乙醇诊断/测定试剂盒及乙醇浓度测定方法.pdf

本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的乙醇诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乙醇浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括：缓冲液、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。

1.  一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的乙醇的浓度测定方法，其方法如下：
乙醇+辅酶  酒精脱氢酶  乙醛+还原型辅酶
乙醛+甲酸  乳酸醛缩酶  乳酸
乳酸+辅酶  乳酸脱氢酶  丙酮酸+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出乙醇的浓度大小测定结果。

2.  一种乙醇诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括：
缓冲液        20——500mmol/L
稳定剂        1——4000mmol/L
辅酶          1——6mmol/L
酒精脱氢酶    1000——80000U/L
乳酸醛缩酶    1000——80000U/L
乳酸脱氢酶    1000——80000U/L
甲酸          1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.  根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶组成单剂试剂。

4.  根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶组成。辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.  根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶组成。辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.  根据权利要求2所述乙醇诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。

乙醇诊断/测定试剂(盒)及乙醇浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种乙醇诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乙醇浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
乙醇具成瘾性，酒滥用和酒依赖是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生问题之一。在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的第六位原因。在我国，近20年来，随着社会经济发展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依赖的患病率日趋增高。
生物样品中乙醇的定量测定方法主要有化学比色法，酶终点比色法，均相酶免疫测定法(EIA)，气相色谱法(GC)和呼出气乙醇分析。此外血清渗透量法可作乙醇半定量分析。
有多种化学比色法曾用于乙醇定量测定，微量扩散法是其中较简单实用的一种，微量溢出的乙醇可使铬酸还原成蓝色的氧化铬。
根据所用的试剂酶不同，乙醇的酶法测定分为二种：乙醇氧化酶法和乙醇脱氢酶法，与乙醇氧化酶法相比，乙醇脱氢酶法的专一性高，不会与甲醇和丙酮起催化反应。
一般认为气相色谱法可作为参考方法，尤其在准确性和精密度要求高的法医学乙醇测定中应用最广。GC法的独特优点在于特异、灵敏，且能同时分析多种挥发性醇类物质，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和异丙醇。
其他乙醇的测定方法还有：均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimmunoassay)、渗透量法、呼出气乙醇分析法；用呼出气乙醇分析仪检测乙醇操作简单、快速，在交通执法部门应用较多。这类仪器中一种是根据红外光吸收原理设计的，该法测定的乙醇浓度与酶法测得的血乙醇浓度相关性很好。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乙醇浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙醇诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙醇浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明乙醇浓度测定方法如下：
乙醇+辅酶酒精脱氢酶乙醛+还原型辅酶
乙醛+甲酸乳酸醛缩酶乳酸
乳酸+辅酶乳酸脱氢酶丙酮酸+还原型辅酶
这种方法应用酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase；EC 1.1.1.1)酶(偶)联乳酸醛缩酶(lactate aldolase；EC 4.1.2.36)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase；EC 1.1.1.27；EC 1.1.1.28；EC 1.1.2.3)酶促反应比色终点法。酒精脱氢酶酶解乙醇反应产生乙醛，再通过(偶)联合乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶的作用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算乙醇的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙醇诊断/测定试剂(盒)较为理想：
缓冲液                    100mmol/L
稳定剂                    500mmol/L
辅酶                      3mmol/L
甲酸                      9mmol/L
酒精脱氢酶                10000U/L
乳酸醛缩酶                12000U/L
乳酸脱氢酶                12000U/L
本发明的乙醇诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶。
试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶。
辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、酒精脱氢酶。
辅酶、甲酸、酒精脱氢酶、乳酸醛缩酶、乳酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乙醇浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的乙醇诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
辅酶                             3mmol/L
甲酸                             9mmol/L
酒精脱氢酶                       10000U/L
乳酸醛缩酶                       12000U/L
乳酸脱氢酶                       12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙醇样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。
实施例二
本实施例的乙醇诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
甲酸                             9mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
酒精脱氢酶                       10000U/L
乳酸醛缩酶                       12000U/L
乳酸脱氢酶                       12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙醇样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。
实施例三
本实施例的乙醇诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
甲酸                             9mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
乳酸醛缩酶                       12000U/L
乳酸脱氢酶                       12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
酒精脱氢酶                       10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定乙醇浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙醇样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乙醇的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0005；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达20mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±4％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.0060±0.0030ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。