一种无胆黑顺片或白附片及其炮制方法 【技术领域】
本发明涉及一种无胆黑顺片或白附片及其炮制方法， 属于药物领域。背景技术 附子为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaelii Debx. 的子根的加工品， 具有回 阳救逆， 补火助阳， 散寒止痛的功效， 用于亡阳虚脱， 肢冷脉微， 阳痿宫冷， 脘腹冷痛， 虚寒吐 泻， 阴寒水肿， 阳虚外感， 寒湿痹痛， 是一种重要的中药材。由于附子毒性剧烈， 古今医家为 了减其毒性、 提高临床疗效， 在其炮制工艺方法上尤为重视。附子作为常用中药材， 黑顺片 或白附片为其饮片在临床应用最为常见的规格之一。
黑顺片的传统炮制方法为 ： 取泥附子， 洗净， 浸入食用胆巴的水溶液中数日， 连同 浸液煮至透心， 捞出， 水漂， 纵切成厚约 0.5cm 的片， 再用水浸漂， 用调色液使附片染成浓茶 色， 取出， 蒸至出现油面、 光泽后， 烘至半干， 再晒干或继续烘干。 附子经水漂后， 通过蒸煮的 加热处理， 使其毒性成分双酯型生物碱水解变成毒性较小的单酯型生物碱， 既破坏了毒性 成分， 又不影响其强心成分， 达到了减毒作用的同时保证了临床疗效。[ 卢楠 . 附子炮制工 艺方法浅析 .《实用中医内科杂志》 .2010， 24 ： 98-100]
白附片的传统炮制方法为 ： 选择大小均匀的泥附子， 洗净， 浸入食用胆巴的水溶 液中数日， 连同浸液煮至透心， 捞出， 剥去外皮， 纵切成厚约 0.3cm 的片， 用水浸漂， 取出， 蒸 透， 晒干， 习称 “白附片” 。
但是现代研究证明， 黑顺片或白附片加工过程中所用胆巴含大量的钙离子、 镁离 子、 氯离子和其他金属离子， 目前传统炮制方法中钙、 镁、 氯离子的含量大约分别为 ： 1.7％、 0.3％、 3.8％。 钙、 镁离子对胃有强烈的腐蚀作用， 使人体器官的蛋白质凝固， 而且镁离子被 吸收后能抑制心血管和神经系统， 对人具有较大的毒性。虽然泥附子经胆巴浸泡后要流水 褪胆 5 ～ 6 次， 但也不可能褪胆完全， 更有不法分子， 在附片中大量灌入胆巴而使附片增重。 因此， 由传统炮制方法制备的黑顺片或白附片毒副作用较大， 在安全性上存在一定的隐患。
近年来虽然许多学者进行了不断探索， 采用新技术改进附子的加工工艺。如刘惠 茹等采用均匀实验设计方法， 优化出最佳炮制工艺为鲜附子加 0.1 ％胆巴， 加水煎煮 3 小 时， 漂 2 天， 蒸 2 小时， 炮制时间可缩短 8 天 ； 胡素梅等采用饱和食盐水代替胆巴液炮制附 子， 该作者认为附子必须经过长时间浸泡才能降低其毒性 ； 上述方法制备工艺复杂， 对设备 的要求高， 而且这些加工工艺都没有经过大生产的验证， 不能满足大生产需求。
发明内容 本发明的技术方案是提供了一种无胆黑顺片或白附片的炮制方法， 它在炮制过程 中未加入胆巴。本发明的另一技术方案是提供了该炮制方法制备的无胆黑顺片或白附片。
本发明提供了一种无胆黑顺片或白附片的炮制方法， 它包括以下步骤 ：
a、 取新鲜的泥附子， 洗净 ； 中火保持沸腾煮 10-20min ；
b、 切 片， 浸 漂 20-30min， 漂 至 切 片 表 面 无 粘 性， 在 105 ℃ -110 ℃ 温 度， 常压蒸
2-10h ； c、 烘干， 即得。
其中， b 步骤所述的蒸制时间为 8h。
其中， c 步骤所述的干燥方法为 40℃ -70℃烘干 17h-73h。
其中， c 步骤所述的干燥方法为 55℃烘干 24h。
其 中， 所述的无胆白附片的炮制方法为 ： 煮 后 剥 去 外 皮、 切纵片厚度为 0.3cm-0.5cm。
其 中， 所述的无胆黑顺片的炮制方法为： 煮 后 不 剥 皮、 切 纵 片， 厚度为 0.3cm-0.5cm。
本发明还提供了所述的炮制方法制备的无胆黑顺片或白附片。
它 含 有 单 酯 型 生 物 碱 以 苯 甲 酰 新 乌 头 原 碱 (C31H43NO10)、 苯甲酰乌头原碱 (C32H45NO10) 和苯甲酰次乌头原碱 (C31H43NO9) 的总量计， 不得少于 0.010 ％ ； 含双酯型生物 碱以新乌头碱 (C33H43NO10)、 次乌头碱 (C32H45NO10) 和乌头碱 (C33H43NO11) 的总量计， 不得过 0.020％。 它含有钙离子不高于 0.5％ w/w， 镁离子不高于 0.2％ w/w， 氯离子不高于 0.5％ w/ w。它含有钙离子 0.01％～ 0.5％ w/w， 镁离子 0.01％～ 0.2％ w/w， 氯离子 0.01％～ 0.5％ w/w。
本发明黑顺片或白附片的炮制方法， 不经过浸泡， 常温常压处理的附子其生物碱 含量也符合 2010 年版 《中国药典》 的规定。采用本发明提供的炮制方法制备的无胆黑顺片 或白附片， 由于在炮制过程中没有加入食用胆巴， 故此炮制品与传统黑顺片、 白附片相比大 大降低了其中钙离子、 镁离子、 氯离子和其他金属离子的浓度， 降低了毒副作用， 同时将无 胆黑顺片、 白附片分别按 《中国药典》 2010 年版附子项下质量标准进行检测， 各项指标均能 达到药典要求， 表明炮制过程中不加食用胆巴的无胆黑顺片、 白附片可以达到与黑顺片、 白 附片相同的效果。 此外， 本发明还对无胆黑顺片或白附片中毒性成分双酯型生物碱、 重金属 及农药残留量进行了监测与控制， 为全面控制无胆黑顺片或白附片的质量与安全性提供了 保证。
附图说明 图 1 无胆附片药材图 ( 其中， A： 无胆黑顺片 ； B： 无胆白附片 )
图 2 无胆附片粉末显微图
图 3 无胆附片薄层图 (1 号为传统市场购买的附片， 2-11 号分别为渠县附子自制无 胆黑顺片、 白附片， 布拖附子自制无胆黑顺片、 白附片， 江油附子自制无胆黑顺片、 白附片按 (2010)， 江油附子自制无胆黑顺片、 白附片 (2011)， 江油附子自制无胆黑顺片、 白附片 ( 中 试 )， 12-14 号分别为苯甲酰新乌头碱、 苯甲酰乌头碱、 苯甲酰次乌头碱对照品 )
图 4 六种生物碱标准曲线图
图 5 对照品图谱 (6 个峰依次为苯甲酰新乌头碱、 苯甲酰乌头碱、 苯甲酰次乌头碱、 新乌头碱、 乌头碱、 次乌头碱对照品峰 )
图 6 无胆附片图谱
具体实施方式实施例 1 本发明无胆工艺考察
取新鲜的泥附子约 10kg， 洗净， 中火 ( 保持沸腾 ) 煮约 15min( 至透心 )。
将 煮 好 的 附 子 均 匀 分 成 两 份， 一 份 切 纵 片 ( 厚 约 0.3-0.5cm)， 将切好的药材 浸漂 (20-30min)， 然后均匀分成 5 等分 ( 用于炮制黑顺片 ) ； 另一份剥皮切纵片 ( 厚约 0.3-0.5cm)， 将切好的药材浸漂 (20-30min)， 然后均匀分成 5 等分 ( 用于炮制白附片 )。
1.1 蒸制时间、 干燥方法考查
黑顺片、 白附片的五等分分别蒸约 2h、 4h、 6h、 8h、 10h( 常压 )。将蒸好的药材再分 别均匀分为四等分， 分别采用烘干、 微波干燥、 远红外干燥、 减压干燥四种方法进行干燥。 统 计干燥时间， 将干燥好的药材如下编号 ：
表 1 四种不同干燥方法比较 ： ( 除微波干燥外， 干燥温度均为 55℃ )
综上， 通过四种方法干燥， 微波与远红外干燥得到的样品外观不好， 达不到药典标 准， 烘干和减压干燥的到的样品外观基本符合药典标准， 但是减压干燥费时， 且浪费能源， 故最终选择烘干为无胆黑顺片及无胆比附片的干燥方法。
蒸制时间不同得到的附片生物碱含量不同， 见表 2 ：
表 2 不同蒸制时间无胆黑顺片及白附片生物碱含量测定结果
根据 《中国药典》 2010 年版一部的规定， 黑顺片及白附片含双酯型生物碱以新乌头 碱 (C33H43NO10)、 次乌头碱 (C32H45NO10) 和乌头碱 (C33H43NO11) 的总量计， 不得过 0.020％。 ， 含苯 甲酰新乌头原碱 (C31H43NO10)、 苯甲酰乌头原碱 (C32H45NO10) 和苯甲酰次乌头原碱 (C31H43NO9) 的总量， 不得少于 0.010％。可见， 蒸制 8h 后烘干的样品是符合药典规定的。
1.2 干燥温度考查
选取新鲜的泥附子 4kg， 洗净， 中火煮约 15min( 保持沸腾 )， 然后分为两等分， 一份 切纵片 ( 厚约 0.3-0.5cm)， 将切好的药材浸漂 (20-30min)， 蒸约 8h， 然后将蒸好的药材均匀 分为四等分 ； 另一份剥皮， 切片 ( 厚约 0.3-0.5cm)， 将切好的药材浸漂 (20-30min)， 蒸约 8h
后均匀分为四等分 ； 分别在不同温度下烘干。测试结果见下表 ：
表 3 不同烘干温度无胆附片外观与生物碱含量比较表
通常制备的附片中单酯型生物碱的含量越高， 双酯型生物碱的含量越低， 附片的 质量最佳。 由表 3 中实验数据可知， 干燥温度 40-70℃较优， 制备的单酯型生物碱的含量高， 双酯型生物碱的含量低 ； 其中， 烘干的最适宜温度为 55℃时， 质量较佳， 相比 40℃干燥时间 明显缩短， 干燥时间为 24h。
综上， 无胆黑顺片的炮制工艺为 ： 取新鲜的泥附子、 洗净， 中火煮约 15min( 保持 沸腾 )， 切纵片 (0.3-0.5cm)， 将切好的药材浸漂 (20-30min)， 蒸约 8h( 常压 )， 取出， 烘干 (55℃， 24h)。
无胆白附片炮制工艺为 ： 取新鲜的泥附子、 洗净， 中火煮约 15min( 保持沸腾 )， 剥皮， 切纵片 (0.3-0.5cm)， 将切好的药材浸漂 (20-30min)， 蒸约 8h( 常压 )， 取出， 烘干 (55℃， 24h)。
质量标准研究
1.1 性状鉴别
无胆黑顺品 ： 为纵切片， 上宽下窄， 长 1.7-5cm， 宽 0.9-3cm， 厚 0.2-0.5cm。外皮黑 褐色， 切面暗黄色， 油润具光泽， 半透明状， 并有纵向导管束。质硬而脆， 断面角质样。气微， 味淡。
无胆白附片 ： 无外皮， 黄白色， 半透明， 质硬而脆。
与传统方法加工黑顺片及白附片性状一致 ( 见附图 1 ： 无胆附片药材图 )
2.2 显微鉴别
无胆黑顺片及无胆白附片粉末灰黄白色， 粉末具有以下结构 ：
①淀粉粒极多， 单粒类球形或圆多角形， 少数长圆形， 直径 2-20μm， 脐点呈点状、 十字状、 人字状 ； 复粒由 2-7 粒或更多复合而成。
②后生皮层碎片少见， 表面观呈多角形， 垂周壁不均匀增厚， 有的呈瘤状突入细胞 腔， 胞腔内含棕色物。
③石细胞少见， 散在， 直径约 53-125μm， 纹孔明显。
④具缘纹孔及网纹导管直径 20-48μm。制附片主为含糊化淀粉粒的薄壁组织碎 片。与传统方法加工附片显微特征一致。( 附图 2)
2.3 薄层鉴别
传统方法加工附片 1 批， 无胆黑顺片 5 批、 无胆白附片 5 批分别粉碎， 过四号筛 ：
取本品粉末 5g， 加氨试液 5ml 润湿， 加乙醚 50ml， 超声处理 30 分钟， 滤过 . 滤液挥 干， 残渣加二氯甲烷 0.5ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取苯甲酰新乌头原碱对照品、 苯甲 酰乌头原碱对照品、 苯甲酰次乌头原碱对照品， 加异丙醇一二氯甲烷 (1 ∶ 1) 混合溶液制成 每 1ml 各含 1mg 的混合溶液， 作为对照品溶液 ( 单酯型生物碱 )。再取新乌头碱对照品、 次 乌头碱对照晶、 乌头碱对照品， 加异丙醇一二氯甲烷 (1 ∶ 1) 混合溶液制成每 1ml 各含 1mg 的混合溶液， 作为对照品溶液 ( 双酯型生物碱 )。照薄层色谱法 ( 附录 VIB) 试验， 吸取供试 品溶液和对照品溶液各 5 ～ 10μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以正己烷 - 乙酸乙酯 - 甲 醇 (6.4 ∶ 3.6 ∶ 1) 为展开剂， 置氨蒸气饱和 20 分钟的展开缸内， 展开， 取出， 晾干， 喷以稀 碘化铋钾试液。 供试品色谱中， 黑顺片或白附片在与苯甲酰新乌头原碱对照品、 苯甲酰乌头 原碱对照品、 苯甲酰次乌头原碱对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。 与传统方法 加工附片薄层鉴别斑点一致。( 附图 3) 2.4 碱金属及碱土金属的含量测定
测试样品 ： 取江油附子加工无胆附片 3 批、 江油附子加工有胆附片 1 批， 浸泡胆巴 (7 天、 30 天 ) 附片 2 批、 河北安国购买附片 1 批共 7 批药材进行钙、 镁、 氯离子含量测定比 较。
2.4.1 钙、 镁离子的含量测定
委托中科院成都分院进行钙、 镁离子的含量测定。
检测方法 ： 电感耦合等离子体发射光谱法 (ICP-AES)。
检测结果 ： 见表 4。
2.4.2 氯离子的含量测定
2.4.2.1 供试品的制备分别取黑顺片白附片样品 ( 过四号筛 ) 约 5g， 精密称取， 在 80 ℃下烘至恒重。另取食用胆巴适量， 同样烘至恒重。加水 50ml， 超声处理 (250W， 50KHz)30min， 放冷， 补足重量， 摇匀， 滤过。 另取适用胆巴适量， 烘至恒重， 用同样方法处理。
2.4.2.2 实验方法
分别精确移取供试液 5ml、 胆巴溶液 1ml， 置于 250ml 锥形瓶中， 加入 6ml 蒸馏水， 1ml 铬酸钾指示剂， 用 0.1mol/L 硝酸银标准溶液滴定至出现砖红色沉淀不消失为止， 记录 消耗的硝酸银溶液体积。测定结果如表 4 所示。
表 47 批附片胆巴含量测定结果
测定结果表面， F1 ～ F3( 无胆附片 ) 中钙、 镁、 氯的含量比经过胆巴浸泡的无胆黑 顺片的中的含量比无胆黑顺片低几倍甚至十几倍， 大大保证了临床用药的安全性。暂定无 胆附片含有钙离子不高于 0.5％ w/w， 镁离子不高于 0.2％ w/w， 氯离子不高于 0.5％ w/w。
2.5 重金属及有害元素
测试样品 ： 随机选取江油附子加工无胆附片 3 批、 布拖附子加工无胆附片 1 批， 渠 县加工无胆附片 1 批， 共 5 批。
照铅、 镉、 砷、 汞、 铜测定法 ( 附录 IX B 原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体 质谱法 ) 测定， 测定结果如表 5 所示。
2.5.1 仪器与试药
美国 Agilent ICP-MS7500 电感耦合等离子质谱仪、 岛津十万分之一电子天
平、 可编程控温微波消解仪 (MARS5 型， 美国 CEM 公司 )、 Millipore Milli-Q 超纯 水系统。硝酸 ( 国外进口 )。
2.5.2 标准品溶液的制备
铅单元素标准溶液 ： MERCK， Lot ： HC813220 标准值 ： 1000±2mg/L
砷单元素标准溶液 ： MERCK， Lot ： HC888556 标准值 ： 998±5mg/L
汞单元素标准溶液 ： MERCK， Lot ： HC810358 标准值 ： 1000±2mg/L
镉单元素标准溶液 ： MERCK， Lot ： HC813220 标准值 ： 1000±2mg/L
铜单元素标准溶液 ： MERCK， Lot ： HC781459 标准值 ： 1001±2mg/L
精密量取上述铅、 砷、 汞、 镉单元素标准溶液各 200μl 置 100mL 容量瓶中， 用 5％ 硝酸定容至刻度， 摇匀， 作为贮备标准溶液 ( 砷、 铅、 镉 2000μg/L) ； 精密量取上述铜单元 素标准溶液 1mL 置 100mL 容量瓶中， 用 5％硝酸定容至刻度， 摇匀， 作为贮备标准溶液 ( 铜 10000μg/L) ； 分别量取上述贮备标准溶液适量， 用 5％硝酸稀释成各系列浓度， 制备成混 合标准系列溶液。
2.5.3 仪器条件
射频功率为 1350W， 采样深度 143step， 载气流速 0.91L/min， 辅助气流量 0.8L/ min， 冷却气流速 13L/min， 蠕动泵采集样品时转速 30r/min， 积分时间 40 秒， 重复 3 次。
2.5.4 供试品溶液的制备
取附片粉末约 0.5g， 精密称定， 置聚四氟乙烯微波消解罐中， 加入 7mL 硝酸， 放置 约 2 小时后， 设定微波消解程序 ( 功率 1600W， 以 20℃每分钟升温至 120℃， 保持 5 分钟， 再 以 8℃每分钟升温至 160℃， 保持 10 分钟， 再以 5℃每分钟升温至 185℃， 保持 25 分钟 )， 消 解完全冷却至室温后， 打开内塞， 挥去浓烟， 用去离子水转移消解液至 25mL 容量瓶中， 并用
去离子水定容至刻度， 摇匀， 作为供试品溶液。同时同法制备全试剂样品空白溶液。
2.5.5 样品测定
75As、 65Cu、 111Cd、 82Se 以 115In( 浓 度 约 10ppb) 作 内 标， 202Hg、 208Pb、以 Bi209( 浓度约 10ppb) 作内标， 在上述仪器条件下将上述标准系列溶液由蠕动泵进样分析， 以元素浓度 (ppb) 为横坐标， 相应仪器响应 (ICPS) 为纵坐标， 绘制标准曲线 ； 供试品溶液在 同样条件下进样分析， 自动扣除样品全试剂空白后， 从标准曲线上读出供试品溶液中各元 素的浓度 (ppb)， 并计算出样品中各元素的含量。公式如下 ：
样品中各元素的含量 (mg/kg) ＝供试品溶液的浓度 (mg/kg)*25/ 取样量 /1000， 测 定结果见表 5。
2.6 有机氯农药残留量
2.6.1 色谱条件
色谱仪： Agilent 6890N 气 相 色 谱 仪， 63Ni-ECD 电 子 捕 获 检 测 器 ； 色谱柱： DB-130m×0.32mm×1μm ； 柱 温 70 ℃ (1min)、 180 ℃、 205 ℃ (10min)、 280 ℃ (10min)INJ ： 250℃ ； DET ： 310℃ ； 氮气流速 ： 1.7mL/min ； 尾吹 ： 50mL/min。
2.6.2 对照品溶液的制备
六 六 六 ( 总 BHC) 分 别 精 密 量 取 1mL α-BHC 对 照 品 ( 国 家 标 准 物 质 研 究 中 GBW(E)060081)， 1mL β-BHC 对照品 ( 国家标准物质研究中心 GBW(E)060082)， 1mL γ-BHC 对照品 ( 国家标准物质研究中心 GBW(E)060083)， 1mL δ-BHC 对照品 ( 国家标准物质研究 中心 GBW(E)060084) 置 25mL 量瓶中， 用石油醚 (60 ～ 90℃ ) 溶解并稀释至刻度， 摇匀， 即 得。
滴滴涕 ( 总 DDT) 分别精密量取 ：
1mLPP’ -DDE 对照品 ( 国家标准物质研究中心 GBW(E)060104)，
1mLPP’ -DDD 对照品 ( 国家标准物质研究中心 GBW(E)060105)，
1mLOP’ -DDT 对照品 ( 国家标准物质研究中心 GBW(E)060103)，
1mLPP’ -DDT 对照品 ( 国家标准物质研究中心 GBW(E)060102)， 置 25mL 量瓶中， 用 石油醚 (60 ～ 90℃ ) 溶解并稀释至刻度， 摇匀， 即得。
五氯硝基苯 (PCNB) 精密量取 1mL 五氯硝基苯对照品 ( 国家标准物质研究中心 50μg/mL) 置 25mL 量瓶中， 用石油醚 (60 ～ 90℃ ) 溶解并稀释至刻度， 摇匀， 即得。
2.6.3 混合对照品溶液的制备
精密量取上述标准储备液 α-BHC、 γ-BHC、 δ-BHC 各 5mL、 β-BHC 各 10mL， 五氯硝 基苯 (PCNB)5mL， PP’ -DDE、 PP’ -DDD 各 5mL， OP’ -DDT、 PP’ -DDT 各 10mL， 置 100mL 量瓶中， 用石油醚 (60 ～ 90℃ ) 稀释至刻度， 摇匀， 即得 (α-BHC、 γ-BHC、 δ-BHC 浓度 100ng/mL， β-BHC 浓度 200ng/mL， 五氯硝基苯 (PCNB) 浓度 100ng/mL， PP’ -DDE、 PP’ -DDD 浓度 100ng/ mL， OP’ -DDT、 PP’ -DDT 浓度 200ng/mL)。
2.6.4 供试品溶液的制备
取无胆黑顺片或白附片于 60 ℃干燥 4 小时， 粉碎成细粉， 取约 2g， 精密称定， 置 100mL 具塞锥形瓶中， 加水 20mL 浸泡过夜， 精密加丙酮 40mL， 称定重量， 超声处理 30 分钟， 放冷， 再称定重量， 用丙酮补足减失的重量， 再加氯化钠约 6g， 精密加入二氯甲烷 30mL， 称 定重量， 超声处理 15min， 再称定重量， 用二氯甲烷补足减失的重量， 静置使分层， 将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的 100mL 具塞锥形瓶中， 放置 4h。精密量取 35mL， 于 40℃水 浴减压浓缩至近干， 加少量石油醚 (60 ～ 90℃ ) 如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净， 用石 油醚 (60 ～ 90℃ ) 溶解并转移至 10mL 具塞刻度离心管中， 加石油醚 (60 ～ 90℃ ) 至 5mL。 小心加人硫酸 1mL， 振摇 1min， 离心 10min， 精密量取上清液 2mL， 即得。
2.6.5 测定方法及结果
分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各 1μl， 分别连续 进样 3 次， 取 3 次平均值， 按外标法计算供试品中有机氯农药残留量。结果 ： 5 批附片样品 均未检测到有机氯农药 ( 六六六、 滴滴涕、 五氯硝基苯 ) 残留。
表 5 主产地附子加工无胆附片重金属及农药残留测定
由表 5 由可见， 重金属及有害元素测定结果均符合 《中国药典》 2010 年版一部得规 定： 铅不得过百万分之五 ； 镉不得过千万分之三 ； 砷不得过百万分之二， 汞不得过千万分之 二， 铜不得过百万分之二十。
有机氯农药残留量照农药残留量测定均符合 《中国药典》 2010 年版一部得规定 ： 六六六 ( 总 BHC) 不得过千万分之二 ； 滴滴涕 ( 总 DDT) 不得过千万分之二 ； 五氯硝基苯 (PCNB) 不得过千万分之一。
2.7 生物碱的含量测定
测试样品 ： 江油附子加工无胆黑顺片、 白附片各 3 批、 布拖附子加工无胆黑顺片、 白附片各 1 批， 渠县附子加工无胆黑顺片、 白附片各 1 批， 共 10 批。
2.7.1 仪器与试药
安捷伦 1200 高效液相色谱系统 ： 包括 1200 泵， DAD 检测器， Millipore Milli-Q 超纯水系统， 岛津十万分之一电子天平， Brasson 超声波清洗仪， KQ-100 超声波清洗仪， 乌头碱 ( 批号 ： 110797-200404)、 新乌头碱 ( 批号 ： 110799-200404)、 次乌头碱 ( 批号 ： 110798-200404) 对照品 ( 中国药品生物制品检定所提供 ) ； 苯甲酰新乌头碱、 苯甲酰次乌头 碱、 苯甲酰乌头碱 ( 由新荷花饮片厂提供， 暂无批号 )。HPLC 用甲醇、 乙腈均为进口色谱纯 试剂， 其余均为国产分析纯试剂， HPLC 所用水为超纯水， 其余所用水为纯化水。
2.7.2 色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 柱温 20℃； 流动相为 A 和 B 两相梯度洗脱， A： 乙腈， B： 40mmol/L 乙酸铵缓冲液 ( 氨水调 pH ＝ 10.0)， 按下表进行梯度洗脱， 流速 1ml/min ； 检测波长为 230nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于 3000。
2.7.3 供试品溶液制备 ： 精密称取过 60 目筛的无胆附片细粉约 2g， 平行称 3 份， 分 别置于 200mL 三角瓶中， 各加 25％氨水 2mL， 润湿 30min。精密量取萃取溶剂异丙醇 - 醋酸 乙酯 (1 ∶ 1) 混合液 100mL， 加至含样品的三角瓶中并称定重量。超声 30min 后， 将此样品 瓶放置至室温， 再称重量， 用萃取溶剂补足失去的重量， 混匀后滤过。 精密量取续滤液 40mL， 浓缩至小体积， 再将其用萃取溶剂完全转移至一蒸发皿上蒸干。残渣用 0.01％盐酸 - 甲醇 溶解并定容于 2mL 量瓶中， 摇匀， 0.45μm 微孔滤膜滤过， 得供试品溶液。
2.7.4 对照品溶液制备 ： 精密称取新乌头碱、 次乌头碱、 乌头碱对照品 2.6、 1.3、 5.19mg 置同一 10mL 量瓶内， 用 0.01％盐酸甲醇溶液溶解并定容至刻度， 摇匀， 得双酯型生 物碱对照品液。精密称取苯甲酰乌头原碱、 苯甲酰次乌头原碱、 苯甲酰新乌头原碱 4.0256、 2.56、 1.8mg 各置于 1mL 量瓶内， 用 0.01％盐酸甲醇溶液溶解并定容至刻度， 摇匀， 得 3 个单 酯型生物碱的对照品溶液。
2.7.5 标准曲线制备 ： 分别精密吸取适量的单酯型及双酯型对照品混合液于同一 10ml 容量瓶并加 0.01％盐酸甲醇稀释至刻度。然后分别吸取适量的中间液制成 5 个不同 浓度的混合对照品溶液， 按上述色谱条件进行分析， 以峰面积 (Y) 对进样量 (X) 进行回归计 算 ( 以乌头碱含量及峰面积作标准曲线 )， 回归方程见图 4
2.7.6 加样回收率试验 ： 精密称取附子生药材细粉 1g 共 30 份， 每 5 份用于一种生 物碱的回收率测定， 共 6 组。每一组样品分别加入同一种对照品溶液适量， 按供试品溶液制 备项下方法进行供试品溶液的制备和 HPLC 分析。根据测得量和加入量计算其回收率。乌 头碱、 次乌头碱、 新乌头碱、 苯甲酰乌头原碱、 苯甲酰次乌头原碱、 苯甲酰新乌头原碱的平均 加样回收率 (RSD) 分别为 98.70％、 100.47％、 98.20％、 100.35％、 100.27％和 98.47％。
2.7.7 样品测定 ： 精密称取各样品约 2g， 每个样品平行称 3 份， 按供试品溶液制备 项下方法制备， 并按上述色谱条件进行 3 种单酯型生物碱的分析， 用当天随行的供试品溶 液进行计算， 结果见表 6。对照品、 及无胆附片 HPLC 谱图见附图 5、 图 6。
表 6 自制无胆附片含量测定
根据 《中国药典》 2010 年版一部的规定， 黑顺片及白附片单酯型生物碱以苯甲酰新 乌头原碱 (C31H43NO10)、 苯甲酰乌头原碱 (C32H45NO10) 和苯甲酰次乌头原碱 (C31H43NO9) 的总量 计， 不得少于 0.010％ ； 含双酯型生物碱以新乌头碱 (C33H43NO10)、 次乌头碱 (C32H45NO10) 和乌 头碱 (C33H43NO11) 的总量计， 不得过 0.020％。
可见， 所有批次的无胆黑顺片及无胆白附片生物碱含量均是符合 《中国药典》 2010 年版一部规定的。
综上所述， 采用本发明提供的炮制方法制备的无胆黑顺片或白附片， 由于在炮制 过程中没有加入食用胆巴， 大大降低了其中钙离子、 镁离子、 氯离子和其他金属离子的浓 度， 降低了毒副作用， 同时将无胆黑顺片、 白附片分别按 《中国药典》 2010 年版附子项下质量 标准进行检测， 各项指标均能达到药典要求， 表明炮制过程中不加食用胆巴的无胆黑顺片、
白附片可以达到与黑顺片、 白附片相同的效果。 且操作此外， 本发明还对无胆黑顺片或白附 片中毒性成分双酯型生物碱、 重金属及农药残留量进行了监测与控制， 为全面控制无胆黑 顺片或白附片的质量与安全性提供了保证。