一种依替非巴肽的合成制备工艺.pdf

本发明提供了一种依替非巴肽的合成制备工艺,所述方法如下:(1)液相合成肽段1:Mpr(X)-Har(R4)-Gly-OH；(2)液相合成肽段2:R1-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2；(3)将肽段1和肽段2缩合，制得全保护的肽段3：Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R2)-Trp(R3)-Pro-Cys(Y)-NH2；(4)将肽段3脱保护基，得到线性肽：Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH2；(5)将线性肽氧化合成二硫桥键，制得环肽：本发明采用先合成线性肽，再环化的方法，使得收率大幅度提高，最后通过纯化制备得到产品，成本降低，适合于工业生产。

1.  一种依替非巴肽的合成制备工艺，所述方法包括如下步骤：
(1)液相合成肽段1：Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-OH；
(2)液相合成肽段2：R₁-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂；
(3)将肽段1和肽段2缩合，制得全保护的肽段3：Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂；
(4)将肽段3脱保护基，得到线性肽：Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH₂、或Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂、或Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH₂、或Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂；
(5)将线性肽氧化合成二硫桥键，制得环肽：
其中：
R1为Fmoc-，Z-，或者Boc-；
Asp(R₂)为侧链R₂保护的天冬氨酰基；R₂为-Otbu或者-Obzl；
Trp(R₃)为侧链R₃保护的色氨酰基；R₃为-Boc或者-H；
Har(R₄)为侧链R₄保护的高精氨酰基；R₄为-Pbf、-Mtr、-Mbs、-Boc、(Boc)₂或者氢；
Mpr(X)为巯基X保护的巯基丙酸；X为-Acm或-Trt；
Cys(Y)-NH₂为巯基Y保护的半胱氨酰胺；Y为-Acm或-Trt。

2.  如权利要求1所述依替非巴肽的合成制备工艺，其特征在于所述步骤(1)如下：先合成NH₂-Gly-Ome，然后和α氮端保护的Har(R₄)反应，得到α氮端保护的Har(R4)-Gly-Ome脱α氮端保护之后与Mpr(X)-OH反应，得到Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Ome，最后进行皂化反应，得到Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。

3.  如权利要求1所述依替非巴肽的合成制备工艺，其特征在于所述步骤(1)如下：用未保护的Gly与Mpr(X)-Har(R4)的活化酯进行反应，得到Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。

4.  如权利要求1所述依替非巴肽的合成制备工艺，其特征在于所述步骤(1)如下：用Mpr(X)的活化酯与Har(R4)-Gly-OH反应，得到Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。

5.  如权利要求1所述依替非巴肽的合成制备工艺，其特征在于所述步骤(2)如下：先合成NH₂-Cys(Y)-NH₂，然后和α氮端保护的Pro反应，得到α氮端保护的Pro-Cys(Y)-NH₂脱α氮端保护之后与α氮端保护的Trp(R₃)反应，得到α氮端保护的Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂脱α氮端保护之后与R₁-Asp(R₂)-OH反应得到R₁-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂。

6.  如权利要求2或5所述依替非巴肽的合成制备工艺，其特征在于所述脱α氮端保护所用试剂为下列之一：(1)含1～6mol/L HCl的乙酸乙酯、或醋酸、或四氢呋喃溶液；(2)含1～50％TFA的DCM或醋酸溶液；(3)含1～95％哌啶的DCM或DMF溶液。

7.  如权利要求1所述依替非巴肽的合成制备工艺，其特征在于步骤(4)中所述氧化为空气氧化、双氧水氧化、碘氧化或DIEA氧化。

一种依替非巴肽的合成制备工艺
(一)技术领域
本发明涉及一种依替非巴肽的合成制备工艺，属于生物技术领域。
(二)背景技术
冠心病是西方发达国家的第一死亡原因，每年有数百万人发病，我国虽然发病率不如西方发达国家，但是每年约有100～200万人，并且有不断上升的趋势，虽然现代技术可以采用成形或者搭桥手术进行治疗，但是手术后再次生病的几率比较高，而且还需要药物治疗。而依替非巴肽正是一种高效的血小板多肽拮抗剂，这种药物要能够直接阻断血小板糖蛋白受体和配体的结合，从而使心脏得到供血，减轻或者消除冠心病的症状。
关于依替非巴肽的合成报道已经有很多，涉及到固相合成以及部分液相合成方法。
目前在世界上作为此产品的原研厂商bechem公司，对此产品的合成主要包含两个合成方案。分别是液相合成法和固相合成法，液相合成法主要是通过片段多肽的合成，包含如下合成步骤：1、首先通过最常规的多肽缩合方法，合成三肽片段(Trt)Mpr-Lys(TFA)-Gly-Ome，然后通过胍基化反应将Lys转变为Har，之后进行皂化和酸中和得到(Trt)Mpr-Lys(TFA)-Gly-OH。2、利用活化酯的方法制备Z-Asp(otbu)-OSu，然后与二肽Trp-Pro-OH反应，得到多肽片段三肽Z-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH。3、将上述两个片段缩合，得到六肽片段(Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH。4、将六肽片段(Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-OH与Cys(Trt)-NH₂缩合，得到线性肽七肽(Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH₂。5、将(Trt)Mpr-Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH₂七肽环化成粗产品，然后纯化得到高纯度的产品。
而在世界专利WO2005100381中讲到了3+3+1片段法，是peptisyntha公司的关于工业范围内多肽GMP生产会议上提到了(Trt)Mpr-Har-Gly和Asp-Trp-Pro和Cys(Trt)，然后专利通过比较和介绍，最后推出的合成路线是Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Npys)和Mpr的合环，具体是先合成六肽直链(Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(Npys)-NH₂)，然后先进行硫桥键的合成，得到Har-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-S-S-Mpr，之后再合成酰胺键，最后脱出保护基，得到最终产品。
路线如下：


在WO2005121164中提到的是固相合成法，采用的是先合成中间体直链七肽(采用lys)(acm)Mpr-lys(boc)-Gly-Asp(otbu)-Trp-Pro-Cys(acm)-resin，然后才通过切割树脂得到七肽的保护肽(acm)Mpr-lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2，这个时候通过胍基化反应将lys转变为高精氨酸，得到直链(acm)Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(acm)-NH2，最后，采用碘环化的方法得到硫桥键，制得最终产品。
另外，在世界专利WO2006045483A2中也是报导了固相合成法，但是他采用的是在树脂上就合环的方法。采用Fmoc-Cys(tbu)-Sieber为起始原料通过固相接肽，从而得到(Mpr)2-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp(boc)-Pro-   Cys(tbu)-Sieber，之后使用BU3P进行硫上保护基的脱除，然后再使用NMP和6％的DIEA合成硫桥键，最后裂解得到产品。

世界专利WO2006119388A2中也是采用了固相合成法(仅仅是提到而已)，采用的是在树脂上合成Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp-Pro-OH，再和Cys(acm)-NH₂反应得到Mpr(Trt)-Har-Gly-Asp(tbu)-Trp-Pro-Cys(acm)-NH₂，之后使用TFA除去侧链保护基，得到Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(acm)-NH₂，最后环化得到目标产品。
欧洲专利EP1591449B1中主要研究的是多肽中二硫桥键的合成条件，而且主要是研究了反应的最佳环化条件和pH值，研究结果如下：通过对于含有巯基磺酸盐和-SH(酸不稳定保护基)的直链肽合成，之后在无水酸的条件下脱去保护，在30度，pH值＝8.3的情况下得到的产品收率比值为最佳。通过相关资料得到环化的两个条件：(1)、在强力搅拌下，溶剂为methylene chloride∶methano∶water＝6.0∶2.5∶0.42，2umol产品在2.0ml(或者0.4ml)溶剂中，methylenechloride∶methanol＝8.0∶1.5时，2.03mg(8pmol)的碘在2ml(或者0.4ml)溶液中。
依替非巴肽化学式为：
结构式如下：

固相合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂，这给企业的大规模生产带来了成本的压力。而世界专利WO2005100381中提到的液相方法，在最后环化和偶联步骤中的收率不高，致使未参与反应的六肽原料浪费严重。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种收率高、成本低的依替非巴肽的合成方法。
本发明采用的技术方案是：
一种依替非巴肽的合成方法，所述方法包括如下步骤：
(1)液相合成肽段1：Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-OH；
(2)液相合成肽段2：R₁-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂；
(3)将肽段1和肽段2缩合，制得全保护的肽段3：
Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂；
(4)将肽段3脱保护基，得到线性肽：
Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH₂(Trt可在酸性条件下脱除，而Acm不能在酸性条件下脱除，因此当Y、X都为Acm时，可以在酸性条件下脱除其他保护基，只留下X、Y保护基)、或Mpr(X)-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂(当X为Acm，Y为Trt时可以在酸性条件下脱除其他保护基，只留下X保护基)、或Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Y)-NH₂(当Y为Acm，X为Trt时可以在酸性条件下脱除其他保护基，只留下Y保护基)、或Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂(当Y、X都为Trt时可以在酸性条件下脱除全部保护基)；
(5)将线性肽氧化合成二硫桥键，制得环肽：

其中：
R1为Fmoc-，Z-，或者Boc-；
Asp(R₂)为侧链R₂保护的天冬氨酰基；R₂为-Otbu或者-Obzl；
Trp(R₃)为侧链R₃保护的色氨酰基；R₃为-Boc或者-H；
Har(R₄)为侧链R₄保护的高精氨酰基；R₄为-Pbf、-Mtr、-Mbs、Boc、(Boc)₂(表示2个Boc基)或者氢；
Mpr(X)为巯基X保护的巯基丙酸；X为-Acm或-Trt；
Cys(Y)-NH₂为巯基Y保护的半胱氨酰胺；Y为-Acm或-Trt。
本发明关键在于合成路线的设计，其中肽段的合成，可按照本领域常规技术进行。
对于肽段1：Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-OH的合成，通过合成Gly-OMe，然后在室温下采用常规方法和常规的试剂，通过逐步偶联，得到Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-OMe，经过皂化和酸化，得到最后的目的三肽。
对于肽段2：Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂的合成，主要通过先合成NH₂-Cys(Y)-NH₂，然后在室温下采用常规方法和常规的试剂，通过逐步偶联，得到R₁-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂，即最后的目的四肽。
对于肽段3：Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂的合成，通过合成步骤一中的两个片段，然后在室温下采用常规方法和常规的试剂，缩合成为Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂，然后通过常规的后处理得到纯度90％以上的粗产品。
对于线性肽Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂的合成，可采用在DMF作为溶剂，溶解前一步骤的产品Mpr(X)-Har(R₄)-Gly-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂情况下，利用强酸TFA脱除所有保护基(其中X，Y也可以部分脱除或者不脱除)，利用低极性溶剂沉淀产品，纯度达到90％以上。
对于环肽的合成，利用前一步骤获得的线性肽，在水作为溶剂的情况下，在0～35℃下，利用I₂进行环化10～50分钟(或者同样情况下用空气，DIEA，双氧水环化)，得到目的产品，之后通过HPLC纯化得到高纯度的目标产品。
本发明采用先合成线性肽，再环化的方法，使得收率大幅度提高，成本降低。
所述步骤(1)如下：先合成NH₂-Gly-Ome，然后和α氮端保护的Har(R₄)反应，得到α氮端保护的Har(R4)-Gly-Ome脱α氮端保护之后与Mpr(X)-OH反应，得到Mpr(X)-Har(R4)-Gly-Ome，最后进行皂化反应，得到Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。
或者，所述步骤(1)如下：用未保护的Gly与Mpr(X)-Har(R₄)的活化酯进行反应，得到Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。
又或者，所述步骤(1)如下：用Mpr(X)的活化酯与Har(R4)-Gly-OH反应，得到Mpr(Trt)-Har(R4)-Gly-OH。
所述步骤(2)如下：先合成NH₂-Cys(Y)-NH₂，然后和α氮端保护的Pro反应，得到α氮端保护的Pro-Cys(Y)-NH₂脱α氮端保护之后与α氮端保护的Trp(R₃)反应，得到α氮端保护的Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂脱α氮端保护之后与R₁-Asp(R₂)-OH反应得到R₁-Asp(R₂)-Trp(R₃)-Pro-Cys(Y)-NH₂。
所述脱α氮端保护所用试剂可为下列之一：(1)含1～6mol/L HCl的乙酸乙酯、或醋酸、或四氢呋喃溶液；(2)含1～50％TFA的DCM或醋酸溶液；(3)含1～95％哌啶的DCM或DMF溶液。
步骤(4)中所述氧化可为空气氧化、双氧水氧化、碘氧化或DIEA氧化。
本发明合成过程中建议使用的中间体和片段见表1：
表1