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1、10申请公布号CN104056280A43申请公布日20140924CN104056280A21申请号201410262864022申请日20140613A61K48/00200601A61K39/00200601A61K47/36200601A61K47/44200601A61K47/02200601A61K47/20200601A61P31/0420060171申请人河南科技大学地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路48号72发明人宫强孔梁宇侯颖牛明福孙军杰74专利代理机构洛阳公信知识产权事务所普通合伙41120代理人罗民健54发明名称禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制。
2、备方法57摘要禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，涉及疫苗的制备方法；根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增PTFA基因的两条引物，PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因；采用限制性核酸内切酶BAMH和XHOL酶切禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因和PCDNA31质粒，然后构建禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒；然后依次加入硫酸钠、无水醋酸钠、月桂基硫酸钠、氯化钙等物质，混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗。本发明方法制备的疫苗不含有活的病原菌，给动物应用后不会由于疫苗本身的原因而引发禽多杀性巴氏杆菌病，免疫保护率为达到85，而且该疫苗的本质是。
3、含重组质粒的纳米颗粒，因此易于保存和运输。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页10申请公布号CN104056280ACN104056280A1/2页21禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其特征在于具体制备方法为步骤一、禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的获得1、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增PTFA基因的两条引物PL和PU，其基因序列如序列表序列1和序列2PU5TGCGGATTCATGAAAAAAGCCATTTTC3PL5TGACCTCGAGTTATGCGCAAAATCC。
4、T3；2、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100200PMOL/ML的禽多杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、DDNTPS25微升、TAQDNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲液2微升和水115微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的基因序列如序列表序列3；3、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的PCR反应管中依次加入限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合均匀后将PCR反应管放置于37的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65的水浴锅中5分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌PT。
5、FA基因，将其保存于20条件下，备用；步骤二、PCDNA31质粒的处理向05毫升的离心管中依次加入PCDNA31质粒5微升、限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各25微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管放置于37的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65的水浴锅中5分钟，得到处理后的PCDNA31质粒，备用；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒的制备1、依次向05毫升的离心管中加入处理后的PCDNA31质粒1微升、酶切后禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因7微升、T4DNA连接酶1微升和T4DNA连接酶缓冲液1微升，混合均匀后将离心管放置于16的水浴锅中反应8小时，取出备用；。
6、2、将上述备用的05毫升离心管中的液体移入15毫升的离心管中，再加入100微升大肠杆菌JM83，混合均匀后依次放置于0条件下30分钟、42条件下1分钟和0条件下2分钟，然后向离心管中加入08毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37的恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入01毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37的恒温培养箱内培养12小时；3、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的大肠杆。
7、菌液体培养基中，置于转速为180转/分钟，温度为37的恒温摇床内振荡培养12小时，备用；4、取上述培养后的菌液06毫升，向其中加入03毫升苯酚和03毫升氯仿，混合均匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的离心管中，再向其中加入12毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升无菌水溶解沉淀后备用；权利要求书CN104056280A2/2页35、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到05毫升的离心管中，再依次加入限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各1微升、限。
8、制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微升，混合均匀后放置于37的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定产物中的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒，测得其浓度，并以无菌水将其调整到01毫克/毫升，备用；步骤四、禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备1、取浓度为01毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒05毫升加入15毫升的离心管中，向其中加入071毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55的水浴锅中保温20分钟，备用；2、称取无水醋酸钠41毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节PH值为56，再向试管中加入壳聚糖02克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55的水浴锅中。
9、保温20分钟，随后吸取试管中的05毫升液体加入到上述步骤（1）保温后的15毫升离心管中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温下放置1小时，备用3、再依次向上述步骤（2）备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙，待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入01毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗。2如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其特征在于所述PCR反应程序为首先95预变性3分钟，然后进入循环程序，循环程序为94变性1分钟，53复性30秒，72延伸30秒。
10、，将上述循环程序重复25次后再以72终延伸5分钟结束PCR反应。3如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其特征在于采用分光光度计测定禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒的浓度。4如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其特征在于所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比配置，其中蛋白胨1，酵母浸膏05，氯化钠1，余量为水；所述的固体培养平板的组成成分按重量百分比配置，其中蛋白胨1，酵母浸膏05，氯化钠1，琼脂粉18，余量为水。权利要求书CN104056280A1/6页4禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗。
11、的制备方法技术领域0001本发明涉及一种DNA疫苗，具体的说是禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法。背景技术0002禽多杀性巴氏杆菌病，是由禽多杀性巴氏杆菌引起的主要侵害鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽和野禽类的一种接触性败血性传染病,以发热、腹泻、呼吸困难为特征，最急性病例死亡迅速。是严重影响我国养禽业发展的主要细菌病之一，也是一种目前尚无很好的预防方法而又造成重大经济损失的禽类疾病。0003目前我国用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的商业化疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种，其中弱毒活疫苗是我国所有禽类传染病弱毒活疫苗中研究最多的一类。该类疫苗虽然能在一定程度上预防该病的发生，但也存在。
12、安全性较差，副作用偏大等问题，应用不当甚至可能引起禽多杀性巴氏杆菌病的爆发。而禽多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的免疫效果尚且不如弱毒活疫苗，所以必需研制更加有效的禽多杀性巴氏杆菌病疫苗以预防该病。发明内容0004本发明针对上述问题提供了一种可用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，该疫苗制备方法较为简单，操作方便，以该方法制备的疫苗能够有效的防止禽多杀性巴氏杆菌病对鸡的伤害。0005本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其具体制备方法包括以下步骤步骤一、禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的获得1。
13、、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增PTFA基因的两条引物PL和PU，其基因序列如序列表序列1和序列2PU5TGCGGATTCATGAAAAAAGCCATTTTC3PL5TGACCTCGAGTTATGCGCAAAATCCT3；2、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100200PMOL/ML的禽多杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、DDNTPS25微升、TAQDNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲液2微升和水115微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的基因序列如序列表序列3；所述PCR反应程序为首先95预变性3分钟，然后进入循。
14、环程序，循环程序为94变性1分钟，53复性30秒，72延伸30秒，将上述循环程序重复25次后再以72终延伸5分钟结束PCR反应。00063、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的PCR反应管中依次加入限制性核说明书CN104056280A2/6页5酸内切酶BAMH和XHOL各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合均匀后将PCR反应管放置于37的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65的水浴锅中5分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因，将其保存于20条件下，备用；步骤二、PCDNA31质粒的处理向05毫升的离心管中依次加入PCDNA31质粒5微升、限制性核酸内切酶B。
15、AMH和XHOL各25微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管放置于37的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65的水浴锅中5分钟，得到处理后的PCDNA31质粒，备用；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒的制备1、依次向05毫升的离心管中加入处理后的PCDNA31质粒1微升、酶切后禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因7微升、T4DNA连接酶1微升和T4DNA连接酶缓冲液1微升，混合均匀后将离心管放置于16的水浴锅中反应8小时，取出备用；2、将上述备用的05毫升离心管中的液体移入15毫升的离心管中，再加入100微升大肠杆菌JM83，混合均匀后依次放置于0条件下30分钟、42条件。
16、下1分钟和0条件下2分钟，然后向离心管中加入08毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37的恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入01毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37的恒温培养箱内培养12小时；3、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中，置于转速为180转/分钟，温度为37的恒温摇床内振荡培养12小时，备用；4、取上述培养后的菌液06毫升，向其中加入03毫升苯酚。
17、和03毫升氯仿，混合均匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的离心管中，再向其中加入12毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升无菌水溶解沉淀后备用；5、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到05毫升的离心管中，再依次加入限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微升，混合均匀后放置于37的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定产物中的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒，采用分光光度计测定其浓度，并以无。
18、菌水将其调整到01毫克/毫升，备用；步骤四、禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备1、取浓度为01毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒05毫升加入15毫升的离心管中，向其中加入071毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55的水浴锅中保温20分钟，备用；2、称取无水醋酸钠41毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节PH值为56，再向试管中加入壳聚糖02克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55的水浴锅中保说明书CN104056280A3/6页6温20分钟，随后吸取试管中的05毫升液体加入到上述步骤（1）保温后的15毫升离心管中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温。
19、下放置1小时，备用3、再依次向上述步骤（2）备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙，待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入01毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗。0007所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比配置，其中蛋白胨1，酵母浸膏05，氯化钠1，余量为水；所述的固体培养平板的组成成分按重量百分比配置，其中蛋白胨1，酵母浸膏05，氯化钠1，琼脂粉18，余量为水。0008所述大肠杆菌JM83和禽多杀性巴氏杆菌也可通过市场购买得到。0009有益效果是1、本发明所用的基因是禽多杀性巴氏杆菌。
20、的PTFA基因，该基因是禽多杀性巴氏杆菌的主要保护性抗原基因之一，该基因编码的抗原可诱导动物机体产生较强的免疫应答水平和保护效果。本发明所选用的壳聚糖是迄今为止人们发现的自然界中唯一带正电荷的碱性多糖，该碱性多糖可包裹带负电荷的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒形成紧密结合的纳米颗粒复合物即禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗，进入动物机体后可通过表面多余的阳离子电荷与动物细胞表面的阴离子粘蛋白结合，被吞噬入细胞，转入细胞核内表达，同时，禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒被壳聚糖分子包裹后可抵抗动物体内源性DNA酶的降解，增强缓释控释作用，提高免疫效果。00102、本发明制备的禽多杀性。
21、巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗除含有壳聚糖外，还添加有月桂基硫酸钠、氯化钙和玉米胚芽油。其中的月桂基硫酸钠进入动物机体后可激活动物机体的特异性和非特异性免疫应答反应，增强抗原提呈细胞对疫苗的加工和提呈；氯化钙可增加动物细胞膜的通透性，有利于疫苗中的DNA分子进入细胞内；玉米胚芽油可与壳聚糖纳米DNA疫苗相融合，有利于疫苗的缓慢释放，从而不断地刺激动物机体的免疫系统，延长疫苗的免疫持续期，因此，本发明将月桂基硫酸钠、氯化钙、玉米胚芽油与壳聚糖联合应用有利于增强动物机体对疫苗的免疫应答反应，提高疫苗的免疫保护效果。00113、利用本发明方法制备的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DN。
22、A疫苗不含有活的病原菌，给动物应用后不会由于疫苗本身的原因而引发禽多杀性巴氏杆菌病，免疫保护率为达到85，而且该疫苗的本质是含重组质粒的纳米颗粒，因此易于保存和运输。附图说明0012图1是本发明所获得的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的琼脂糖凝胶电泳图；图2是本发明禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒的双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；图中标记是M、DL5000MARKER，1、禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因，2、双酶切后的PCDNA31质粒。具体实施方式0013禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其具体制备方法包括以下步骤说明书CN104056280A4/6页7步骤一、禽多杀性巴氏杆。
23、菌PTFA基因的获得1、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增PTFA基因的两条引物PL和PU，其基因序列如序列表序列1和序列2PU5TGCGGATTCATGAAAAAAGCCATTTTC3PL5TGACCTCGAGTTATGCGCAAAATCCT3；2、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100200PMOL/ML的禽多杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、DDNTPS25微升、TAQDNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲液2微升和水115微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的基因序列如序列表序列3；所述PCR反应程序为首先95预。
24、变性3分钟，然后进入循环程序，循环程序为94变性1分钟，53复性30秒，72延伸30秒，将上述循环程序重复25次后再以72终延伸5分钟结束PCR反应。00143、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因的PCR反应管中依次加入限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合均匀后将PCR反应管放置于37的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65的水浴锅中5分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因，将其保存于20条件下，备用；步骤二、PCDNA31质粒的处理向05毫升的离心管中依次加入PCDNA31质粒5微升、限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各。
25、25微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管放置于37的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65的水浴锅中5分钟，得到处理后的PCDNA31质粒，备用；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒的制备1、依次向05毫升的离心管中加入处理后的PCDNA31质粒1微升、酶切后禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因7微升、T4DNA连接酶1微升和T4DNA连接酶缓冲液1微升，混合均匀后将离心管放置于16的水浴锅中反应8小时，取出备用；2、将上述备用的05毫升离心管中的液体移入15毫升的离心管中，再加入100微升大肠杆菌JM83，混合均匀后依次放置于0条件下30分钟、42条件下1分钟和0条件下。
26、2分钟，然后向离心管中加入08毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37的恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入01毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37的恒温培养箱内培养12小时；3、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中，置于转速为180转/分钟，温度为37的恒温摇床内振荡培养12小时，备用；4、取上述培养后的菌液06毫升，向其中加入03毫升苯酚和03毫升氯仿，混。
27、合均匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的离心管中，再向其中加入12毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10说明书CN104056280A5/6页8分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升无菌水溶解沉淀后备用；5、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到05毫升的离心管中，再依次加入限制性核酸内切酶BAMH和XHOL各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微升，混合均匀后放置于37的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定产物中的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒，采用分光光。
28、度计测定其浓度，并以无菌水将其调整到01毫克/毫升，备用；步骤四、禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备1、取浓度为01毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌PTFA重组质粒05毫升加入15毫升的离心管中，向其中加入071毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55的水浴锅中保温20分钟，备用；2、称取无水醋酸钠41毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节PH值为56，再向试管中加入壳聚糖02克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55的水浴锅中保温20分钟，随后吸取试管中的05毫升液体加入到上述步骤（1）保温后的15毫升离心管中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温下放置1小时，备用。
29、3、再依次向上述步骤（2）备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙，待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入01毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗。0015所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比配置，其中蛋白胨1，酵母浸膏05，氯化钠1，余量为水；所述的固体培养平板的组成成分按重量百分比配置，其中蛋白胨1，酵母浸膏05，氯化钠1，琼脂粉18，余量为水。0016所述大肠杆菌JM83和禽多杀性巴氏杆菌也可通过市场购买得到。本发明所使用的大肠杆菌JM83购买于华美生物工程有限公司；禽多杀性巴氏杆菌。
30、购买于中国兽医药品监察所。0017动物实验1、动物免疫取1日龄的未经任何处理且生长状况相同的雏鸡40只，正常饲养28天后，随机分为对照组和免疫组，每组各20只，免疫组的每只鸡均以禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗进行免疫，免疫的剂量为02毫升/只鸡，免疫方式为肌肉注射，共免疫三次，分别在饲养至第28天、第49天和第70天时进行免疫，对照组的鸡不进行任何免疫；2、攻毒试验在免疫组和对照组的鸡91日龄时，对两组的每只鸡均肌肉注射禽多杀性巴氏杆菌进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为101010个禽多杀性巴氏杆菌，随后将对照组和免疫组的鸡继续饲养2周，记录两组鸡在攻毒2周后的存活量，并计算出对照。
31、组和免疫组的保护率，存活率越高说明免疫预防效果越好，说明利用本发明的方法制备的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗具有免疫预防效果；对照组的保护率的计算方法如下（对照组的鸡在攻毒2周后仍然存活的数量/20）100；免疫组的保护率的计算方法如下说明书CN104056280A6/6页9（免疫组的鸡在攻毒2周后仍然存活的数量/20）100。0018结果显示，对照组的鸡在攻毒2周后全部死亡，对照组的保护率为0，免疫组的鸡在攻毒2周后存活17只，免疫组的保护率为85，说明利用本发明的方法制备出的禽多杀性巴氏杆菌PTFA基因壳聚糖纳米DNA疫苗能有效地预防禽多杀性巴氏杆菌病。说明书CN104056280A1/1页10图1图2说明书附图CN104056280A10。