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1、10申请公布号CN104059952A43申请公布日20140924CN104059952A21申请号201410309627522申请日20140701C12P17/1220060171申请人尚科生物医药（上海）有限公司地址201318上海市浦东新区蓝靛路1199号1号楼72发明人竺伟王波张启鹏吴会李兵豪54发明名称固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法57摘要本发明公开了一种固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法，所述方法包括如下步骤将固定化全细胞组合物、N叔丁氧羰基3哌啶酮、辅因子、缓冲液和葡萄糖按一定比例混合，在PH58、温度为2045下反应，经后处。
2、理得到所述产物。与现有技术相比，本发明所采用的方法具有成本低、操作方便和催化剂可回收利用的优点，具有极大的工业应用价值。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104059952ACN104059952A1/1页21一种固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法，其特征在于将固定化全细胞组合物、N叔丁氧羰基3哌啶酮、辅因子、缓冲液和葡萄糖按一定比例混合，在PH58、温度为2045下反应得到产物。2如权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定化全细胞组合物为酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定。
3、比例混合并经固定化处理后的组合物。3如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酮还原酶全细胞和所述葡萄糖脱氢酶全细胞的组合比例为10111，其中优选为102。4如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述酮还原酶全细胞和所述葡萄糖脱氢酶全细胞由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。5如权利要求1所述的方法，其特征在于反应中所述固定化全细胞浓度为5100克/升、所述N叔丁氧羰基3哌啶酮的浓度10250克/升、所述辅因子浓度为00011克/升、所述缓冲液的浓度为1毫摩尔/升1摩尔/升、所述的葡萄糖的浓度为10200克/升。6如权利要求1所述的方法，其特征在于所述辅因。
4、子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。7如权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。8如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化全细胞组合物的制备方法为将酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型。9如权利要求8所述的方法，其特征在于所述酮还原酶全细胞和所述葡萄糖脱氢酶全细胞与所述固定剂的比例为1112。10如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述固定剂为选自聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙的一种或它们的组合。权利要求书CN104059952A1/。
5、4页3固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法技术领域0001本发明属于制药工业生物技术领域，具体涉及一种固定化全细胞组合物合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法。背景技术0002SN叔丁氧羰基3羟基哌啶是一个在医药领域具有重要应用价值的化合物，被广泛应用于镇痛、抗精神病和抗肿瘤等药物的合成。SN叔丁氧羰基3羟基哌啶是2013年上市的用于治疗罕见淋巴瘤药物依布鲁替尼IMBRUVICA的关键中间体。0003目前文献报道的制备SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法主要有化学拆分法和生物转化法。0004化学拆分法，如式1所示，工艺路线是将外消旋3羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到S3羟基哌。
6、啶的盐，然后游离、上保护基得到SN叔丁氧羰基3羟基哌啶。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。000500062009年，文献ORGANICLETTERSVOL11,NO6,12451248，报道了一种生物转化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法，其合成路线如式2所示。该方法是利用磨碎的野生胡萝卜根为生物催化剂，将N叔丁氧羰基3哌啶酮还原得到SN叔丁氧羰基3羟基哌啶，该方法存在难以获得大量生物催化剂及产物光学纯度不高等问题，反应效率太低、生产成本过高，难以产业化应用。00070008此外，我们在申请号为2013105962662的专利申请中公开了一种生物酶催化制备R或SN叔丁氧羰基3羟。
7、基哌啶的方法，具体工艺路线如式3所示。0009说明书CN104059952A2/4页40010该方法所用的生物酶为冻干粉，存在酶粉价格高和后处理繁琐等问题，生产成本较高、难以产业化应用。发明内容0011为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明公开了一种固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的方法。0012具体工艺路线如下所示00130014为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下将按一定比例混合并经固定化处理的酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞组合物、N叔丁氧羰基3哌啶酮、辅因子、缓冲液和葡萄糖混合，在PH58、温度为2545下反应148小时；反应混合液中固定化全细胞湿重浓度为。
8、5100克/升，N叔丁氧羰基3哌啶酮的浓度10250克/升，辅因子浓度为00011克/升；缓冲液的浓度为1毫摩尔/升1摩尔/升；葡萄糖的浓度为10200克/升；反应结束后过滤回收固定化全细胞；滤液用有机溶剂萃取、浓缩和结晶得到纯度大于99、光学纯度大于99的目标产物。0015进一步说，所述的酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞的比例为10111，其中优选为102。0016进一步说，所述辅因子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。0017进一步说，所述固定化全细胞制备方法为将酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型。001。
9、8进一步说，所述固定剂为聚乙二醇，聚丙烯酰胺，聚乙烯醇或海藻酸钙中的一种或说明书CN104059952A3/4页5它们地组合，其中优选为聚乙烯醇。0019进一步说，所述全细胞与所述固定剂的重量比为1112。0020进一步说，所述酮还原酶全细胞选自市场上可以购得的KRED101KRED250全细胞尚科生物医药上海有限公司，优选KRED198全细胞；所述的葡萄糖脱氢酶全细胞为市场上可以购得的GDH101GDH106全细胞尚科生物医药上海有限公司，优选为GDH104全细胞。0021进一步说，所述酮还原酶和葡萄糖脱氢酶是由基因工程菌通过发酵得到，所述因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。0。
10、022进一步说，所述固定化全细胞组合物经过滤后可以回收套用，套用次数为110次。0023与现有技术相比，本发明利用固定化全细胞组合物催化合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶。该方法生产成本较低，固定化全细胞容易与反应液分离，操作方便，催化剂可回收利用，产物收率及光学纯度高，具有良好的应用价值。具体实施方式0024下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。0025实施例10026一、固定化全细胞组合物的制备0027室温下，将600克聚乙烯醇加入35升的水中，升温至9095，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至2530；向上述溶液中加入。
11、300克KRED198全细胞尚科生物医药上海有限公司和100克葡萄糖脱氢酶GDH104全细胞尚科生物医药上海有限公司，混匀后搅拌1小时；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30干燥1015小时；移入01MNA2SO4溶液稳定2小时，滤干并用清水洗涤两次，得到16公斤固定化细胞组合物。0028二、SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的合成0029向20升带夹套的玻璃反应釜中加入15升事先配好的PH7的100毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液、26公斤葡萄糖、1公斤固定化全细胞和1克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，搅拌均匀后，加入2公斤N叔丁氧羰基3哌啶酮，反应过程中用10氢氧化钠水。
12、溶液控制反应液为PH58，30搅拌6小时，HPLC显示转化率大于98；过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到188公斤淡黄色液体；粗品加入10公斤正己烷，在05搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品175公斤，纯度998，光学纯度995，收率88。0030实施例20031一、固定化全细胞组合物的制备0032室温下，将300克聚乙二醇溶解在35升的水中，后向溶液中加入500克聚乙烯醇，升温至9095，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至2530；向上述溶液中加入300克KRED198全细胞尚科生物医药上海有限公司和100G葡萄糖脱氢酶GDH104全细胞尚科生物医药上海有限公司，混匀后搅拌1小时；用蠕。
13、动泵和塑料排枪吸说明书CN104059952A4/4页6取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30干燥1015小时；移入01MNA2SO4溶液稳定2小时，滤干并用清水洗涤两次，得到16公斤固定化细胞组合物。0033二、SN叔丁氧羰基3羟基哌啶的合成0034向20升带夹套的玻璃反应釜中加入15升事先配好的PH7的100毫摩尔/升的三乙醇胺缓冲液、26公斤葡萄糖、12公斤固定化细胞组合物和1克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，搅拌均匀后，加入2公斤N叔丁氧羰基3哌啶酮，反应过程中用10氢氧化钠水溶液控制反应液为PH80，42搅拌10小时，HPLC显示转化率大于98；过滤除去固定化细胞，。
14、待下一批套用；滤液用甲苯3公斤3萃取，合并有机层，减压浓缩甲苯得到192公斤淡黄色液体；加入10升正己烷，在05搅拌析出白色固体，真空干燥得产品180公斤，纯度998，光学纯度995，收率91。0035实施例30036用回收固定化细胞合成SN叔丁氧羰基3羟基哌啶0037向20升带夹套的玻璃反应釜中加入15升事先配好的PH7的100毫摩尔/升的三乙醇胺缓冲液、26公斤葡萄糖、12公斤实施例2中回收的固定化细胞组合物和1克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，搅拌均匀后，加入2公斤N叔丁氧羰基3哌啶酮，反应过程中用10氢氧化钠水溶液控制反应液为PH80，40搅拌10小时，HPLC显示转化率大于98；过滤，滤液用甲苯3公斤3萃取，合并有机层，减压浓缩甲苯得到180公斤淡黄色液体；加入10升正己烷，在05搅拌析出白色固体，真空干燥得产品167公斤，纯度996，光学纯度994，收率84。说明书CN104059952A。