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1、10申请公布号CN104208660A43申请公布日20141217CN104208660A21申请号201410394456022申请日20140812A61K38/18200601A61P1/1620060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号72发明人邵建忠潘若浪项黎新王萍刘小园74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟李世玉54发明名称低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2的应用57摘要本发明公开了一种低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2在制备抗肝脏纤维化药物中的应用；本发明低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2。
2、能够抑制HSCS活化标志基因平滑肌肌动蛋白SMA和型胶原COLI1表达，进而能够抑制肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表1页附图2页10申请公布号CN104208660ACN104208660A1/1页21一种低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2在制备抗肝脏纤维化药物中的应用。2如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为注射剂。3如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为口服制剂。4如权利要求1所述的应用，其特征在于低分子量碱性成纤维细胞生长因子LM。
3、WFGF2的剂量为40100G/KG体重。权利要求书CN104208660A1/3页3低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2的应用一技术领域0001本发明涉及一种低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2的应用，特别涉及在制备抗肝脏纤维化药物中的应用。二背景技术0002肝纤维化和肝硬化是肝炎、肝代谢性疾病等慢性肝脏疾病的主要病理特征，严重威胁健康和生命，是人类面临的重大医学难题。在我国，乙型肝炎尤其是慢性活动性乙型肝炎患者中，1015的患者可能在510年内发展为肝炎后肝硬化。在“慢性肝损伤肝纤维化肝硬化”的慢性肝病发展过程中，肝纤维化的防治是关键，但对此目前仍缺乏行之有效的方法。因此开。
4、发有效的抗肝纤维化治疗药物和手段显得十分迫切。0003肝脏纤维化通常源于肝组织中胞外基质积聚和降解失衡，胶原等基质成分过度积累，而在此过程中，肝星状细胞HSCS发挥了关键作用。正常情况下HSCS静息于肝内窦状间隙中，是一类具有脂肪性质的细胞，受到肝损伤信号刺激，该类细胞丢失脂肪性质，活化为具有一定伸缩性的成肌纤维样母细胞，并向肝实质中迁移，同时表达细胞骨架蛋白SMA并大量分泌型胶原等胞外基质，最终导致肝脏纤维化发生。因此，抑制HSC活化将是抗肝纤维化治疗的有效策略。0004成纤维细胞生长因子2是成纤维细胞生长因子家族中的一员，因为成纤维细胞生长因子2的等电点96在溶液中位于碱性PH范围内，故又。
5、叫碱性成纤维细胞生长因子。成纤维细胞生长因子2对间充质细胞、神经来源和上皮来源的细胞具有有丝分裂促进活性的作用，还可以增加人骨髓间质干细胞的体外增殖能力，在体内、体外均有明显的促进新生血管形成作用，对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞具有强烈的有丝分裂作用，促进血管平滑肌细胞增殖和迁移作用，对新生血管形成过程中的多个环节如毛细血管底膜降解、内皮细胞迁移增殖、胶原合成及小血管腔形成等均有明显的促进作用。0005现有研究表明，碱性成纤维细胞生长因子对平滑肌细胞前胶原基因1IMRNA表达明显增强参见周玉杰等碱性成纤维细胞生长因子对血管平滑肌细胞及内膜损伤后血管及型胶原MRNA表达的影响基础研究1998年2。
6、月。此外，还有研究表明，将BFGF碱性成纤维细胞生长因子与SAM在肝纤维化中表达情况进行相关性分析，可以看出B表达强度与SAM表达强度正相关，研究发现库普弗细胞、肝纤维化附近炎症细胞、内皮细胞等产生并释放大量的BFGF有助于HSC的分裂和增殖，增强HSC的游走性，而HSC的激活即转化为肌成纤维细胞，表达SAM并合成大量的细胞外基质，从而推动肝纤维化不断向前发展，说明BFGF在促进细胞外基质产生中具有重要作用，二者在促进肝纤维化演变过程中具有协同功效参见刘燕超等碱性成纤维细胞生长因子和平滑肌肌动蛋白与慢性乙型肝炎病理分期的相关性临床荟萃2008年7月5日，第23卷第13期。到目前为止，低分子量碱。
7、性成纤维细胞生长因子LMWFGF2对肝脏纤维化的作用仍不清楚。三发明内容说明书CN104208660A2/3页40006本发明目的是提供一种低分子量碱性成纤维细胞生长因子简称LMWFGF2能够抑制HSCS活化标志基因平滑肌肌动蛋白SMA和型胶原COLI1表达的新用途，进而能够抑制肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化。0007本发明采用的技术方案是0008本发明提供一种低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2在制备抗肝脏纤维化药物中的应用。0009进一步，所述的药物为注射剂、口服制剂或其它形式本领域公知的药物形式。0010进一步，LMWFGF2的实际用法和用量如下将LMWFGF2溶于IMDM培养液。
8、中，然后按照40100GLMWFGF2/KG体重的剂量进行静脉注射优选60GLMWFGF2/KG体重。一般情况下，每50G的LMWFGF2溶解于33ML的IMDM培养液中。0011本发明所述LMWFGF2能够抑制肝纤维化，表现在体内导入LMWFGF2能够显著抑制HSCS活化标志基因平滑肌肌动蛋白SMA和型胶原COLI1表达，并降低肝脏中胶原特征性氨基酸羟脯氨酸含量，表明LMWFGF2能够抑制肝脏胶原沉积，是抗纤维化治疗的有效制剂。0012在本发明中，低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF218KDA可通过市购方式获得。0013本发明利用CCL4诱导的慢性肝纤维化小鼠模型，首次证明通过尾静脉。
9、注射LMWFGF2能够显著抑制HSC活化、降低肝纤维化程度。0014与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明低分子量碱性成纤维细胞生长因子LMWFGF2能够抑制HSCS活化标志基因平滑肌肌动蛋白SMA和型胶原COLI1表达，进而能够抑制肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化，注射LMWFGF2能够显著抑制HSC活化、降低肝纤维化。四附图说明0015图1是注射LMWFGF2后肝星状细胞活化标志检测图；图1中，CCL4、MEDIUM和LMWFGF2分别表示CCL4损伤组、CCL4损伤后注射IMDM培养液购自CORNING公司的对照组、CCL4损伤后注射LMWFGF2的实验组。表示实验组与CCL4损。
10、伤组比较差异显著P005。左图代表SMA平滑肌肌动蛋白MRNA表达变化，右图代表COLI1型胶原MRNA表达变化。0016图2是注射LMWFGF2后天狼猩红染色检测肝脏纤维化图；图2中，CCL4、MEDIUM和LMWFGF2分别表示CCL4损伤组、CCL4损伤后注射IMDM培养液的对照组、CCL4损伤后注射LMWFGF2的实验组。A，肝组织天狼猩红染色；B，对着色阳性面积进行统计的结果。表示实验组与CCL4损伤组比较差异极显著P001。BAR50M。0017图3是注射LMWFGF2后羟脯氨酸含量检测图；图3中CCL4、MEDIUM和LMWFGF2分别表示CCL4损伤组、CCL4损伤后注射IMD。
11、M培养液的对照组、CCL4损伤后注射LMWFGF2的实验组。表示实验组与CCL4损伤组比较差异显著P005。五具体实施方式0018下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于说明书CN104208660A3/3页5此0019实施例1慢性肝损伤小鼠模型制备0020利用10体积浓度四氯化碳溶剂为橄榄油对八周鼠龄的C57BL/6J小鼠体重约30克诱导化学肝损伤，每只小鼠腹腔注射025ML10CCL4，每周2次，连续注射4周，建立肝纤维化模型，注射后的小鼠在无菌环境下正常饲喂。0021实施例2LMWFGF2抑制HSC活化、降低肝脏纤维化0022LMWFGF2试剂将LMWFGF。
12、2购自PEPROTECH溶于IMDM培养液购自CORNING公司中，每50G的LMWFGF2溶解于33ML的IMDM培养液中。0023如实施例1所述的连续注射CCL44周小鼠，按60G/KG体重剂量对实验组小鼠尾静脉注射LMWFGF2，另外取对照组注射IMDM培养液，每周2次，注射1周。期间所有小鼠继续按实施例1所述方法进行CCL4肝损伤，最后一次注射LMWFGF2的3天后，取小鼠肝脏组织，一部分用TRIZOLINVETIGEN提取总RNA，提取方法按说明书进行，然后用逆转录试剂盒RNAPCRKITAMVVER30TAKARA进行逆转录。REALTIMEPCR检测检测肝星形细胞活化的标志性基因。
13、SMA和COLI1表达，PCR反应体系按照PREMIXEXTAQTMKITTAKARA说明书配制，按如下条件在EPREALPLEX荧光定量PCR仪EPPENDORF上进行反应95预变性4MIN；95变性30S，60退火20S，68延伸20S，共35个循环。每次实验重复三次。总MRNA的量以ACTIN作为内参，2CT法定量统计结果。0024一部分肝组织用羟脯氨酸检测试剂盒南京建成生物工程研究所测定羟脯氨酸含量，方法按说明书进行；另一部分肝脏石蜡包埋后进行组织切片，切片厚度5M，天狼猩红染色，直观展示纤维化程度，并对阳性面积进行统计。上述PCR引物分别是0025SMA,GGGAGTAATGGTTG。
14、GAATGGSENSE0026GGCAGTAGTCACGAAGGAATAGANTISENSE，0027COLI1,AACTTTGCTTCCCAGATGTCCTSENSE0028TCGGTGTCCCTTCATTCCAGANTISENSE，由上海英俊公司合成。0029结果表明，LMWFGF2注射组小鼠肝星状细胞活化标志SMA和COLI1表达显著下降，表明肝星状细胞活化受到抑制如图1所示，天狼猩红染色证明肝脏纤维化程度明显得到改善如图2所示，羟脯氨酸检测进一步证明LMWFGF2注射组小鼠胶原沉积显著下降如图3所示。由此说明尾静脉注射LMWFGF2能够有效抑制肝星状细胞活化、降低肝脏纤维化。0030最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书CN104208660A1/1页60001序列表CN104208660A1/2页7图1图2说明书附图CN104208660A2/2页8图3说明书附图CN104208660A。