白念珠菌致病相关基因SFL2及其用途.pdf

白念珠菌致病相关基因 SFL2 及其用途
    【技术领域】
     本发明属于白念珠菌菌丝生长调控基因领域。具体而言， 本发明涉及白念珠菌致 病相关基因 SFL2 及其用途。背景技术
     白念珠菌是一种机会型致病真菌， 在大部分健康人体的胃肠道内以及口腔粘膜 表面都有寄生。在健康人体中， 白念珠菌通常不具有致病性 ； 但在免疫系统受损或抑制 的人体中， 白念珠菌可能引起严重的念珠菌病， 导致浅部感染如鹅口疮、 阴道炎等， 也可 以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官如肾脏、 脑部等， 导致败血症， 甚至可以导 致 死 亡 (Klepser， 2006， Pharmacotherapy， 26 ： 68S-75S ； Sudbery et al.， 2004， Trends Microbiol， 12 ： 317-324)。在美国， 念珠菌属在医院的血液感染中居第四位， 估计每年花 费的治疗费用超过 20 到 40 亿美元 (Wilsonet al.， 2002， Value Health， 5： 26-34)， 而其 引起的致死率估计在 38 ％到 49 ％之间 (Gudlaugsson et al.， 2003， Clin Infect Dis， 37 ： 1172-1177)。在癌症病人中报道的各种侵入性真菌感染中， 念珠菌病是最常见的感染 (58％ -69％ )(Rosenet al.， 2005， J Pediatr Hematol Oncol， 27 ； 135-140 ； Wang et al.， 2005， ActaPaediatr Taiwan， 46 ： 149-155.)， 而其中占大部分的是白念珠菌。 白念珠菌可以 以单细胞的酵母态 (yeast form)， 以及丝状的假菌丝 (pseudohyphae) 和真菌丝 (hyphae) 形态进行生长 (Berman， 2006， Curr Opin Microbiol， 9： 595-601.)。在不同的生长形态 之间可以进行相互转换， 而这种转换能力是白念珠菌致病性的重要决定因素之一， 形态 转换有缺陷的菌株其系统感染能力下降或消失 (Lo， H.J.etal， 1997.Cell.90 ： 939-949 ； Braun， B.R.et al.2001.EMBO J.20 ： 4753-61 ； Hwang， C.S.et al.2003.Mol Microbiol.47 ： 1029-43)。很多环境因子可以引起从酵母态到菌丝态的转变， 例如血清、 N- 乙酰葡糖胺、 中 性 pH、 高温、 饥饿、 二氧化碳和粘附等。这些外界的环境信号通过一系列信号转导途径传递 到细胞内部， 来调节白念珠菌的形态发生。在这些信号转导途径中， MAPK 途径和 cAMP-PKA 途径发挥主要作用， 其中 cAMP-PKA 途径最为关键。MAPK 途径下游的 Cph1(Huang etal.， 2008， Microbiol Res， 163 ： 380-393) 和 cAMP-PKA 途径下游的 Efg1 与 CaFlo8(Hogan and Sundstrom， 2009， Future Microbiol， 4： 1263-1270)(Cao et al.， 2006， Mol Biol Cell， 17 ： 295-307) 是代表性的促进白念珠菌丝状生长的正调控因子。酿酒酵母与白念珠菌的形态 发生调控网络有很多相似之处， 酿酒酵母 cAMP/PKA 途径的两个转录因子 Phd1 和 Mga1 在假 菌丝发育的转录调控中处于枢纽地位 (Borneman et al.， 2006， Genes Dev， 20 ： 435-448)， 过表达 PHD1 或者 MGA1 诱导酿酒酵母在酵母生长条件下进行假菌丝生长， 这两个转录因子 自身的转录都受到 ScFlo8 的调控。对结合的靶基因的分析证明这两个转录因子调控的基 因有很多重叠， 并且 Mga1 依赖于 ScFlo8 来结合靶基因， 表明 Mga1 与 ScFlo8 有调控作用 (Borneman et al.， 2006， Genes Dev， 20 ： 435-448)。Phd1 和 ScFlo8 分别是白念珠菌 Efg1 和 CaFlo8 的同源物， 后二者都在白念珠菌的菌丝发育中发挥重要功能。白念珠菌基因组中 与 Mga1 同源性最高的是 Sfl2， 它的功能还有待深入研究。发明内容 白念珠菌是人类最常见的一种病原真菌， 除了可以导致鹅口疮、 阴道炎等表皮感 染外， 还可能引起致命的系统性感染。 白念珠菌在酵母态和丝状生长形态 ( 假菌丝和菌丝 ) 之间的形态转换能力是其致病性最重要的决定因素之一， 这种形态转换受到许多转录因子 的复杂调控。本发明人克隆了一个调控白念珠菌形态转换的转录因子基因 SFL2。在野生 型白念珠菌中过表达 SFL2 激活菌丝生长， 而 SFL2 基因的敲除降低白念珠菌的菌丝形成能 力， 并阻断其侵入生长， 说明其编码产物 Sfl2 是白念珠菌丝状生长和侵入生长的一个激活 因子。利用尾静脉注射的系统感染模型和肠道接种的系统感染模型检测 SFL2 在白念珠菌 致病过程中的功能作用， 本发明人构建了 sfl2/sfl2 缺失株， 结果表明在两种小鼠系统感 染模型中 sf12/sfl 缺失株的毒性都显著减弱， 说明 SFL2 是一个致病相关基因。SFL2 基因 的转录和 Sfl2 蛋白的表达都受温度调控， 在体外 25℃几乎不表达， 而在体温 37℃条件下大 量表达， 暗示该基因对白念珠菌在人体内生存的重要意义。Sfl2 蛋白属于 HSF 结构域家族 成员， 具有特异的 HSF 型 DNA 结合结构域 ； 而白念珠菌丝状生长的转录抑制因子 Sfl1 也具 有 HSF 结构域， 这两个 HSF 结构域的互换导致相反的功能， 本发明人发现这两个蛋白是通过 自身特异的 HSF 结构域来发挥功能相反的调控作用。
     因此， 本发明第一方面提供一种氨基酸序列， 所述氨基酸序列含有 SEQ ID NO ： 4或 SEQ ID NO ： 6 所示的序列。
     在一个具体实施方式中， 本发明的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 6所 示的氨基酸序列。
     本发明第二方面提供一种多核苷酸序列， 所述多核苷酸序列编码本发明的氨基酸 序列。
     在一个具体实施方式中， 所述多核苷酸序列含有 SEQ ID NO ： 3 或 4 所示的序列。 在另一具体实施方式中， 所述多核苷酸序列编码 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ IDNO ： 6 所示的氨基酸 序列。
     本发明第三方面提供本发明的氨基酸序列多核苷酸序列在制备治疗或预防念珠 菌病用的药物中的用途。
     在一个具体实施方式中， 所述念珠菌病选自念珠菌性间擦疹， 丘疹形念珠菌病， 念 珠菌性甲沟炎， 甲床炎， 慢性皮肤粘膜念珠菌病， 鹅口疮， 生殖器念珠菌病， 以及念珠菌感染 导致的肠念珠菌病、 肺念珠菌病、 泌尿道炎、 肾孟肾炎、 心内膜炎、 脑膜炎和念珠菌性败血 症。
     在一个具体实施方式中， 所述用途涉及 SEQ ID NO ： 1 ～ 6 中任一序列的用途。
     本发明第四方面提供一种改变念珠菌菌丝生长能力的方法， 所述方法包括 ：
     (1) 使念珠菌含 HSF 结构域的基因发生突变， 从而使得该 HSF 结构域失活或含该 HSF 结构域的整个蛋白失活 ； 或
     (2) 在该念珠菌中过表达 Sfl1 蛋白或含有 SEQ ID NO ： 4 所示序列的氨基酸序列 ； 或
     (3) 在该念珠菌中过表达 Sfl2 蛋白或含有 SEQ ID NO ： 6 所示序列的氨基酸序列 ；
     从而改变念珠菌菌丝生长能力。
     本发明第五方面提供白念珠菌的 Sfl2 基因或其编码的蛋白、 或所述基因的同源
     基因或该同源基因所编码的蛋白在用于筛选抑制念珠菌菌丝生长的药物或筛选用于预防 或治疗念珠菌病用的药物中的用途。
     本发明还提供白念珠菌 SFL2 基因的用途， 用于制备白念珠菌 sfl2/sfl2 缺失株， 所述的缺失株为白念珠菌的减毒株 ； 所述的白念珠菌 SFL2 基因的核苷酸序列选自下组 ： (a) 编码 SEQ ID NO ： 2 所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列 ； (b) 与 (a) 互补的多核苷酸 序列。该基因的用途还包括制备与野生型白念珠菌相比 Sfl2 蛋白过表达的白念珠菌。
     本发明还提供白念珠菌 SFL1 基因或含 SEQ ID NO ： 3 所示核苷酸序列的基因的用 途， 用于制备与野生型白念珠菌相比 Sfl2 蛋白表达受到抑制或菌丝生长能力减弱的白念 珠菌。
     此外， 本发明还提供含 SEQ ID NO ： 5 所示核苷酸序列的基因的用途， 用于制备与野 生型白念珠菌相比 Sfl2 蛋白表达提高或菌丝生长能力提高的白念珠菌。
     本发明还提供一种筛选预防或治疗念珠菌病的分子的方法， 所述方法包括 ：
     将候选分子给予培养中的念珠菌， 和测定该念珠菌的 Slf2 蛋白的表达水平和菌 丝生长能力， 其中， 能使所述表达水平和生长能力受到抑制的分子为所述预防或治疗上述 念珠菌病的分子。 本发明还提供一种菌丝生长能力发生了变化的念珠菌菌株， 所述菌株选自含 HSF 结构域的基因缺失的菌株、 含 HSF 结构域的基因过表达的菌株、 以及过表达含本申请 SEQ ID NO ： 4 或 6 所示序列的蛋白的菌株。
     在一个具体实施方式中， 本发明的菌丝生长能力发生了变化的念珠菌是白念珠 菌， 其是 sfl2/sfl2 缺失株， 缺失白念珠菌 sfl2 基因 ； 所述的白念珠菌 SFL2 基因的核苷酸 序列选自下组 ： (a) 编码 SEQ ID NO ： 2 所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列 ； (b) 与 (a) 互补的多核苷酸序列。
     在其它具体实施方式中， 本发明的菌丝生长能力发生了变化的念珠菌是白念珠 菌， 其 Sfl 2 蛋白过表达， 菌丝生长能力被激活或提高。
     本发明还包括本发明所述的菌丝生长能力发生了变化的念珠菌菌株的用途， 用于 制备使受试者对野生型的白念珠菌产生免疫力的疫苗。
     附图说明 图 1 显示的是白念珠菌中 SFL2 基因的敲除。A 图显示在白念珠菌中敲除 SFL2 基 因的策略及其染色体上的酶切图谱 ； B 图显示在白念珠菌 SFL2 基因的敲除过程中各个菌株 的 Southern 杂交图谱。
     图 2 显示的是 sfl2/sfl2 缺失株在侵入生长和包埋条件下的菌丝生长中有明显的 缺陷。侵入生长模拟的是白念珠菌感染宿主时粘附和侵入宿主组织的过程， 而包埋条件模 拟的是已经侵入组织的白念珠菌在宿主体内某些厌氧环境中进行丝状生长的过程。A 图显 示 sfl2/sfl2 缺失株粘附到琼脂表面的能力相比野生型对照菌株大大下降 ； B 图显示 sfl2/ sfl2 缺失株侵入琼脂的能力相比野生型对照菌株也大大下降 ； C 图显示在包埋在琼脂中 时野生型对照菌株能够形成长而浓密的菌丝， 而 sfl2/sfl2 缺失株仅能形成短而稀疏的菌 丝。
     图 3 显示了在小鼠系统感染试验中， SFL2 基因的敲除使白念珠菌毒力降低。注射
     液浓度为 5×106 细胞 / 毫升， 每只小鼠尾静脉注射 100μl 菌液， 共注射 8 只小鼠。
     图 4 显示 SFL2 基因的缺失导致白念珠菌在小鼠肠道感染模型中的毒力大大下降。 该感染模型通过将白念珠菌掺入饮水对小鼠进行喂食， 使白念珠菌在小鼠肠道中稳定繁殖 进而扩散和感染小鼠的组织导致死亡。白念珠菌终浓度为 2×106 个细胞每毫升， 每个菌株 喂食 8 只小鼠。
     图 5 显示的是白念珠菌中 SFL2 基因的转录和蛋白的表达都受人体温度 37℃的诱 导。A 图 qRT-PCR 结果显示 SFL2 基因的转录水平在高温 (37℃ ) 下相比在低温 (25℃ ) 下 上调了大约 5 倍， 而在 Lee 氏培养基或者血清刺激下上调了大约 1.5 倍。 B 图 Western blot 结果显示 Sfl2 蛋白表达水平在高温 (37℃ ) 诱导下也上调了大约 5 倍， 在 Lee 氏培养基或 者血清刺激下仅有微弱的上调。
     图 6 显示了 Sfl2 和 Sfl1 是通过各自的 HSF 结构域来发挥对丝状生长的不同调控 功能。A 图显示了 Sfl2 与 Sfl1 的嵌合蛋白的构建示意图。B 和 C 图显示了嵌合蛋白对白 念珠菌丝状生长的影响 ； 图 6B 为 YPD 平板， 30℃培养 2 天 ； 图 6C 为琼脂 + 血清平板， 37℃培 养 3 天。 具体实施方式
     念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、 亚急性或慢性感染， 是最常见的真菌病。 常侵犯皮肤、 粘膜， 也可引起内脏或全身感染。临床症状错综复杂， 急缓不一。儿童多为急 性继发性感染。近年来随着大剂量抗生素、 激素、 免疫抑制剂的应用， 以及器官移植术的开 展， 其发病率渐趋增高， 并可危及生命造成严重后果。
     念珠菌病可包括皮肤念珠菌病， 例如念珠菌性间擦疹、 丘疹形念珠菌病 ( 可伴发 念珠菌性口角炎、 口腔炎 )、 念珠菌性甲沟炎、 甲床炎、 慢性皮肤粘膜念珠菌病 ； 粘膜念珠菌 病， 例如鹅口疮、 生殖器念珠菌病 ( 包括女阴阴道炎及龟头包皮炎 ) ； 内脏念珠菌病， 念珠菌 感染可累及全身所有内脏器官， 其中以肠念珠菌病及肺念珠菌病较常见， 此外， 尚可引起泌 尿道炎、 肾孟肾炎、 心内膜炎及脑膜炎等， 还会引起念珠菌性败血症 ； 念珠菌疹 ； 等等。
     白色念珠菌可侵犯人体许多部位， 可引起 ： 1. 皮肤念珠菌病， 好发于皮肤皱褶处 ( 腑窝、 腹股沟， 乳房下， 肛门周围及甲沟， 指间 )， 皮肤潮红、 潮湿、 发亮， 有时盖上一层白色 或呈破裂状物， 病变周围有小水泡。2. 粘膜念珠菌病， 以鹅口疮、 口角炎、 阴道炎最多见， 在 粘膜表面盖有凝乳大小不等的白色薄膜， 剥除后， 留下潮红基底， 并产生裂隙及浅表溃疡。 3. 内脏及中枢神经念珠菌病， 可由粘膜皮肤等处病菌播散引起， 有肺炎、 肠胃炎、 心内膜炎、 脑膜炎、 脑炎等， 偶尔也可发生败血症。
     因此， 本申请提供白念珠菌的 Sfl2(SEQ ID NO ： 1) 或其编码的蛋白 (SEQ IDNO ： 2)、 或 Sfl2 在念珠菌属其它念珠菌中的同源基因或其所编码的蛋白的用途， 包括用于筛选 抑制念珠菌菌丝生长的药物、 预防或治疗上述念珠菌病 ( 尤其是白念珠菌引起的各种疾 病 ) 用的药物、 以及研究念珠菌 ( 尤其是白念珠菌 ) 菌丝生长调控和毒性表现中的功能。
     本申请提供白念珠菌 Sfl1 与 Sfl2 的嵌合基因序列及其编码序列， 分别是 SEQID NO ： 3 和 5 所示的核苷酸序列及 SEQ ID NO ： 4 和 6 所示的氨基酸序列， 以及这些序列的用途， 包括用于筛选抑制念珠菌菌丝生长的药物、 筛选和制备预防或治疗上述念珠菌病 ( 尤其是 白念珠菌引起的各种疾病 ) 用的药物、 以及研究念珠菌 ( 尤其是白念珠菌 ) 菌丝生长调控和毒性表现中的功能。
     本申请提供一种改变念珠菌菌丝生长能力的方法， 所述方法包括 ： (1) 使念珠菌 含 HSF 结构域的基因发生突变， 从而使得该 HSF 结构域失活、 被剔除或含该 HSF 结构域的整 个蛋白失活 ； 或 (2) 在该念珠菌中过表达 Sfl1 蛋白或其同源蛋白或含有 SEQ ID NO ： 4所 示序列的氨基酸序列 ； 或 (3) 在该念珠菌中过表达 Sfl2 蛋白或其同源蛋白或含有 SEQ ID NO ： 6 所示序列的氨基酸序列 ； 从而改变念珠菌菌丝生长能力。 “改变” 在本申请中包括促进 和抑制。本文中， 含 HSF 结构域的基因主要包括 SFL1 和 SFL2。
     因此， 在一个具体实施例中， 本申请提供一种通过使白念珠菌的 Sfl2(SEQ IDNO ： 1) 的 HSF 结构域 ( 编码 SEQ ID NO ： 2 第 113 ～ 223 位氨基酸的核苷酸序列 ) 发生突变而导 致其编码的 Sfl2 蛋白的 HSF 结构域失活或整个蛋白失活、 从而抑制白念珠菌菌丝生长的方 法。还可在其它念珠菌的与 HSF 同源的结构域中发生类似或相同的突变， 以抑制该念珠菌 菌丝生长。上述突变以及突变所得序列也可以作为治疗或预防上述念珠菌病的手段之一。
     本申请也包括促进念珠菌 ( 例如白念珠菌 ) 菌丝生长的方法， 该方法包括例如使 该念珠菌的 Sfl2 蛋白过表达， 或者在该念珠菌中过表达含 SEQ ID NO ： 6 所示序列的氨基酸 序列， 从而促进念珠菌的菌丝生长。 这种促进念珠菌菌丝生长的方法可用于， 例如本申请所 述的药物筛选。具体而言， 可在实施促进念珠菌生长的方法的同时， 给予候选分子， 通过判 断念珠菌菌丝生长情况来评价该候选分子能否作为念珠菌菌丝生长的抑制剂， 以用于治疗 用途。过表达的方法可采用本领域常规技术实现。例如， 本申请中， “过表达” 是把 SFL2 等 基因整合到白念珠菌基因组 ADE2 基因的位点， 在 ADH1 启动子的启动下进行高表达。如本 申请实施例所示， 表达呈组成型表达， 因此在 25℃、 30℃和 37℃都能看到该基因产物对白 念珠菌的形态影响以及毒性影响。
     上述 “突变” 包括将整个 Sfl2 或其同源序列剔除， 或者用长度相同或类似、 但不编 号野生型 HSF 结构域的序列进行替换， 或者将该 HSF 结构域剔除， 也包括突变该核苷酸序列 中的一个或多个核苷酸序列、 从而使得所编码的 HSF 结构域失活。
     HSF 结构域是否失活可采用本领域常规的手段进行评价。 例如， 可通过评价含有突 变的 Sfl2 基因的念珠菌的菌丝生长能力， 用以判断该突变是否导致 HSF 结构域失活。
     “同源” 在本文中修饰基因或蛋白时， 指在念珠菌属的各种念珠菌中都具有的序列 基本上相同、 功能基本上相同的基因或蛋白。所述序列基本上相同指， 其它念珠菌中的 “同 源序列” 与 SEQ ID NO ： 1 或 2 所示的核苷酸或氨基酸序列相比， 显示有至少 80％、 优选至 少 85％、 更优选至少 90％、 更优选至少 95％、 最优选至少 98％以上的序列相同性。通常， “相同性” 指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。 通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息， 计算两条排列的序列间匹配的准确数 量， 将其除以最短序列的长度， 然后乘以 100， 从而可得到相同性百分数。 可采用本领域常规 得的计算机程序来计算两条或多条序列之间的序列相同性， 这些程序包括 ALIGH、 Dayhoff、 M.O.、 BESTFIT、 FASTA 和 GAP 程序等。
     本申请也包括一种筛选预防或治疗上述念珠菌病的分子的方法， 该方法包括将候 选分子给予培养中的念珠菌， 和测定该念珠菌的 Slf2 蛋白的表达水平和菌丝生长能力， 其 中， 能使所述表达水平和生长能力受到抑制的分子为所述预防或治疗上述念珠菌病的分 子。 一类这样的分子包括本申请所公开的 SEQ ID NO ： 4 所示的氨基酸序列以及含有 SEQ IDNO ： 4 所示氨基酸序列的多肽序列。
     因此， 本申请还包括 SEQ ID NO ： 3 ～ 6 所示的序列以及含有这些序列的序列、 组合 物、 表达载体、 细胞、 念珠菌等。 本领域周知， 可在对这些序列做出一个或几个 ( 例如 1 ～ 50 个， 1 ～ 40 个， 1 ～ 30 个， 1 ～ 20 个， 1 ～ 10 个， 1 ～ 5 个 ) 选自缺失、 插入和突变的变异， 这 些变异不会使这些序列发生功能上的变化。
     尤其是， 在某些实施例中， 对于核苷酸序列而言， 可对 HSF 结构域以外的核苷酸实 施上述突变 ； 对于氨基酸而言， 可对 HSF 结构域以外的氨基酸序列做出突变， 这种突变由于 保留了活性 HSF 结构域的功能使变异所得序列仍保留了所需的生物学活性。
     上述筛选方法包括体内和体外方法， 也包括非治疗目的的方法。上述方法还包括 提供一对照， 并将所测定的表达水平与生长能力与该对照进行比较。 对照可以是， 例如野生 型念珠菌。进一步地， 筛选得到的分子可以进行动物实验。
     在某些实施例中， 筛选实验在 32 ～ 38℃左右进行， 优选在约 35 ～ 37℃进行。在 其它实施例中， 使用如本文实施例部分所述的培养基进行筛选实验。
     本申请也包括采用上述方法筛选得到的分子及其在制备治疗或预防念珠菌病用 的药物中的用途。 本申请也包括含有这类分子的药物组合物以及含有所述药物组合物的药 盒。药物组合物中还可以含有各种适当的药学上可接受的载体或赋形剂。 本申请还包括本申请所提供的序列 ( 包括 SEQ ID NO ： 1 ～ 2 及其同源序列 ) 在制 备治疗或预防上述念珠菌病用的药物中的用途。本文中， 该 “制备” 既包括使用所述序列作 为药物中的活性成分进行的药物制备， 也包括使用所述序列作为起始原料进行的包括筛选 活性成分在内的整个药物制备过程。
     本文以白念珠菌 (C.albicans) 为例进行阐述， 但应理解念珠菌属还包括现有已 知的各种菌， 包括但不限于 C.ascalaphidarum、 C.amphixiae、 C.antarctica、 C.atlantica、 C.atmosphaerica 、 C.blattae 、 C.carpophila 、 C.cerambycidarum 、 C.chauliodes 、 C.corydali 、 C.dosseyi 、 C.dubliniensis 、 C.ergatensis 、 C.fructus 、 C.glabrata 、 C.fermentati 、 C.guilliermondii 、 C.haemulonii 、 C.insectamens 、 C.insectorum 、 C.intermedia 、 C.jeffresii 、 C.kefyr 、 C.krusei 、 C.lusitaniae 、 C.lyxosophila 、 C.maltosa、 C.marina、 C.membranifaciens、 C.milleri、 C.oleophila、 C.oregonensis、 C.parapsilosis 、 C.quercitrusa 、 C.sake 、 C.shehatea 、 C.temnochilae 、 C.tenuis 、 C.tropicalis、 C.tsuchiyae、 C.sinolaborantium、 C.sojae、 C.subhashii、 C.viswanathii、 C.utilis。本申请也包括 SEQ ID NO ： 1 和 2 所示序列在这些菌株中的同源序列的用途， 包 括用于筛选抑制念珠菌菌丝生长的药物、 预防或治疗念珠菌病用的药物、 以及研究念珠菌 ( 尤其是白念珠菌 ) 菌丝生长调控和毒性表现中的功能。
     本申请还包括各种经本申请方法处理而获得的菌丝生长能力发生了变化的念珠 菌菌株。例如， 这类念珠菌菌株包括含 HSF 结构域的基因 ( 例如 SFL2 基因或其同源基因 ) 缺失的菌株、 含 HSF 结构域的基因 ( 例如 SFL1 或 SFL2 基因或其同源基因 ) 过表达的菌株、 以及过表达含本申请 SEQ ID NO ： 4 或 6 所示序列的蛋白的菌株等。念珠菌的菌丝生长能力 可如本文实施例所述在 25 ～ 38℃ ( 优选在例如约 35 ～ 37℃ ) 的条件下进行测试。这些 菌丝生长能力发生了变化的菌株可用于本申请所述的筛选方法， 用来筛选特异性药物， 或 者可用于疫苗研制。本申请的菌株可在常规的培养基中培养， 例如， 在常规的 YPD 培养基中
     在 25 ～ 38℃下进行培养。
     本申请还包括鉴定白念珠菌菌株毒性的方法， 该方法包括检测待测白念珠菌中 SFL1 或 SFL2 基因的表达或活性， 其中， 若相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 SFL2 基因 表达或活性提高或 SFL1 基因表达或活性降低， 则该白念珠菌具有一般毒性或高的毒性 ； 若 相对于野生型白念珠菌， 待测白念珠菌 SFL2 基因表达或活性降低或 SFL1 基因表达或活性 升高， 则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。所述鉴定可在例如 32 ～ 38℃温度下进行。
     下文将以具体实施例的方式对本发明进行详细的阐述。应理解， 这些具体实施例 仅仅是阐述性的。对于文中的试剂及用量， 除非另有说明， 否则为本领域常规的试剂和用 量。
     材料和方法
     1、 白念珠菌的转化
     准 备 PEG/LiAc 溶 液 (0.1M LiAc， 10mM Tris·HCl， 1mM EDTA， 40 ％ PEG4000， pH 7.5)10ml ；在 1.5ml Eppendorf 管 中 依 次 加 入 质 粒 2-10ug， 5μl 10mg/ml 鱼 精 DNA(Invitrogen)， 混匀； 加 入 0.1ml 感 受 态 细 胞 和 0.5ml PEG/LiAc， votex 混 匀 ； 30 ℃ 200rpm 培养 30min ； 42 ℃热冲击 22min， 冰浴 1-2min ； YPD 培养基 (2 ％ tryptone， 1％ yeast extract， 2％葡萄糖 ) 中复苏 1h， 高速离心 15s， 吸掉上清， 涂布于适当的营养筛选 SD 平板 (0.17％ yeast nitrogen basew/o amino acids， 0.5％ (NH4)2SO4， 2％葡萄糖， 再补加 适当的氨基酸 ) 上。
     2、 白念珠菌基因组 DNA 的抽提
     5ml 过夜培养物， 5000rpm 离心 5min 收获菌体， 悬于 0.5ml Sol A(1M 山梨醇， 100mM EDTA， pH8.0) 中， 转移至 1.5ml 离心管， 加入 3-5μl 20mg/ml zymolyase( 日本生化学工业 株式会社 )， 20μl 1M DTT( 可不加 )， 37℃， 60min， 不时轻摇。5000rpm， 2min 回收菌体， 用 0.5ml TE 缓冲液洗一次， 悬于 350μl TE 缓冲液中， 可吹吸， 加入 90μl Sol B(250mM EDTA pH8.0， 400mM Tris· HCl pH8.0， 2％ SDS)， 混匀， 65℃， 孵育 30min， 加入 80μl 5M KAc， 置冰 上 120min 以上。12000rpm， 离心 10min， 上清转入新管， 加入两倍体积乙醇， 颠倒混匀， 挑出 DNA 于 200μl 70％乙醇中， 挤干沉淀， 不等干透立即加入 0.4ml TE(pH 7.5)， 溶解后加入 5μl RNase A(10mg/ml)， 37℃保温 1h， 加入 1/10 体积 3M NaAc， 两倍体积乙醇， 挑出沉淀于 200μl 70％乙醇中， 挤干后立即用 150μl TE(pH 7.5) 溶解。
     3、 Southern 杂交分析
     白念珠菌基因组 DNA 抽提后， 基因组 DNA 用 XmnI 完全酶切， 电泳完成后的琼脂 糖胶分别用变性液 (1.5M NaCl， 0.5M NaOH) 和中和液 (1M Tris·HClpH7.4， 1.5M NaCl) 浸泡 45min， 尼龙膜用双蒸水或 10×SSC 浸透， 搭好转膜平台， 胶与膜间用 Parafilm 封闭， 加一个 500g 砝码。以 10×SSC 为转膜液转移过夜， 第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装 入杂交管， 加入 10ml 预杂交液 (6×SSC， 5×denhardt’ s Reagent， 0.5 ％ SDS， 100μg/ml 鱼精 DNA)， 于 42 ℃预杂交 12h， 探针在 100 ℃变性 5min， 加入 150μl( 约 1/3 所标记的探 例 )42 ℃杂交 10-16h。0.1×SSC， 0.1 ％ SDS 洗两到三次， 每次 40min， 取出膜， 晾干， 室温 或 -70℃压片。探针标记用 Invitrogen 的随机引物标记试剂盒， 照其说明操作。将含 25ng DNA 的溶液于 100℃加热变性 5-10min， 置于冰浴中， 再依次加入 Random Primers Buffer Mixture(Invitrogen)， 2μl dCTP， 2μl dGTP， 2μl dTTP， 3μl[α-32P]-dATP(10μCi/μl)， 混匀后加入 1μl Klenow 酶， 于 25℃保温 1h， 以 Sephadex G-25 柱以 3000rpm 离心 4min， 收集离心液， 即为纯化后的探针溶液。 探针于 100℃变性 5min 冰上冷却后加入杂交体 系中。
     4、 实时定量 PCR
     利用 RNeasy mini kit 和 RNase-free DNase(QIAGEN) 抽提白念珠菌的总 RNA。 cDNA 的合成使用 TOYOBO 公司的 ReverTra Ace qPCR RT Kit， 并按照公司提供的方法完 成。定量 PCR 使用的是 TOYOBO 的 SYBR Green Realtime PCRMaster Mix， 仪器为 7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)。循环条件为 ： 94℃， 5min 热启动 ； 然后在 94℃， 15s， 55℃， 30s， 72℃， 30s 反应 40 个循环。数据收集采用 ΔΔCt 方法。获得的数据用 7500FastSystem SDS Software Version 1.4.0.25(Applied Biosystems) 进行分析。
     5、 白念珠菌细胞抽提物的制备
     白念珠菌在 YPD 培养基中于 30 ℃培养至饱和， 按 OD6000.15 转接于 YPD 或其他 培养基中， 在实验所需温度培养至 OD600 为 0.6-1.0。50mL 培养物离心收集， 10mL 无菌水 洗一次。以下步骤均在 4 ℃进行。细胞重悬于 0.4mL 酵母细胞裂解液 (200mM Tris-HCl pH 8.0， 400mM(NH4)2SO4， 10mM MgCl2， 1mM EDTA， 10 ％ 甘 油， 7mM β- 巯 基 乙 醇， 2mM 苄 脒， 1mM PMSF， 2μg/ml 抑胃肽 A， 2μg/ml 亮肽素， 4μg/ml antipain)， 加入 0.4g 酸洗玻璃珠 (425-600μm， Sigma)。在振荡器 FastPrep-24(MP biomedicals) 上以 5m/s 的速度振 4-5 次， 每次 30s， 间隔冰浴 5min。裂解液 12000rpm 离心 5min， 上清再离心 5min， 收集上清并测 定蛋白浓度， -70℃保存。
     6、 白念珠菌毒力检测
     尾静脉注射法 ： 以体重在 16-18g ICR 雄性小鼠为实验对象， 通过尾静脉注射 100μl 白念珠菌各种菌株， 并培养观测 25 天。各个菌株注射浓度为 5x107 细胞 / 毫升。
     肠道感染法 ： 白念珠菌对小鼠的肠道感染实验按照文献报道的方法进行 (Koh et al.， 2008， PLoS Pathog， 4： e35)。6-8 周的雌性 C3H/HeN 小鼠分成每笼 4 只喂养。通过饮 用水中抗生素的加入来去除小鼠体内的微生物群落。 使用的抗生素为 ： 2mg/ml 链霉素 (BIO BASIC INC.)， 1500U/ml 青霉素 G(BIOBASIC INC.)， 和 0.250mg/ml fluconazole(Sigma)。 持续三天以后， 再用相同浓度的链霉素和青霉素 G 喂养一天。然后采集小鼠粪便， 用 1％的 胰蛋白酶消化后铺到 YPD， trypticase soy 和 MacConkey agar(BD) 平板上， 在 37℃培养并 观察微生物生长确定已经除去内源微生物后进行后续实验。 然后将所要检测的白念珠菌菌 6 株用 YPD 培养， 按照终浓度 2×10 cfu/ml 加入小鼠的饮用水， 同时加入与之前相同浓度的 链霉素和青霉素 G， 饲喂 5 天。采集粪便， 研磨， 梯度稀释， 铺到含有 0.010mg/ml 万古霉素 (BIO BASIC INC.) 和 0.100mg/ml 庆大霉素 (BIO BASIC INC.) 的 YPD 平板上， 37℃培养一 天， 以确定各个菌株在小鼠体内的寄生水平相当。 在肠道寄生达到稳定后， 通过腹腔注射免 疫抑制剂环磷酰胺 (cyclophosphamide， Sigma)， 注射量为 150mg/kg/ 剂。然后用含有 2mg/ ml 链霉素， 1500U/ml 青霉素 G 和 0.2mg/ml 庆大霉素的饮用水继续喂养， 并观察小鼠的死亡 情况。 将小鼠肝脏解剖， 用 1％的胰蛋白酶消化， 然后梯度稀释并铺到含有 0.100mg/ml 庆大 霉素和 0.010mg/ml 万古霉素的 YPD 平板上， 在 37℃培养来检测白念珠菌在小鼠肝脏内的水 平。
     实施例 1 ： 白念珠菌中 SFL2 基因的敲除为了研究 SFL2 基因的功能， 本发明人通过同源重组法对其进行敲除， 敲除策略的 示意图见图 1A。分别用以下引物 ( 划线部分表示酶切位点 ) ：
     5’ -CGCCTCGAGACACTTTTAGACCTTTCATTTG(SEQ ID NO ： 7)， 与
     5’ -ATACTGCAGCCAGGATTTTTCTTACTCATTG(SEQ ID NO ： 8) ； 和
     5’ -GCAGGATCCGAGAGATAACTAAGAAATATG(SEQ ID NO ： 9)， 与
     5’ -TCTGCGGCCGCGATTGAGCATAATATCATTTC(SEQ ID NO ： 10)
     从野生型菌株 SC5314 基因组 DNA 中扩增得到白念珠菌 SFL2 基因的启动子区 的 1kb 和 3’ -UTR 的 0.9kb 片段， 分别用 XhoI/PstI 和 BamHI/NotI 酶切后依次插入到质 粒 pBluescript KSII 的相应位点。所得质粒用 BamHI 酶切后与带有 BglII-BamHI 末端的 HisG-URA3-HisG 片段连接得到白念珠菌 SFL2 基因的敲除质粒 pSFL2-KO。HisG-URA3-HisG 片段是用 BglII-BamHI 从 pCUB6 酶切得到的。SFL2 基因的启动子区的 1kb 和 3’ -UTR 的 0.9kb 片段的序列用于同源重组。pSFL2-KO 经 XhoI/SstI 酶切以后用于转化野生型的 ura 营养缺陷型菌株 CAI4， 在缺少尿嘧啶的合成培养基上可以筛选到转入质粒的转化子。通过 1kb 和 0.9kb 两个同源片段和基因组上的 SFL2 同源片段重组， 可以把染色体上的 SFL2 基因 的 2.1kb 的编码区同源片段用 HisG-URA3-HisG 给替换掉， 从而破坏染色体上的 SFL2 基因， 正确插入的转化子通过 Southern 杂交分析确定。然后将正确插入的转化子涂在含 5- 氟乳 清酸 (5-fluoro-orotic acid， 5-FOA) 平板上， 由于 5- 氟乳清酸对含有 URA3 的菌株来说是 具有毒性的， 所以可以通过两个同向 HisG 同源序列在同一条染色体上的重组而将 URA3 环 出， 那么在含 5- 氟乳清酸 (5-fluoro-orotic acid， 5-FOA) 平板上长出的都是丢失了 URA3 筛选标记的重组菌。利用丢失了 URA3 筛选标记的重组菌可以进行下一轮的转化进而敲除 另一条染色体上的 SFL2 基因。
     所得重组子的基因型用 Southern 杂交技术检测确定。这些菌株的基因组 DNA 用 XmnI 酶切， 与含 1.0kb SFL2DNA 片段的探针杂交。 杂交结果表明， CAI4 菌株显示一条 3.3kb 杂交条带， SFL2 单拷贝缺失株显示 3.3kb 和 8.1kb 两条杂交带， 在 5-FOA 平板上将一份拷 贝的 HisG 和 URA3 环出后， 呈现一条较小的 5.0kb 杂交带， 通过两轮转化和环出， 得到 SFL2 双拷贝缺失的菌株 sfl2/sfl2。 图 1B 显示了 SFL2 基因敲除过程中各个菌株 Southern 杂交 分析的图谱。
     实施例 2 ： SFL2 基因的敲除对白念珠菌菌丝发育的影响
     白念珠菌侵入到琼脂内部的能力是其丝状生长的一种表现形式。 真菌丝和假菌丝 都能进行侵入生长， 从而刺入到琼脂内部。为了研究 Sfl2 在侵入生长过程中是否发挥作 用， 本发明人将野生型、 sfl2/sfl2 缺失株、 SFL2 回复株和过表达 SFL2 的野生型菌株划到 YPD 琼脂平板上， 在 37℃培养两天以后， 用水流进行冲洗。位于琼脂表面的野生型细胞大部 分都被冲洗掉， 少量细胞依然附着在表面上 ( 图 2A)， 一部分细胞刺入到琼脂内部形成侵入 的丝状体 ( 图 2B)。sfl2/sfl2 缺失株比野生型细胞更容易冲洗掉， 并且刺入到琼脂内部的 能力有缺陷， 在琼脂基质中只能形成很短的丝 ( 图 2A)。将一个拷贝的野生型 SFL2 导入缺 失株， 在内源的启动子下表达后可以回复缺失株的侵入生长缺陷。另外， 过表达 SFL2 可以 增强细胞粘附在表面的能力并且使更多的细胞侵入琼脂内部并形成更长的丝 ( 图 2A， 2B)。 这些结果表明， 在体温 (37℃ ) 时， SFL2 发挥白念珠菌侵入生长的激活因子的功能。
     包埋条件是一种低氧的、 与介质接触的条件， 可以部分模拟白念珠菌在宿主体内的某些生存环境。本发明人观察了包埋条件下 sfl2/sfl2 缺失株的表型。取单菌落于 YPD 培养基， 30℃培养过夜后， 按照 4×104cfu/ml(cfu ： 菌落形成单位 ) 转接到新鲜的 YPD 培养 基中， 30℃培养 4 小时。400cfu 的菌液和融化的 YPS(1％ Agar) 琼脂培养基混合均匀并铺 板， 在 37℃培养 2 天。在解剖镜下观察菌落形态。野生型细胞形成不均相的丝状菌落， 菌落 中包含大量伸长的菌丝细胞 ； 而缺失株形成小而不规则的菌落， 周围只有很少的短的丝状 突起， 菌落里的细胞大部分是酵母态， 整合了一个拷贝 SFL2 的回复株能够部分回复包埋条 件下的丝状生长， 菌落形态接近野生型 ( 图 2C)。
     实施例 3 ： SFL2 基因的敲除对白念珠菌毒性的影响
     酵母 - 菌丝形态之间的转换能力与白念珠菌的致病能力密切相关， 菌丝发育有缺 陷的白念珠菌毒性往往下降。本发明人构建的 sfl2/sfl2 缺失株菌丝发育有缺陷， 为了检 测 SFL2 的缺失对白念珠菌毒性的影响， 本发明人在两个不同的白念珠菌系统感染小鼠模 型中进行了检测。
     尾静脉注射的系统感染模型 ： 注射用小鼠为 ICR 雄性小鼠， 体重 18 ～ 21g。待测 菌株在 YPD 培养过夜， 转接至新鲜培养基中再培养 3-4 小时， 取适量离心后重悬浮于 1ml 0.9％生理盐水中， 稀释后用血球计数板计数。菌液以生理盐水稀释至浓度为 5×107 细胞 /ml。以 0.25ml 注射器和 4 号针头注射小鼠尾静脉， 每只小鼠注射 0.1ml， 每种菌株注射 8 只小鼠。每天观察小鼠的死亡情况， 从小鼠的死亡曲线判定菌株的毒力。结果如图 3 所示， 野生型菌使小鼠在 6 天内全部死亡， 而注射了 sfl2/sfl2 缺失株的小鼠在 16 天时还全部存 活， 过表达 SFL2 的菌株毒性比野生型略微下降， 小鼠在 8 天时全部死亡。 肠道接种的系统感染模型 ： 接下来本发明人利用一个最近报道的白念珠菌的小鼠 感染模型来检测 SFL2 基因的敲除对白念珠菌毒性的影响 (Koh et al.， 2008， PLoS Pathog， 4： e35.)。在这个模型中， 白念珠菌是通过饮用水接种到小鼠的肠道， 而不是像上述的模型 中那样是通过静脉直接注射到血液中。这个模型的一个优点是它可能模仿了白念珠菌在 人体内造成感染的过程 ： 肠道共生的白念珠菌穿过肠道的黏膜表面而转移到血液并造成系 统感染， 这种情况在注射了化疗药物 ( 例如本实验中使用的环磷酰胺 ) 的癌症病人中很常 见 (Spellberg， 2008， PLoS Pathog， 4： e38.)。本发明人选取 6 至 8 周龄的雌性 C3H/HeN 小 鼠， 先在其饮用水中加入链霉素、 青霉素和氟康唑来除去内源的微生物群落。然后将野生 型， sfl2/sfl2 缺失株和 sfl2/sfl2::SFL2( 回复株 ) 的白念珠菌 ( 同时加入链霉素和青霉 素 ) 分别通过饮用水喂养小鼠。通过粪便采样， 确定各个小鼠肠道内接种的白念珠菌数量 是相当的。在肠道接种白念珠菌成功以后， 将免疫抑制剂环磷酰胺 (cyclophosphamide) 用 腹腔注射方法打入小鼠体内， 并用加入了链霉素、 青霉素和庆大霉素的饮用水进行喂养， 同 时观察死亡率。如图 4A 所示， 在进行了免疫抑制以后， 接种了野生型白念珠菌的 8 只小鼠 在 5 天内全部死亡。而接种了缺失株白念珠菌的小鼠中有 87.5％ (8 只中的 7 只 ) 在免疫 抑制 11 天以后依然存活。回复株的毒性得到了大部分的回复 ： 所有接种了回复株的 8 只小 鼠在 8 天内全部死亡。因此， 在这个肠道感染的小鼠模型中， Sfl2 对于白念珠菌的毒性是 必需的。本发明人将死亡小鼠的肝组织取出， 存活至 11 天后的小鼠处死后也取出肝组织， 经研磨、 胰蛋白酶消化后梯度稀释， 铺到 YPD 平板上培养， 通过菌落计数来检测小鼠肝脏中 的白念珠菌水平。结果显示， 被 sfl2/sfl2 缺失株感染的小鼠肝脏中的白念珠菌水平明显 低于野生型， 而回复株的水平则与野生型相当 ( 图 4B)。
     实施例 4 ： SFL2 基因的表达调控
     本发明人检测了 SFL2 在各种培养条件下的转录水平。本发明人使用了 YPD， YPD+10％血清， Lee 氏培养基 (pH 4.5 或 6.8)( 参见 Chen et al.， 2000， MolCell Biol， 20 ： 8696-8708)， 分别在 25℃和 37℃培养野生型白念珠菌， 抽提 RNA， 用 qRT-PCR 方法来检 测 SFL2 的转录量。本发明人发现， SFL2 的转录主要受温度调控。在 YPD 培养基中， 37℃比 25℃的转录量提高了 5.2 倍 ( 图 5A)。另外， 一些其他因素对 SFL2 的转录也有影响， 但是影 响程度较小。例如， 相同温度下， SFL2 在 YPD+10％血清中的转录量大概是 YPD 中的 1.5 倍 ； 而 Lee 氏培养基中的转录大概是 YPD 中的 1.8 倍 ( 图 5A)。pH 值对 SFL2 的转录水平没有 明显影响， pH4.5 和 pH6.8 的 Lee 氏培养基中的转录水平没有显著差异 ( 图 5A)。接下来， 本发明人检测了 Sfl2 的蛋白表达是否也受到温度的诱导。本发明人构建了 Sfl2-MYC 的表 达质粒， 将其整合到 SFL2 的基因位点， 在内源 SFL2 启动子下表达 Sfl2-Myc 融合蛋白。本 发明人使用了与上述抽提 RNA 相同的培养条件， 抽提白念珠菌的总蛋白， 并用 anti-Myc 抗 体检测融合蛋白的表达情况。结果显示， Sfl2 蛋白的表达水平的变化与 RNA 转录水平的变 化一致， 也主要受到温度的调控。在 25℃时， 蛋白的表达水平很低 ； 而在 37℃时， 则被较大 量诱导出来 ( 图 5B)。在同一种培养基中， 高温比低温的表达水平提高了 5-6 倍 ( 图 5B)。 此外， 血清和 Lee 氏培养基也对融合蛋白的表达有较小的影响， 这与 SFL2 的 RNA 转录水平 一致。这些结果表明， SFL2 的表达受到高温、 血清、 Lee 氏培养基等菌丝诱导条件的诱导， 而 高温 (37℃ ) 发挥主要作用。 实施例 5 ： HSF 结构域在 Sfl2 功能发挥中的重要作用
     Sfl2 蛋白的氨基端具有一个 HSF 型 DNA 结合结构域， 另一个转录因子 Sfl1( 白念 珠菌基因组序列可见 Candida Genome Database， 网址为 ： http://www.candi dagenome. org， 其中 SFL2 基因的系统名为 orf19.3969， SFL1 基因的系统名为 orf19.454) 也具有 HSF 结构域， 但 Sfl1 是白念珠菌菌丝发育的抑制因子， 这与 Sfl2 激活菌丝发育的功能相反。本 发明人推测 Sfl2 与 Sfl1 可能是通过各自的 HSF 结构域结合不同的靶基因， 从而发挥了不 同的调控功能。为了验证这个假设， 本发明人构建了 Sfl1 与 Sfl2 的嵌合体， 将这两个基因 的 HSF 结构域互换， 示意图见图 6A。在野生型的 CAI4 菌株中过表达这两个嵌合蛋白， 观察 它们对菌丝发育的影响。结果表明， Sfl2 嵌合了 Sfl1 的 HSF 结构域 (Sfl2-1， 核苷酸序列 见 SEQ ID NO ： 3， 氨基酸序列见 SEQ ID NO ： 4) 以后， 就不再激活菌丝生长， 而是抑制菌丝生 长， 而 Sfl1 嵌合了 Sfl2 的 HSF 结构域 (Sfl1-2， 核苷酸序列见 SEQ ID NO ： 5， 氨基酸序列 见 SEQ ID NO ： 6) 以后， 功能也反过来了， 呈激活作用。在酵母培养条件下 (30℃的 YPD 平 板 )， 过表达 Sfl2 激活菌丝生长， 而过表达 Sfl2-1 嵌合体则不会激活菌丝生长， 与 Sfl1 的 表型相似 ； 过表达 Sfl1-2 嵌合体则激活菌丝生长， 与 Sfl2 的表型相似 ( 图 6B)。在菌丝诱 导条件下 (37℃的血清平板 )， 过表达 Sfl1 抑制菌丝形成， 过表达 Sfl1-2 嵌合体不会抑制 菌丝形成， 反倒激活菌丝生长， 与 Sfl2 的表型相似 ； 相反， 过表达 Sfl2-1 嵌合体抑制了菌丝 形成， 与 Sfl1 的表型相似 ( 图 6C)。
     上文以具体实施例的方式对本发明进行了详细的描述。应理解， 本发明并不限于 这些具体实施例。 在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可对本发明做出各种变动和修改。 这些变动和修改都在本发明的保护范围之内。