《胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒及CR2基因在其制备中的用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒及CR2基因在其制备中的用途.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104059984A43申请公布日20140924CN104059984A21申请号201410315636522申请日20140704C12Q1/6820060171申请人杨承刚地址100080北京市海淀区善缘街1号2层310372发明人杨承刚宋宏涛边洋孙耀兰54发明名称胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒及CR2基因在其制备中的用途57摘要本发明公开了CR2基因在制备诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒中的用途。本发明利用高通量测序技术筛选出CR2基因在胆囊结石中表达下调，在胆囊息肉中表达上调，并使用荧光实时定量PCR方法验证了上述结论，据此，本发明还公开了一种诊断胆囊结石和胆囊息肉的。
2、试剂盒以及利用该试剂盒诊断胆囊结石和胆囊息肉的方法。本发明一方面为研究胆囊息肉和胆囊结石的分子机理提供新的思路，另一方面为早期诊断胆囊结石和胆囊息肉提供了更为灵敏的诊断试剂盒。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页附图1页10申请公布号CN104059984ACN104059984A1/1页21CR2基因在制备诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、用于扩增CR2基因和管家基因的引物对；所述SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包。
3、含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。2根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增CR2基因的引物对的序列如下正向序列5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向序列5TTCAGGCATCTCATAAGT3；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的引物对的序列如下正向序列5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向序列5GGTGGAATCATATTGGAACA3。3根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR缓冲液包含25MMKCL、25MMMGCL2、200MMNH42SO4。4根据权利要求13中任一项所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含。
4、MMLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；所述逆转录体系包含T重复寡核苷酸OLIGODT、逆转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、DNTPS；所述RNA提取试剂包含TRIZOL、氯仿、异丙醇、75乙醇。5根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆转录反应液包含250MMPH83TRISHCL、375MMKCL、15MMMGCL2、50MMDTT。6一种胆囊结石和胆囊息肉的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、用于扩增CR2基因和管家基因的引物对；所述SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。7。
5、根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增CR2基因的引物对的序列如下正向序列5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向序列5TTCAGGCATCTCATAAGT3；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的引物对的序列如下正向序列5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向序列5GGTGGAATCATATTGGAACA3。8根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含25MMKCL、25MMMGCL2、200MMNH42SO4。9根据权利要求68中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含MMLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；。
6、所述逆转录体系包含T重复寡核苷酸OLIGODT、逆转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、DNTPS；所述RNA提取试剂包含TRIZOL、氯仿、异丙醇、75乙醇。10根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液包含250MMPH83TRISHCL、375MMKCL、15MMMGCL2、50MMDTT。权利要求书CN104059984A1/7页3胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒及CR2基因在其制备中的用途技术领域0001本发明属于生物医药领域，涉及一种胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒以及CR2基因在制备胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒中的用途。背景技术0002胆囊结石是指发生在胆囊内的。
7、结石所引起的疾病，是一种常见病。随年龄增长，发病率也逐渐升高，女性明显多于男性。随着生活水平的提高，饮食习惯的改变，卫生条件的改善，我国的胆石症已由以胆管的胆色素结石为主逐渐转变为以胆囊胆固醇结石为主。胆囊结石与多种因素有关，任何影响胆固醇与胆汁酸浓度比例改变和造成胆汁淤滞的因素都能导致结石形成。个别地区和种族的居民、女性激素、肥胖、妊娠、高脂肪饮食、长期肠外营养、糖尿病、高脂血症、胃切除或胃肠吻合手术后、回肠末段疾病和回肠切除术后、肝硬化、溶血性贫血等因素都可引起胆囊结石。在我国西北地区的胆囊结石发病率相对较高，可能与饮食习惯有关。0003胆囊息肉又称为胆囊息肉样病变，是各种胆囊粘膜良性隆起。
8、的简称，泛指向胆囊腔突起或隆起的病变，可以是球形或半球形，有蒂或无蒂，多为良性，包括已知的胆囊腺瘤，胆固醇沉着症，胆囊腺肌增生症，炎症性肉芽肿等，发病原因不明，可能与慢性胆囊炎有关。病理上表现为胆囊壁某种组织或细胞成份过度增生，既非炎症，也非肿瘤，B超回声表现和息肉相同，故称胆囊息肉样病变，习称胆囊息肉，因直径10MM时有恶变倾向，被列为十大癌前病变之一。因症状轻微，所以该病常常造成患者延误。0004高通量转录组测序RNASEP是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测序技术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建，新基因的发现、小分子非编码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、。
9、蛋白质编码基因注释、以及如FUSIONTRANSCRIPT等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的，接下来针对不同的研究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。0005利用大规模测序技术直接对由MRNA反转录成的CDNA序列进行测序，产生数以千万计的READS数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以直接通过比对到该基因组区域的READS数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞的基因表达谱，通过对正常组织和病变组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中差异表达的基因，一方面为研究疾病的发生和发展的分子机制提供新的思路，另一方面为疾病的诊断和治疗提供新的诊断标志物或药物靶点。。
10、发明内容0006本发明利用高通量测序技术发现CR2基因在胆囊结石和胆囊息肉中的表达较正常组织存在差异，与正常组织相比，CR2基因在胆囊结石中表达下调，而在胆囊息肉中表达上调，通过检测CR2基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有胆囊结石和胆囊说明书CN104059984A2/7页4息肉。0007本发明的目的在于提供CR2基因在制备诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、用于扩增CR2基因和管家基因的引物对。所述SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。0008上述技术方案中，所述P。
11、CR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述PCR缓冲液包含25MMKCL，25MMMGCL2，200MMNH42SO4。0009所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。0010优选地，本发明的诊断试剂盒还包含MMLV逆转录体系，该逆转录体系包含T重复寡核苷。
12、酸OLIGODT、逆转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、DNTPS。0011优选逆转录反应液包含250MMTRISHCLPH83、375MMKCL、15MMMGCL2、50MMDTT。0012RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。0013优选地，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含TRIZOL、氯仿、异丙醇、75乙醇。0014本发明的诊断试剂盒保存于20，尽量减少反复冻融。0015本发明的另一目的在于提供一种诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒。所述诊断试剂盒包含SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、用于。
13、扩增CR2基因和管家基因GAPDH的引物对。所述SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。0016上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述PCR缓冲液包含25MMKCL，25MMMGCL2，200MMNH42SO4。0017所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGT。
14、GGATATTGT3，反向引物序列为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。0018优选地，本发明的诊断试剂盒还包含MMLV逆转录体系，该逆转录体系包含T重复寡核苷酸OLIGODT、逆转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、DNTPS。0019优选逆转录反应液包含250MMTRISHCLPH83、375MMKCL、15MMMGCL2、50MMDTT。0020RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。0021优选地，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含TRIZOL、氯仿、异丙醇、75乙醇。0022本发明。
15、的诊断试剂盒保存于20，尽量减少反复冻融。0023本发明还提供了利用上述诊断试剂盒诊断胆囊结石和胆囊息肉的方法，所述方法说明书CN104059984A3/7页5包括00241提取样本总RNA；00252将步骤1获得的RNA逆转录成CDNA；00263在荧光实时定量PCR仪上将CR2基因和管家基因进行扩增检测；00274通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，CT法进行相对定量；00285CR2基因表达下调，表明研究对象为胆囊结石患者；CR2基因表达上调，表明研究对象为胆囊息肉患者。0029步骤1的具体实施方法为收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后003。
16、0加入TRIZOL，室温保存5MIN；0031加氯仿02ML，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5MIN10MIN；003212000RPM高速离心15MIN后吸取上层水相吸70到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的20预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10MIN；003312000RPM高速离15MIN后小心弃掉上清液，按1ML/MLTRIZOL的比例加入75DEPC乙醇洗涤沉淀4保存，洗涤沉淀物，振荡混合，4下12000RPM高速离心5MIN；0034弃去乙醇液体，室温下放置5MIN以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；0035用NANOD。
17、ROP2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于70。0036步骤2的具体实施方法为用逆转录缓冲液对1G总RNA进行逆转录合成CDNA。采用25L反应体系，每个样品取1G总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分DEPC水，5逆转录缓冲液，10MMOL/LDNTP，01MMOL/LDTT，30UMMOL/LOLIGODT，200U/LMMLV，模板RNA。42孵育1H，7210MIN，短暂离心。0037步骤3的具体实施方法为采用25L反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系SYBRGREEN聚合酶链式反应体系125L，正。
18、向引物5M/L1L，反向引物5M/L1L，模板CDNA20L，无酶水85L。各项操作均于冰上进行。扩增程序为9510MIN，9515S，6060S45个循环。以SYBRGREEN作为荧光标记物，在LIGHTCYCLER荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。0038本发明的优点和有益效果在于1本发明首次公开了CR2基因与胆囊息。
19、肉和胆囊结石相关，CR2基因有望成为诊断胆囊息肉和胆囊结石的分子标志物，同时为研究胆囊息肉和胆囊结石的分子机理提供新的思路。2利用检测基因表达的方式诊断胆囊结石和胆囊息肉的存在与否的方法较现有技术中使用B超检测的方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。附图说明0039图1显示荧光实时定量PCR测定正常组织、胆囊息肉和胆囊结石中CR2基因MRNA说明书CN104059984A4/7页6的相对表达量。0040具体的实施方式0041下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。0042实施例1筛选与胆囊息肉和胆囊结石相关的基因004311样品收集0。
20、044各收集60例正常组织、患胆囊结石的组织、患胆囊息肉的组织，每组中20个样本。004512RNA样品的制备及质量分析0046121RNA样品的制备0047三组样品包括胆囊息肉组织、胆囊结石组织、正常组织，经过RNA抽提后经琼脂糖凝胶电泳判断RNA样品质量，合格者可以用于进一步的转录组分析。0048122RNA样品的质量分析NANODROP1000分光光度计0049NANODROP1000分光光度计检测RNA样品，RNASEQ测序的样品要求OD260/OD280为1822。0050123RNA样品的质量分析AGILENTTECHNOLOGIES2100BIOANALYZER0051AGILE。
21、NTTECHNOLOGIES2100BIOANALYZER检测RNA样品质量，观察28SRRNA和18SRRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNASEQ测序CDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。005213高通量转录组测序0053131RNASEQ读段定位0054首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TOPHATV131将清洁片段与UCSCHSAPIENS参考基因组HG19进行匹配，HSAPIENSUCSCHG19版的预先构建的索引从TOPHAT主页下载，并作为参考基因组，利用TOPHAT与基因组匹配时，允许每个读段默认到20有多个匹配位点，最多2。
22、次错配。TOPHAT根据外显子区域和GTAG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TOPHAT方法的系统默认参数。0055132转录丰度评估0056匹配上的读段文件通过CUFINKSV103处理，CUFINKSV103将RNASEQ片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1KB长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。CUFINKS使用的参考的GTF注释文件从ENSEMBL数据库下载HOMO_SAPIENSGRCH3763GTF。0057133差异表达基因的。
23、检测0058将下载的ENSEMBLGTF文件和通过TOPHAT匹配的原始文件传输到CUFFDIFF，CUFFDIFF使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在CUFDFF输出中只有Q值001，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。005914结果0060前期的RNASEQ测序结果发现只有7个基因在胆囊结石中下调同时在胆囊息肉中上调，其中有2个基因为长片段非编码RNA，1个基因为假基因，查阅文献发现目前还没有关说明书CN104059984A5/7页7于以上基因与胆囊结石和胆囊息肉的报道。0061实施例2QPCR验证候选基因与胆囊结石和胆囊息肉的关系0062基于。
24、前期高通量转录组深度测序的结果，根据PVALUE的大小，我们选择CR2基因其表达在胆囊结石中下调，且在胆囊息肉中上调进行验证。收集20对胆囊息肉和胆囊结石组织样本同时收集20个正常组织样本，采用荧光实时定量PCR进行经典的分子生物学实验验证QRTPCR，具体操作步骤如下所示00631RNA提取0064收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后0065加入TRIZOL，室温保存5MIN0066加氯仿02ML，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5MIN10MIN006712000RPM高速离心15MIN后吸取上层水相吸70到另一新离心管中，注意不要吸到两层。
25、水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的20预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10MIN；006812000RPM高速离15MIN后小心弃掉上清液，按1ML/MLTRIZOL的比例加入75DEPC乙醇洗涤沉淀4保存，洗涤沉淀物，振荡混合，4下12000RPM高速离心5MIN；0069弃去乙醇液体，室温下放置5MIN以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；0070用NANODROP2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于70。00712逆转录0072用逆转录缓冲液对1G总RNA进行逆转录合成CDNA。采用25L反应体系，每个样品取1G总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加。
26、入以下组分DEPC水，5逆转录缓冲液，10MMOL/LDNTP，01MMOL/LDTT，30MMOL/LOLIGODT，200U/LMMLV，模板RNA。42孵育1H，7210MIN，短暂离心。00733QPCR扩增检验0074采用25L反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系SYBRGREEN聚合酶链式反应体系125L，正向引物5M/L1L，反向引物5M/L1L，模板CDNA20L，无酶水85L；扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；管家基因优。
27、选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。各项操作均于冰上进行。扩增程序为9510MIN，9515S，6060S45个循环。以SYBRGREEN作为荧光标记物，在LIGHTCYCLER荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，CT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常组织相比，CR2基因在胆囊结石中下调，在胆囊息肉中上调，同RNASEP结果一致。0075实施例3胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备0076根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测。
28、CR2基因的表达情况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下SYBRGREEN聚说明书CN104059984A6/7页8合酶链式反应体系；扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对。扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；扩增GAPDH的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DN。
29、TPS、SYBRGREEN荧光染料。PCR缓冲液成分为25MMKCL，25MMMGCL2、200MMNH42SO4。0077实施例4胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备0078根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对、MMLV逆转录体系。扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCA。
30、TAAGT3；扩增GAPDH的正向引物序列为5，CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列为5，GGTGGAATCATATTGGAACA3。SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。PCR缓冲液组分为25MMKCL、25MMMGCL2、200MMNH42SO4。MMLV逆转录体系组分为T重复寡核苷酸OLIGODT、逆转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、DNTPS。逆转录反应液组分为250MMTRISHCLPH83、375MMKCL、15MMMGCL2、50MM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA。
31、酶的重组蛋白酶。0079实施例5胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备0080根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对、RNA提取试剂。扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；扩增GAPDH的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列。
32、为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。PCR缓冲液组分为25MMKCL、25MMMGCL2、200MMNH42SO4。RNA提取试剂包含TRIZOL、氯仿、异丙醇、75乙醇。0081实施例6胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备0082根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下SYBRGREEN聚合酶链式反应体系、扩增CR2基因和。
33、GAPDH基因的引物对、MMLV逆转录体系、RNA提取试剂。扩增CR2基因的正向引物序列为5TCTAATATCAGCAAGTCTCT3，反向引物序列为5TTCAGGCATCTCATAAGT3；扩增GAPDH的正向引物序列为5CTCTGGTAAAGTGGATATTGT3，反向引物序列为5GGTGGAATCATATTGGAACA3。SYBRGREEN聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、DNTPS、SYBRGREEN荧光染料。PCR缓冲液组分为25MMKCL、25MMMGCL2、200MMNH42SO4。MMLV逆转录体系组分为T重复寡核苷酸OLIGODT、逆转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑。
34、制剂、DNTPS。逆转录反应液组分为250MMTRISHCLPH83、375MMKCL、15MMMGCL2，50MMDTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的说明书CN104059984A7/7页9非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。RNA提取试剂包含TRIZOL、氯仿、异丙醇、75乙醇。0083上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。说明书CN104059984A1/2页1000010002序列表CN104059984A102/2页11序列表CN104059984A111/1页12图1说明书附图CN104059984A12。