得到重组质粒pLXP10;再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10,将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。

3、
  如权利要求2所述的重组圈卷产色链霉菌,其特征在于:所述重组圈卷产色链霉菌为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087。

4、
  权利要求1-3中任一所述的重组圈卷产色链霉菌的构建方法,是将尼可霉素生物合成基因簇通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌得到重组圈卷产色链霉菌;
1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化,回收40-50kb的DNA片段,同时用BamHI酶切科斯质粒,将回收的DNA片段连入所述科斯质粒,得到重组科斯质粒,用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库,筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒的阳性克隆A;筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒的阳性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG,sanV,sanU,sanT,sanS,sanR,sanQ,sanP,sanO,sanN,sanM,sanL,sanK,sanJ,sanH,sanI,sanF,sanA,sanB,sanC和部分sanDE;所述部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段;
所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI,sanF,sanA,sanB,sanC,sanDE,sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段;
2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP,得到重组质粒pLXP-NRPS,使用BamHI酶切pLXP-NRPS,将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中,得到pNIK;
所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株;
所述pLXP按照如下方法构建:用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒,回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9;然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9,回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)连接,得到重组质粒pLXP10;再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10,将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。

5、
  一种生产尼可霉素的方法,是发酵权利要求1-3中任一所述的重组圈卷产色链霉菌得到尼可霉素。

6、
  含有尼可霉素生物合成基因簇的重组质粒pNIK;所述重组质粒pNIK按照以下方法制备:
1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化,回收40-50kb的DNA片段,同时用BamHI酶切科斯质粒,将回收的DNA片段连入所述科斯质粒,得到重组科斯质粒,用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库,筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒的阳性克隆A;筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒的阳性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG,sanV,sanU,sanT,sanS,sanR,sanQ,sanP,sanO,sanN,sanM,sanL,sanK,sanJ,sanH,sanI,sanF,sanA,sanB,sanC和部分sanDE;所述部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段;
所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI,sanF,sanA,sanB,sanC,sanDE,sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段;
2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP,得到重组质粒pLXP-NRPS,使用BamHI酶切pLXP-NRPS,将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中,得到pNIK;
所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株;
所述pLXP按照如下方法构建:用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒,回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9;然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9,回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)连接,得到重组质粒pLXP10;再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10,将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。

说明书

重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用。
背景技术
尼可霉素属于核苷肽类抗生素,与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺的结构类似,是该几丁质合成酶的强竞争性抑制剂。由于几丁质是真菌细胞壁、昆虫以及其他无脊椎动物外骨骼的重要组成部分,因此,尼可霉素能够有效的抑制真菌、昆虫和螨虫,而对哺乳动物、蜜蜂和植物无毒或者毒性极低,并且其在自然界中易降解,是一种理想的农用抗生素。田间试验证明尼可霉素对很多植物病害都有很好的防治效果,如小麦白粉病、烟草红斑病、黄瓜菌核病、番茄叶霉病、苹果轮斑病等。同时,研究表明尼可霉素能够有效抑制人体深部感染真菌-白色念珠菌(Candidaalbicans),尼可霉素Z(Nikkomycin Z)作为口服药物对粗球孢子菌和芽生病菌有明显的疗效。目前,越来越多的人面临着自身免疫系统病(如艾滋病患者、器官移植病人和接受放化疗的癌症患者)和其他原因引起的免疫能力下降而引起的危及生命的真菌感染,因此,作为抗真菌药物的尼可霉素有巨大的应用和开发潜力。
尼可霉素由尼可霉素生物合成基因簇编码的多个酶和蛋白所合成,在尼可霉素生物合成基因簇中有一个途径特异性调控基因sanG,21个结构基因,分别为sanV,sanU,sanT,sanS,sanR,sanQ,sanP,sanO,sanN,saM,sanL,sanK,sanJ,sanH,sanI,sanF,sanA,sanB,sanC,sanDE,sanX。其中,结构基因构成三个转录单元,分别是sanO-sanV,sanN-sanI,sanF-sanX,其中sanO,sanN,sanF是三个转录单元的第一个基因。尼可霉素生物合成基因簇大于35kb,用一般的分子生物学方法很难得到全长的基因簇。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组圈卷产色链霉菌。
本发明所提供的重组圈卷产色链霉菌,是将尼可霉素生物合成基因簇导入圈卷产色链霉菌得到的重组菌。
其中,所述尼可霉素生物合成基因簇可通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌;
所述重组质粒pNIK按照以下方法制备:
1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化,回收40-50kb的DNA片段,同时用BamHI酶切科斯质粒,将回收的DNA片段连入所述科斯质粒,得到重组科斯质粒,用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库,筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒(cosG4)的阳性克隆A;筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒(cosG5)的阳性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG,sanV,sanU,sanT,sanS,sanR,sanQ,sanP,sanO,sanN,sanM,sanL,sanK,sanJ,sanH,sanI,sanF,sanA,sanB,sanC和部分sanDE;所述部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段;
所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI,sanF,sanA,sanB,sanC,sanDE,sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段;
2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP,得到重组质粒pLXP-NRPS,使用BamHI酶切pLXP-NRPS,将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中,得到pNIK;
所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株;
所述pLXP按照如下方法构建:用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒,回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9;然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9,回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)连接,得到重组质粒pLXP10;再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10,将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。
所述重组圈卷产色链霉菌具体可为圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087。
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087已于2009年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC,地址为北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所),保藏号为CGMCCNo.3087。
本发明的另一个目的是提供利用上述重组圈卷产色链霉菌生产生产尼可霉素的方法。
本发明所提供的生产尼可霉素的方法,是发酵所述重组圈卷产色链霉菌得到尼可霉素。
含有尼可霉素生物合成基因簇的重组质粒pNIK也属于本发明的保护范围。
本发明采用RED/ET同源重组技术使尼可霉素生物合成全长基因簇完整的缝合在一起,所采用的RED/ET重组工程技术是基于同源重组的一种对大分子DNA分子和细菌染色体进行修饰的主要方法,其应用不受分子大小的限制,能有效的克服现有基因操作面临的技术难题。
与圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321相比,本发明的重组圈卷产色链霉菌可使尼可霉素Z的产量提高1.8倍左右,尼可霉素X的产量提高3倍左右。本发明显著地提高了尼可霉素的产量,为大规模生产尼可霉素提供了必要的技术准备。
附图说明
图1为重组质粒pNIK的构建策略。
其中,构建过程如下:
1、将来自cosG4的4.5kb片段插入pLXP;
2、BamHI酶切pLXP-NRPS和去磷酸化得到线性片段;
3、RED/ET技术整合pLXP-NRPS和cosG4。
图2为圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321和圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087的尼可霉素产量比较。
其中,○为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNikCGMCC No.3087;■为圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321。
Nikkomycin X表示尼可霉素X,NikkomycinZ代表尼可霉素Z。
图3为pNIK的酶切验证。
其中,M表示1kb分子量标准;1、2、3道分别表示pLXP,cosG4,pNIK用EcoRI酶切的结果;4、5、6表示上述三种质粒用BamHI酶切的结果;7、8、9表示上述三种质粒用KpnI酶切的结果;10、11、12表示上述三种质粒用XhoI酶切的结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施作详细的说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例
实施例1、含有尼可霉素生物合成基因簇的重组质粒pNIK的构建
1、制备含有尼可霉素生物合成基因簇片段的重组科斯质粒
圈卷产色链霉菌7100 CGMCC 4.321(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心),它的孢子呈丝钩状,或圈卷,很少成圈环;孢子为球形或椭圆形。
从圈卷产色链霉菌7100 CGMCC 4.321中提取其基因组DNA,用Sau3AI消化,脉冲电泳分离后回收40-50kb的DNA片段,同时用BamHI(Sau3AI同尾酶)酶切科斯质粒supercos1(Stratagene),去磷酸化后与回收的DNA片段以T4DNA连接酶链接,转化大肠杆菌XL 1-blue MR(Stratagene),获得含有尼可霉素生物合成基因簇片段的重组科斯质粒文库,利用sanF基因的部分片段(500bp,序列1)的地高辛标记的探针筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒(cosG4)的阳性克隆A;筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒(cosG5)的阳性克隆B。
尼可霉素生物合成基因簇片段a从5′→3′依次为sanG上游8.9kb,sanG,sanV,sanU,sanT,sanS,sanR,sanQ,sanP,sanO,sanN,sanM,sanL,sanK,sanJ,sanH,sanI,sanF,sanA,sanB,sanC和部分sanDE;该部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段;
尼可霉素生物合成基因簇片段b从5′→3′依次为:sanI,sanF,sanA,sanB,sanC,sanDE,sanX和sanX下游3.0kb DNA片段。
2、构建含有尼可霉素生物合成基因簇的重组质粒pNIK
pNIK的构建过程如图1所示,具体步骤如下:
1)质粒pLXP的构建
用BamHI和XhoI双酶切重组科斯质粒cosG5,回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19(Fermentas)的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9。然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9,回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)(Stratagene)相连接,构建成到重组质粒pLXP10。再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10,将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152(John innes institute,Norwich,UK)的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP;
2)pLXP和cosG4有大约6kb的重叠区域,这6kb DNA片段可以作为同源重组的下游臂。为构建同源重组的上游臂,用EcoRI和XhoI酶切重组科斯质粒cosG4,回收4.5kb的DNA片段(sanG上游片段),连入BamHI-PstI酶切、补平并自连接的质粒pBluescript II KS(-)(Stratagene)中,获得质粒pNRPS。使用XbaI和BamHI双酶切pNRPS,并连接到XbaI和BamHI双酶切的pLXP上,获得重组质粒pLXP-NRPS。使用BamHI酶切pLXP-NRPS,用小牛磷酸化酶去磷酸化,获得的线性片段电转化含有重组科斯质粒cosG4的重组E.coli BW25113/pIJ790菌株(该重组E.coliBW25113/pIJ790菌株是将重组科斯质粒cosG4转入E.coli BW25113/pIJ790(JohnInnes Institute,Norwich,UK)得到的重组菌),通过安普霉素抗性筛选,质粒抽提,得到pNIK。
分别用EcoRI、BamHI、KpnI和XhoI酶切pNIK、pLXP和cosG4,酶切结果如图3所示,结果显示pNIK既含有pLXP的片段也含有cosG4的片段,同时因为二者重组,出现了一些新的酶切片段。酶切验证显示获得了含有全长尼可霉素生物合成簇的重组质粒pNIK。该质粒不仅含有尼可霉素生物合成的全长基因簇,还含有接合转移序列oriT,噬菌体phiC31整合酶和整合位点attP,能够使用接合转移方法方便地整合到宿主的基因组上。
实施例2、尼可霉素工程菌的构建
1、转入了重组质粒pNIK的重组圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)的获得
含有整个尼可霉素生物合成基因簇的重组质粒pNIK可以用来在圈卷产色链霉菌基因组上增加尼可霉素生物合成基因簇的拷贝数,由于重组质粒pNIK能够整合在圈卷产色链霉菌基因组上随染色体一同复制,因此用此质粒构建的尼可霉素高产工程菌在遗传上是稳定的。具体方法如下所述:
将重组质粒pNIK转入E.coli ET12567(John Innes Institute,Norwich,UK)以去除限制修饰,以安普霉素为筛选标记,通过接合转移,将重组质粒pNIK转入圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321中,得到转入了重组质粒pNIK的重组圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。将其中一株编号为7100 DNik的重组圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)于2009年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC,地址为北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所),保藏号为CGMCC No.3087。
2、圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087的尼可霉素产量检测
将上述步骤1中得到的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100DNik CGMCC No.3087和圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321分别接种在YEME培养基(Difco Yeast Extract 3g,Difco Tryptone 5g,Oxoid Malt Extract 3g,Sucrose 200g,加蒸馏水定容至1000ml使用前加入下列灭过菌的溶液:MgCl2·6H2O(2.5M)2ml,Glucose(50%)20ml,Glycine(10%)50ml)中,28℃,转速180rpm培养48h后,转移1ml菌液到50ml发酵培养基SP培养基(甘露醇30g,可溶性淀粉10g,中性大豆蛋白胨5g,酵母提取物8g,蒸馏水定容至1000ml)中,28℃,转速180rpm培养,分别于发酵1、2、3、4和5天后用滤纸过滤菌体,烘箱烘干,发酵滤液用直径0.22μm的微孔滤膜过滤,滤液即作为HPLC检测样品。发酵实验重复3次
所用仪器为Agilent 1100HPLC,分析柱为Agilent公司的SB-C18柱(4.6×150mm,3.5μm),并使用Agilent公司的SB C-18预柱(4.6×12.5mm,5μm)。所用试剂为,试剂A:10mM庚烷磺酸钠盐和0.72ml/L冰乙酸的水溶液;试剂B:10mM己烷磺酸钠盐和0.72ml/L冰乙酸的水-乙腈(6∶4)溶液。HPLC梯度洗脱条件为流速1ml/min,25分钟内,试剂B的线性梯度从13%到45%,试剂A的线性梯度从87%到55%。
尼可霉素Z标准品(Sigma)在上述HPLC条件下的保留时间为22.3分钟,尼可霉素X标准品的保留时间为23.8分钟,并且以尼可霉素Z和尼可霉素X的峰面积制作标准曲线。样品的保留时间和标准品的保留时间一致,分别为尼可霉素Z为22.3分钟,尼可霉素X为23.8分钟。
其中,进行定量的尼可霉素Z标准曲线是Y=6.7357X-181.52(Y为峰面积,X为尼可霉素Z浓度mg/L),尼可霉素X标准曲线是Y=0.0763X-14.263(Y为峰面积,X为尼可霉素X浓度mg/L)。三次重复实验测得的圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321发酵5天的发酵液中的滤液中的尼可霉素Z的峰面积为198.97±7.98,尼可霉素X的峰面积为149.90±4.03。实验重复三次,测得的圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087发酵5天后的发酵液的滤液中的尼可霉素Z的峰面积为337.22±20.11,尼可霉素X的峰面积为578.64±14.62。
结果如图2所示,在相同条件下圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087的尼可霉素产量要高于圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321的尼可霉素产量,并且导入基因簇后,对尼可霉素的两个主要组分尼可霉素X和尼可霉素Z有不同的增产效果,尼可霉素Z提高1.8±0.05倍,尼可霉素X提高3±0.21倍。
3、圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNik CGMCCNo.3087的稳定性
将圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087接种在没有任何选择压力的基本培养基(MM培养基)(琼脂10g,L-天冬酰胺0.5g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,加蒸馏水定容至1000ml,使用前加入50ml 10%甘露醇)上,在28℃下培养;传5代后重新转接至含安普霉素的MM基本培养基(琼脂10g,L-天冬酰胺0.5g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,加蒸馏水定容至1000ml,使用前加入50ml 10%甘露醇和50μL 100mg/ml的安普霉素)上,结果仍然是安普霉素抗性。随机挑取三株进行如上述步骤2中的发酵,发酵5天后的结果表明圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087仍然比圈卷产色链霉菌菌株7100CGMCC4.321产生的尼可霉素产量高,其中,尼可霉素Z提高1.8倍,尼可霉素X提高3倍。这表明导入的全基因簇稳定的整合在圈卷产色链霉菌的基因组上,工程菌在遗传上是稳定的。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用
<160>1
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cgatccccgg cagcggccgg gcagcgaacc gacgaggggt cggcaggggc ccgcggacag     60
gctgtggcca ggtcaggccc gggccgtccc gggcccacgc atcgacccca aggagacacc    120
gtggtgctga cgctcgactc ggcgctggag gaacgtaccc agccgttcca gctcttccgc    180
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本发明公开了一种重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用。该重组圈卷产色链霉菌,是将尼可霉素生物合成基因簇导入圈卷产色链霉菌得到的重组菌。其中,尼可霉素生物合成基因簇可通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌。与圈卷产色链霉菌菌株7100 CGMCC4.321相比,本发明的重组圈卷产色链霉菌可使尼可霉素Z的产量提高1.8倍左右,尼可霉素X的产量提高3倍左右。本发明显著地提高了尼可霉素的产量,为大规模生产。

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