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1、10申请公布号CN104056264A43申请公布日20140924CN104056264A21申请号201410262813822申请日20140613A61K39/102200601A61K39/39200601A61P31/0420060171申请人河南科技大学地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路48号72发明人宫强曲宁田野74专利代理机构洛阳公信知识产权事务所普通合伙41120代理人罗民健54发明名称禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法57摘要禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，属于疫苗领域；首先制备禽多杀性巴氏杆菌菌悬液，加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液。
2、体积的02025，637条件下静置2022小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活；取菊粉加入到灭活后的菌悬液中，加入量与菌悬液的质量比为0911；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗。本发明针对禽类多发性禽多杀性巴氏杆菌病设计，所制备的灭活疫苗对禽类多发性禽多杀性巴氏杆菌病具有较好的免疫预防效果，保护率达到90以上，安全性好，无不良反应。51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申。
3、请公布号CN104056264ACN104056264A1/1页21禽多杀性巴氏杆菌病菊粉灭活疫苗的制备方法，其特征在于具体制备方法包括以下步骤步骤一、采用接种环取禽多杀性巴氏杆菌菌种划线接种于TSA培养平板上，培养后取单菌落接种于禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，培养获得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液；步骤二、向上述步骤一培养所得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液体积的02025，混合均匀，3637条件下静置2022小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备取菊粉加入到上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中，加入量与禽多杀性巴氏杆菌。
4、菌悬液的质量比为0911；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗；所述的TSA培养平板的组成成分按重量百分比TSA培养平板中含有15的胰蛋白胨、05的大豆蛋白胨、05的氯化钠、15的琼脂粉，余量为水；所述的禽多杀性巴氏杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中含有1015的胰蛋白胨、0305的大豆蛋白胨、0405的氯化钠，余量为水。2如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述菊粉的加入量与禽多杀性巴。
5、氏杆菌菌悬液的质量比为11。3如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述硫柳汞的加入量为所得混合物体积的001。4如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的禽多杀性巴氏杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中含有15的胰蛋白胨、05的大豆蛋白胨、05的氯化钠，余量为水。权利要求书CN104056264A1/6页3禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法技术领域0001本发明涉及一种灭活疫苗，具体的说是禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法。背景技术0002禽霍乱是由禽多杀性巴氏杆菌（AVIANP。
6、ASTEURELLAMULTOCIDA）引起的一种家禽的接触性多发性传染病，又称为禽多杀性巴氏杆菌病。该病是我国禽类细菌性传染病中流行较为严重的一种，鸡群感染该病后具有较高的死亡率，其传染流行严重影响着我国禽类养殖业的健康发展，给我国养禽业造成了较大的经济损失，因此需要积极采取有效的措施控制该病。0003目前我国针对此病的控制仍然主要采取的是抗生素治疗的方法，常用的抗生素如磺胺类药物具有较好的治疗效果，然而抗生素的长期或反复应用会产生药物残留以及病原菌耐药性等问题。因此若要从源头上控制该病的传染流行，势必需要采取有效的预防措施。目前用于该病预防的疫苗主要包括弱毒活疫苗和以常规佐剂制备的灭活疫苗。
7、，如白油佐剂灭活疫苗、弗氏佐剂灭活疫苗等；然而，目前市售的禽多杀性巴氏杆菌病的弱毒活疫苗和灭活疫苗的免疫效果并不是特别理想，普遍存在免疫保护率偏低、副作用偏大等一系列问题，因此亟需研制更加有效的疫苗来预防该病。发明内容0004本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供了一种可用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，通过该方法制备出的疫苗，其制备方法简单，操作方便，而且能够有效的为免疫鸡提供抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力。0005本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，具体制备方法包括以下步骤步骤一、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的制备（1）。
8、、采用接种环取禽多杀性巴氏杆菌菌种划线接种于TSA培养平板上，倒置于恒温培养箱中3538条件下培养1820小时；然后采用接种环挑取上述TSA培养平板上的一个单菌落接种于46毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，然后置于3538恒温摇床内180200转/分钟振荡培养1618小时，得到禽多杀性巴氏杆菌菌液；（2）、从上述步骤（1）振荡培养1618小时后的禽多杀性巴氏杆菌菌液中取0506毫升菌液接种于5060毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，继续在3637恒温摇床内，180200转/分钟振荡培养24小时获得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液；步骤二、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活（1）、向上述步骤一培养所得禽多杀性巴。
9、氏杆菌菌悬液中加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液体积的02025，混合均匀，3637条件下静置2022小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活；说明书CN104056264A2/6页4（2）、采用接种环蘸取上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液接种于TSA培养平板上，3538条件下静置培养4648小时，培养结束后的TSA培养平板上无菌落生长，证明禽多杀性巴氏杆菌菌悬液灭活完全；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备取菊粉加入到上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中，加入量与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为0911；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全。
10、溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗。0006所述菊粉的加入量优选为，与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为11。0007所述硫柳汞的加入量优选为，所得混合物体积的001。0008所述的TSA培养平板的组成成分按重量百分比TSA培养平板中含有15的胰蛋白胨、05的大豆蛋白胨、05的氯化钠、15的琼脂粉，余量为水；所述的禽多杀性巴氏杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中含有1015的胰蛋白胨、0305的大豆蛋白胨、0405的氯化钠，余量为水。0009所述的禽多杀性巴氏杆菌液体培养基的组成成分优选为按重量。
11、百分比禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中含有15的胰蛋白胨、05的大豆蛋白胨、05的氯化钠，余量为水。0010所述禽多杀性巴氏杆菌为普通禽多杀性巴氏杆菌菌种，可通过市场购买得到。0011有益效果是1、本发明所用疫苗佐剂之一为菊粉，菊粉是一类常见的植物性多糖，是一种有效的补体替代激活途径的活化剂，给动物应用后可以激活动物机体的先天免疫系统，可以有效地诱导TH1型和TH2型免疫应答，而且菊粉在动物体内可以被代谢成简单的果糖和葡萄糖，因此不会伴随有任何局部或全身的毒性，是一种安全的免疫佐剂，以其制备的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗在应用时不会给禽类带来任何不良反应。传统的白油佐剂灭活疫苗需要分别制备水。
12、相和油相后再进行乳化，操作较为繁琐；而本发明以菊粉作为疫苗佐剂之一制备禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗时，只需将菊粉与灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌菌悬液按照11的比例混合，再加入3的果胶即可，操作方法简单易行，一般技术人员很容易掌握，适于大批量生产。00122、本发明所用另一疫苗佐剂为果胶，果胶是植物细胞壁的主要成分之一，是一种天然高分子化合物，具有良好的乳化稳定作用，以其作为佐剂有利于疫苗形态的稳定。而且因其具有广谱的免疫调节活性，所以与菊粉共同使用时两者可起到协同作用，可增强其激活巨噬细胞和自然杀伤细胞的能力以及提高免疫系统对抗原的识别能力，从而增强疫苗的免疫效果。00133、本发明工艺简。
13、单，成本低廉，适合工业化生产，用菊粉和果胶作为佐剂大大节省了成本；本发明针对禽类多发性禽多杀性巴氏杆菌病设计，所制备的的灭活疫苗对禽类多发性禽多杀性巴氏杆菌病具有较好的免疫预防效果，保护率达到90以上，安全性好，无不良反应。说明书CN104056264A3/6页5具体实施方式0014禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，具体制备方法包括以下步骤步骤一、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的制备（1）、采用接种环取禽多杀性巴氏杆菌菌种划线接种于TSA培养平板上，倒置于恒温培养箱中3538条件下培养1820小时；然后采用接种环挑取上述TSA培养平板上的一个单菌落接种于46毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中。
14、，然后置于3538恒温摇床内180200转/分钟振荡培养1618小时，得到禽多杀性巴氏杆菌菌液；（2）、从上述步骤（1）振荡培养1618小时后的禽多杀性巴氏杆菌菌液中取0506毫升菌液接种于5060毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，继续在3637恒温摇床内，180200转/分钟振荡培养24小时获得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液；步骤二、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活（1）、向上述步骤一培养所得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液体积的02025，混合均匀，3637条件下静置2022小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活；（2）、采用接种环蘸取上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液接。
15、种于TSA培养平板上，3538条件下静置培养4648小时，培养结束后的TSA培养平板上无菌落生长，证明禽多杀性巴氏杆菌菌悬液灭活完全；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备取菊粉加入到上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中，加入量与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为0911；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗。0015所述菊粉的加入量优选为，与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为11。0016所述硫柳汞的加入量优选为，所得混合物A体积的001。0。
16、017所述的TSA培养平板的组成成分按重量百分比TSA培养平板中含有15的胰蛋白胨、05的大豆蛋白胨、05的氯化钠、15的琼脂粉，余量为水；所述的禽多杀性巴氏杆菌液体培养基的组成成分按重量百分比禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中含有1015的胰蛋白胨、0305的大豆蛋白胨、0405的氯化钠，余量为水。0018所述的禽多杀性巴氏杆菌液体培养基的组成成分优选为按重量百分比禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中含有15的胰蛋白胨、05的大豆蛋白胨、05的氯化钠，余量为水。0019所述禽多杀性巴氏杆菌为普通禽多杀性巴氏杆菌菌种，可通过市场购买得到。0020以下实施例可使本专业技术人员全面理解本发明，但不以任何方式限制。
17、本发明；所述禽多杀性巴氏杆菌，购买自中国兽医药品监察所。0021实施例1禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，具体制备方法包括以下步骤步骤一、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的制备说明书CN104056264A4/6页6（1）、采用接种环取禽多杀性巴氏杆菌菌种划线接种于TSA培养平板上，倒置于恒温培养箱中37条件下培养20小时；然后采用接种环挑取上述TSA培养平板上的一个单菌落接种于5毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，然后置于3538恒温摇床内200转/分钟振荡培养16小时，得到禽多杀性巴氏杆菌菌液；（2）、从上述步骤（1）振荡培养16小时后的禽多杀性巴氏杆菌菌液中取05毫升菌液接种于50毫升禽。
18、多杀性巴氏杆菌液体培养基中，继续在37恒温摇床内，180转/分钟振荡培养24小时获得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液；步骤二、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活（1）、向上述步骤一培养所得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液体积的025，混合均匀，37条件下静置20小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活；（2）、采用接种环蘸取上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液接种于TSA培养平板上，3条件下静置培养48小时，培养结束后的TSA培养平板上无菌落生长，证明禽多杀性巴氏杆菌菌悬液灭活完全；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备取菊粉加入到上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中，加入。
19、量与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为11；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗；本实施例所制备的疫苗稳定性好，通过观察，其在1012个月内物理性状不会发生改变；并且其化学性状也无改变，通过动物实验检验验证，其免疫保护率维持稳定，同样可达到91。0022实施例2禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，具体制备方法包括以下步骤步骤一、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的制备（1）、采用接种环取禽多杀性巴氏杆菌菌种划线接种于TSA培养平板上，倒置于恒温培养箱中3。
20、8条件下培养19小时；然后采用接种环挑取上述TSA培养平板上的一个单菌落接种于6毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，然后置于3538恒温摇床内190转/分钟振荡培养18小时，得到禽多杀性巴氏杆菌菌液；（2）、从上述步骤（1）振荡培养18小时后的禽多杀性巴氏杆菌菌液中取06毫升菌液接种于60毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，继续在36恒温摇床内，180转/分钟振荡培养24小时获得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液；步骤二、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活（1）、向上述步骤一培养所得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液体积的02，混合均匀，36条件下静置22小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液。
21、的灭活；（2）、采用接种环蘸取上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液接种于TSA培养平板上，35条件下静置培养46小时，培养结束后的TSA培养平板上无菌落生长，证明禽多杀性巴氏杆菌菌悬液灭活完全；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备说明书CN104056264A5/6页7取菊粉加入到上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中，加入量与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为0951；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗；本实施例所制备的疫苗稳定性好，通过观。
22、察，其在1012个月内物理性状不会发生改变；且其化学性状也无变化，通过动物实验检验验证，其免疫保护率维持稳定，同样可达到90。0023实施例3禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法，具体制备方法包括以下步骤步骤一、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的制备（1）、采用接种环取禽多杀性巴氏杆菌菌种划线接种于TSA培养平板上，倒置于恒温培养箱中35条件下培养18小时；然后采用接种环挑取上述TSA培养平板上的一个单菌落接种于4毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，然后置于3538恒温摇床内180转/分钟振荡培养17小时，得到禽多杀性巴氏杆菌菌液；（2）、从上述步骤（1）振荡培养17小时后的禽多杀性巴氏杆菌菌液中。
23、取055毫升菌液接种于55毫升禽多杀性巴氏杆菌液体培养基中，继续在3637恒温摇床内，190转/分钟振荡培养24小时获得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液；步骤二、禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活（1）、向上述步骤一培养所得禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中加入甲醛，加入量为禽多杀性巴氏杆菌菌悬液体积的024，混合均匀，36条件下静置21小时完成禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的灭活；（2）、采用接种环蘸取上述灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液接种于TSA培养平板上，38条件下静置培养47小时，培养结束后的TSA培养平板上无菌落生长，证明禽多杀性巴氏杆菌菌悬液灭活完全；步骤三、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备取菊粉加入到上述。
24、灭活后的禽多杀性巴氏杆菌菌悬液中，加入量与禽多杀性巴氏杆菌菌悬液的质量比为091；混合均匀后再向其中加入所得混合物体积3的果胶，混合均匀后室温放置至果胶完全溶解，再向其中加入所得混合物体积0009001的硫柳汞，再次混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗。本实施例所制备的疫苗稳定性好，通过观察，其在1012个月内物理性状不会发生改变；且其化学性状也无变化，通过动物实验检验验证，其免疫保护率维持稳定，同样可达到90。0024疫苗检验动物实验1、动物的免疫取1日龄的未经过任何免疫的雏鸡共60只，饲养至4周龄时随机分为3组，每组20只，三组分别命名为A组、B组和C组；A组免疫本发明所制备的。
25、禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗、B组免疫不添加果胶的疫苗；C组为非免疫对照组不进行任何免疫；分别对A组和B组试验鸡群采取背部皮下接种的方式注射上述制备好的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗和不添加果胶的疫苗，共免疫三次，第一次免疫时间为4周龄，第二次免疫时间为7周龄，第三次免疫时间为10周龄，每次免疫的剂量均为每只鸡05毫升，所述不添加果胶的疫苗，其制备过程中除省去添加果胶的步骤，其余步骤和本发明禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗的制备方法完全相同。说明书CN104056264A6/6页800252、动物的攻毒在A组、B组和C组的试验鸡群饲喂至13周龄时，分别对三组的每只鸡均进行肌肉注射禽。
26、多杀性巴氏杆菌，进行攻毒，攻毒剂量为每只鸡注射11010个禽多杀性巴氏杆菌，攻毒之后，对疫苗免疫组和非免疫对照组的试验鸡群继续正常饲养14天，记录三组鸡在攻毒14天后的存活数，计算疫苗免疫组和非免疫对照组的保护率，疫苗免疫组的保护率越高则说明利用本发明的方法制备的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗具有越好的免疫预防效果；各组按照如下方法计算保护率（各组的鸡在攻毒14天后仍然存活的数量/20）100结果显示，A组的鸡在攻毒14天后仍存活18只，计算所得疫苗免疫组的保护率为90；B组的鸡在攻毒14天后仍存活16只，计算所得疫苗免疫组的保护率为80；C组的鸡在攻毒14天后全部死亡，计算所得C组的保护率为0，说明利用本发明的方法制备的禽多杀性巴氏杆菌病菊粉果胶灭活疫苗给鸡进行三次免疫之后能使被免疫鸡获得免疫保护，从而预防禽多杀性巴氏杆菌病；而不添加果胶的疫苗进行免疫保护率仅达到60，可见果胶和疫苗中的其他成份协同作用大大提高了疫苗的保护率。说明书CN104056264A。