新胶原材料及其获得方法 本发明涉及新胶原材料， 并更特别地适用于胶原膜、 管状物、 薄膜、 海绵状物、 凝 胶、 基质和线状物。所述材料兼有优异的弹性和机械强度特性。本发明还涉及使用腱的酸 性纤维胶原制备胶原材料的方法， 其还包括胶原的受控交联。本发明还涉及具有长纤维的 腱的酸性纤维胶原， 涉及其获得方法以及其在特别是制造胶原膜、 管状物、 薄膜、 海绵状物、 凝胶、 基质和线状物中的应用。
胶原是自古以来为人所知的蛋白。长久以来， 由于其突出的物理化学和生物特性 而用于制造医疗装置。 过去曾用于制备止血敷布 (hemostatic compress)， 其生物相容性及 其对伤口愈合和瘢痕形成的活性使其成为用于制备生物材料 ( 如牙科手术中用于引导的 组织再生的膜 ) 和用于颅顶强化和人工血管的涂覆材料 ( 以促进其整合并确保其紧密 ) 的 理想选择。
完全由胶原制成的材料， 如止血敷布、 用于防止粘附的膜和用于神经再生的导管 状物 (WO2007/147739， FR2810889) 是商业上可获得的。
只要胶原提取过程导致充分的纯化， 该产物完全是生物相容的， 并良好地完成其 功能。
取决于适应症和在体内相应的所需吸收期间， 可将胶原交联。交联胶原的方法是 公知的， 并得到广泛描述。可提及， 例如 EP0862468 和 US4931546。将氧化的糖原作为胶原 交联剂已描述于 FR2877669 以及 Forest 等和 Rousseau 等的公开文献。根据所述交联剂的 特性和比例， 以及交联条件 (pH， 反应时间 )， 较容易以可控方式变化材料的吸收时间。然 而， 交联的困难之处主要在于交联速率的选择， 这必须使得能够产生稳定而可重复产生的、 具有所需吸收时间并具有与其应用相容的机械特性的材料。 该问题对于长寿命的材料而言 更加严重， 因为胶原材料交联越多则越坚固。 该物理特征， 表示为对撕裂的易感性的增加和 缝线保持强度 (suture retention strength) 的减少， 对于某些手术应用而言可为完全不 可接受的。 然而， 目前并无精确地并可重复地控制胶原交联速率， 并相应地控制最终材料的 刚度的交联方法。
因此， 在某些情况下， 且特别是当外科医师和 / 或患者在植入后对材料施以强机 械应力时， 所述现有的胶原材料达到了其极限。 对于专利 FR2877669 中和 Forest 等 (2007) 的科学文献中所述的材料而言即为如此。所述材料非常良好地实现了其功能， 但在极端情 况下， 当缝线纤细或应力更强时， 材料的强度不足。
胶原材料的机械特性取决于三个因素 ：
- 胶原结构化水平 (level of structuring) 的选择，
- 网化剂 (reticulating agent) 和交联速率的选择，
- 用于制备和形成材料的方法。
外科医师当面对新的手术技术和广泛的可能性时， 越来越对强至足以制成缝 线并置于张力下的生物可降解产品 ( 任选地， 但非必需地， 例如通过织物网格 (textile lattice) 强化 ) 感兴趣。对于供引导的组织再生的膜而言特别如此。为了制备此种材料， 本领域技术人员会选择高度结构化的胶原， 并会强烈地交联该胶原。 然而， 结果会是非常刚
性、 可断裂且对于外科医师不易操作的产品。 选定的胶原可为所谓纤维胶原， 即并非非常未 结构化的， 但缺乏提取过程中的控制限制了用该胶原产生的材料的可能性。交联通过例如 浸没或与甲醛或戊二醛蒸汽相接触来进行， 但并不产生柔性和受控的交联。 因此， 迄今为止 并无具有机械强度 ( 张力， 缝线 ) 并具有柔性和相容性且具有合适吸收时间 ( 几个月 ) 的 胶原材料。
交联的胶原材料的制造一般包括制备胶原水溶液， 任选地添加交联剂， 通过浇注 或模塑所述胶原水溶液， 蒸发溶剂然后在浴、 蒸汽中或减压下通过物理或化学方法处理获 得的材料以形成交联键， 去除和 / 或失活残余的交联剂或任何不需要的分子， 然后进行干 燥材料的新步骤 ( 若材料的最终形式需要此种步骤 )， 来形成材料。
所述现有技术方法需要对胶原材料的多次操作， 且无法使得交联步骤的充分控制 能够进行， 特别是在交联键密度和胶原结构方面。 重要的是， 所述方法无法使得足够持续的 (progressive) 凝结 / 纤维化步骤或凝结 / 纤维化 / 交联步骤能够进行以使得胶原分子的 三维组织能够进行。 其结果， 一般而言获得的交联材料或者是强而刚性的， 或者是柔性但相 对较弱的。
本发明在此描述了用于获得胶原材料的方法， 特别是获得具有高拉伸强度和撕裂 强度的胶原膜， 而保持充分的柔性和弹性以特别用于手术应用的方法。
事实上， 本发明人开发了制备胶原材料的新方法， 包括在形成所述胶原材料过程 中用氨气处理湿的纤维胶原。 此种用氨气的持续处理使得能够在纤维胶原的形成过程中获 得其凝结和纤维化。本发明因此还涉及用于形成纤维胶原的方法， 并特别涉及弱碱如氨气 用于确保凝胶形式的胶原的完全凝结和纤维化的用途。 所述方法还通过在浇注或模塑形成 胶原之前， 直接将交联剂添加至纤维胶原溶液而使得在胶原形成过程中能够进行伴随的交 联。因此胶原交联速率可以准确而可重现的方式得到控制。
此外， 本方法还使得能够在材料中进行可察觉的均质交联， 即， 在材料外侧和内侧 交联速率可基本上相同。这显著地使得所述材料能够与在外侧的交联远大于内侧 ( 或在内 侧几乎不存在交联 ) 的交联的材料相比， 具有改善的特性。
因此， 本方法可提供具有改善的机械和 / 或吸收特性的材料。不愿拘于该理论， 有 可能对吸收速率的更佳控制是由于材料体积中的交联和 / 或结构均一性。特别是在本发明 的上下文中 “更佳控制” 意指在一个材料样品与另一个的比较， 特别是两个不同制造批次之 间的比较， 和 / 或一个患者与另一个的比较中， 显示比来自现有技术的已知方法获得的材 料的情况下差异更小的吸收速率。
此外， 所述材料可具有作为时间的函数可察觉地为恒定的， 或线性的吸收。因此， 这可导致降解部分的持续释放。
另一方面， 在其中交联在其体积中并不均一的现有材料的情况下， 降解可为突然 性的。 不愿拘于该理论， 有可能一旦外侧部分降解， 具有较低程度交联的内侧部分降解更为 迅速， 或甚至非常迅速。因此， 这可导致降解产物数量的迅速增加， 或甚至突然的炎症爆发 (flare-up)。
优选地， 所述方法是用纤维胶原并优选是用具有长纤维的胶原实施的。本发明人 已经开发了用于制备腱的酸性纤维胶原的方法， 所述胶原的特征为特别长和有弹性的纤 维。 获得的纤维胶原可用于制备纤维材料， 特别是本发明的膜、 薄膜、 海绵状物、 凝胶、 基质、线状物和管状物。
本发明的方法使得能够制造具有以标准胶原材料生产方法在机械强度、 弹性、 可 缝性和相容性方面从未获得的特性的医疗装置， 特别是膜、 薄膜、 海绵状物、 凝胶、 基质、 线 状物和管状物。由本发明的方法获得的材料可用于一般和特殊手术， 特别是泌尿科、 妇科、 心脏、 胸部、 血管、 关节、 消化道、 整形外科、 脊椎、 神经科、 骨科、 创伤、 牙科、 口腔科和颌面手 术， 以供引导的瘢痕形成或组织替代 ( 硬膜 (dura matter)、 牙龈、 骨、 神经、 腱、 韧带、 内脏、 心包、 腹膜、 一般结缔组织、 真皮、 肌肉、 软骨 )， 无论制造的相应材料为何种形式。
所述材料， 考虑到其特征， 可以以膜或薄膜形式在任何其中瘢痕形成期中需要分 隔两个器官或组织的手术中用作引导的瘢痕形成和 / 或抗粘附屏障， 如在神经和腱再生中 外科医师按其期望装配 (fabricate) 的管状物或筒形式的再生引导， 或当胶原为海绵状物 形式时用于组织工程的再生基质。 由于所述材料是使用胶原制造的， 它们具有相容性， 使其 易于使用， 并使其能够遵循它们所放置在的组织的轮廓， 同时具有可缝性， 使其视需要可保 持在该位置上。取决于植入位点和所需的吸收时间， 可通过变化起始胶原溶液中胶原和交 联剂反应基团的比例 ( 和 / 或通过增加或减少氨的量和 / 或与氨接触的时间 ) 来调整交联。 为达到同样目标， 亦可调整材料的厚度。 优选的用途为获得膜 ( 以供在多种类型的手术中引导的组织再生和组织替代 ( 硬 膜， 心包等 ))， 管状物 ( 以供神经再生， 例如用于腱和韧带再生 ) 和基质 ( 例如用于组织工 程 )。
发明内容
本发明涉及制备腱的酸性纤维胶原的方法， 包括下述步骤 ：
a) 将猪、 牛、 羊、 驴 (foal) 的腱或其混合物在 0.1M 至 0.5M 乙酸水溶液中溶胀至少 7 日，
b) 机械研磨所述腱以获得水悬液，
c) 从步骤 b) 的水悬液沉淀并洗涤纤维胶原，
d) 将所述胶原脱水，
e) 获得酸性纤维胶原。
优选地， 步骤 a) 涉及溶胀幼于 10 个月的猪的腱。
优选地， 在步骤 c) 中， 将所述胶原在 0.45-1.2M NaCl 溶液中沉淀并洗涤。
通常， 在步骤 d) 中， 胶原的脱水包括用丙酮处理。
本发明还涉及可通过本发明的方法获得的酸性纤维胶原。有利地， 本发明涉及具 有长纤维， 从而使得在 0.1％水溶液中少于 20％、 15％或 10％的包含于溶液中的纤维留在 50μm 尼龙滤器上， 而超过 20％、 25％或 30％穿过 5μm 尼龙滤器的纤维胶原。
本发明还涉及用于制备胶原材料的方法， 包括下述步骤 ：
a) 制备酸性形式的胶原的水溶液，
b) 任选地， 添加在酸性 pH 非反应性的醛交联剂，
c) 对所述胶原水溶液进行模塑或浇注，
d) 通过用氨气处理使得所述胶原水溶液凝结并任选地交联，
e) 去除过量的氨， 并通过干燥获得胶原材料。优选地， 步骤 a) 的水溶液包含按重量计 0.05％至 3％酸性形式的胶原。 优选地， 所述酸性形式的胶原是天然胶原或变性胶原。 优选地， 用选自猪腱、 牛腱、 羊腱和驴腱的胶原的酸性纤维胶原制备步骤 a) 的水溶液。 在一个有利的实施方案中， 使胶原溶液凝结并任选地交联是通过用氨气处理至少 24 小时实施的。
在一个有利的实施方案中， 所述方法包括添加在酸性 pH 无反应性的醛交联剂， 并 通过用氨气处理使胶原水溶液凝结和交联。
有利地， 所述醛交联剂选自糖原和醛支链淀粉 (aldehydes amylopectin)。
更有利地， 所述醛交联剂是氧化的糖原。
优选地， 所述醛交联剂是以 0.05 至 5 的醛交联剂的 CHO 比对于胶原的 NH2 的比例 范围添加的。
在本发明方法的一个优选实施方案中， 所述胶原材料是膜， 在步骤 c) 中， 胶原水 溶液沉积于平的模具上， 并在步骤 e) 中， 去除过量的氨并通过干燥获得胶原膜。
本发明还涉及可通过本发明的方法和 / 或本说明书中描述的方法获得的胶原材 料。更特别地， 所述材料是通过所述方法获得的， 所述材料是直接通过所述方法获得的。
根据其另一方面， 本发明还涉及具有均一交联的胶原材料， 特别是膜。
在本发明的上下文中， “均一交联” 意指外侧表面的交联和内侧的交联， 特别是朝 向材料中间， 更特别地在材料中间的交联之间的差异小于或等于 20％， 特别是小于或等于 15％， 更特别地小于或等于 10％， 且十分特别地小于或等于 5％。
交联差异的百分比可对应于 [(( 外侧交联 - 内侧交联 )/( 内侧交联 + 外侧交联 )) x100] 的绝对值。
交联可通过每 mg 材料游离赖氨酸的摩尔数， 特别是以实施例 7 中所述的方式来评 价。
所述具有均一交联的材料， 特别是膜， 可具有至少 50μm 的干燥厚度， 且十分特别 地， 其长度、 宽度和高度均大于或等于 50μm。
十分特别地， 所述材料为具有至少 50μm 的干燥厚度的膜的形式。所述膜的长度 和宽度可为大于或等于 1cm， 更特别地 5cm。
根据其又一个方面， 本发明涉及与非交联的胶原材料相比具有大于或等于 3℃， 特 别是大于或等于 5℃， 更特别地大于或等于 7℃的变性温度的增加。该交联温度的不同可通 过差示扫描量热法 (DSC)， 特别是以实施例 8 中所述的方式测量。
所述交联胶原材料可与非交联材料相比具有至少 5％， 特别是 8％， 更特别是至少 10％的变性温度的增加。
该温度增加的百分比对应于下述公式 ：
[(( 交联材料变性温度 / 非交联材料温度 )-1)x100]。
交联材料变性温度相对于非交联材料变性温度的增加可用于验证该材料是否确 实是交联的。
优选地， 所述胶原材料可包括胶原膜、 胶原薄膜、 胶原线状物、 胶原管状物、 胶原海 绵状物或胶原凝胶。
在一个优选实施方案中， 本发明涉及胶原膜， 其可通过本发明的方法获得， 并具有 30μm 至 200μm， 优选 80μm 至 120μm 的干燥厚度， 。
优选地， 所述胶原材料包括非多孔胶原单层， 其具有 50μm 至 150μm， 优选 80μm 至 120μm 的干燥厚度。
根据本发明获得的胶原膜有利地具有 12mg/cm2 至 16mg/cm2 的密度， 少于 6 的溶胀 比， 大于 1N 的缝线保持强度， 大于 4MPa 的屈服强度和和少于 35％的通过胰蛋白酶的酶降解 百分比。
本发明还涉及胶原膜， 其具有 80μm 至 120μm 的干燥厚度， 12mg/cm2-16mg/cm2 的 密度， 少于 6 的溶胀比， 大于 1N 的缝线保持强度， 大于 4MPa 的屈服强度和和少于 35％的通 过胰蛋白酶的酶降解百分比。
更优选地， 本发明涉及胶原膜， 其具有 4 至 6 的溶胀比， 1N 至 2.5N 的缝线保持强 度， 4MPa 至 7MPa 的屈服强度和 20％至 35％的胰蛋白酶的酶降解百分比。
有利地， 获得的胶原膜用可吸收的或不可吸收的纺织品强化。 具体实施方式 本发明因此涉及用于从年幼动物的腱提取胶原的方法， 其得到的胶原的纤维长度 和弹性在制造医疗装置的用途中， 使得能够获得机械上具有强度、 弹性、 可缝性和相容性的 材料。
因此， 本发明的一个目标涉及用于制备腱的酸性纤维胶原的方法， 包括下述步 骤：
a) 将猪、 牛、 羊、 驴的腱或其混合物在 0.1M 至 0.5M 乙酸水溶液中溶胀至少 7 日，
b) 机械研磨所述腱以获得水悬液，
c) 从步骤 b) 的水悬液沉淀并洗涤纤维胶原，
d) 将所述胶原脱水。
优选地， 纤维胶原的提取是对幼于 10 个月的动物的腱进行的， 且更优选是对幼于 10 个月的猪进行的。
因此， 第一步包括收获来自幼于 10 个月的猪足部的腱 ( 腱亦可从牛、 羊和驴收 获 )， 清理， 彻底去除结缔组织和其他非腱组织， 然后将腱切为大约 1cm 长的小块， 并用水漂 洗。
在 0.1M 至 0.5M， 优选 0.3M 乙酸浴中在搅拌下以 20l 至 30l， 优选 25l 的体积对 1kg 腱进行溶胀至少 7 日并最多至 15 日， 优选 15 日。
第二步包括轻柔地研磨， 使得长的腱纤维能够从溶胀的腱碎片中释放。含有经 溶胀的腱的碎块的溶胀浴的体积的研磨是例如以 300rpm 进行 2 分钟， 然后进行一系列每 个均包含用水稀释介质接着在相同条件下研磨的步骤， 直至获得干物质浓度在 4.8g/kg 至 6.5g/kg 的糊。
第三步包括从由研磨获得的糊沉淀纤维胶原， 然后根据标准方法将其纯化。该步 骤可包括一次或多次使用终浓度为 0.45M 至 1.2M， 更特别是 0.6M 的浓度的氯化钠的沉淀， 以及一步或多步在 0.45M 至 1.2M， 优选 0.6M NaCl 溶液中的洗涤步骤。 一般而言， 所述方法 还包括在 1N 氢氧化钠溶液中在 20℃进行 1 小时的病毒灭活步骤。通过其对非胶原蛋白水
解作用， 该步骤构成附加的纯化。在该步骤结束时， 进行用 0.6M NaCl 的新的洗涤。然后， 为了使胶原脱水并去除盐， 进行丙酮处理， 从而获得干燥纤维。
该施于腱的特定方法得到与现有胶原不同的胶原， 区别之处在于该胶原包含长纤 维， 而不包含组织碎块， 且其保留了一部分可溶性胶原。
本发明还涉及下述纤维胶原， 其中在 0.1％水溶液中少于 20％、 15％或 10％的包 含于溶液中的纤维留在 50μm 尼龙滤器上， 而超过 20％、 25％或 30％穿过 5μm 尼龙滤器的 纤维胶原。
测量根据本发明获得的纤维胶原小于 5μm 和大于 50μm 的尺寸的级分的实验方 案如下所述 ：
- 在磁力或机械搅拌 16 至 24 小时制备 0.1％胶原水溶液 ( 使用 500mg)。
- 将溶液施于装载在 9cm 直径环状支持物上的 5μm 或 50μm 尼龙筛。
在大气压下使分子在筛中扩散。施于该筛的压力在对于 63cm2 截面不超过 4cm 的 水柱高度时被视为可忽略的。
- 将筛上的溶液用平的方形片状物 (blade) 搅拌， 其不刮擦纤维， 但置于纤维上数 毫米 ( 最多 5)。搅拌速度为 80rpm。 - 该片状物的宽度为 7cm。 。其置于所述环状支持物的中心。
- 在胶原溶液不再流过筛之后， 用 50ml 的 0.05M 乙酸洗涤渗余物， 并观察压力差异 直至流动停止。重复该操作 3 次。
- 然后， 回收级分 ( 滤过物和渗余物 )， 并通过添加 NaCl 以致达到 0.6M 的最终浓 度而从每个级分沉淀胶原。
然后通过离心或过滤收集沉淀， 然后用丙酮脱水， 在减压下干燥， 并称重。
本发明还涉及供制备胶原材料的形成酸性胶原的方法。
在第一个实施方案中， 本发明涉及制备胶原材料的方法， 其特征在于包括下述步 骤：
a) 制备包含按重量计 0.05％ -3％酸性形式的胶原的水溶液，
b) 对所述胶原水溶液进行模塑或浇注，
c) 通过用氨气处理使所述胶原水溶液凝结，
d) 去除氨并获得胶原材料。
因此， 在一个特别有利的实施方案中， 本发明涉及制备胶原材料的方法， 其特征在 于包括下述步骤 ：
a) 制备酸性形式的胶原的水溶液，
b) 添加在酸性 pH 非反应性的醛交联剂，
c) 对所述胶原水溶液进行模塑或浇注，
d) 通过用氨气处理使所述胶原水溶液凝结和交联，
e) 去除氨并获得胶原材料。
本发明方法的第一步包括制备胶原水溶液。 “胶原水溶液” 亦指胶原悬液。
本发明的方法使用酸性形式的胶原。 “酸性形式的胶原” 指其中大多数羧基官能团 质子化并在水中的悬液或溶液中具有酸性 pH 的胶原。
优选地， 本发明制备胶原材料的方法使用酸性纤维胶原。
“纤维胶原” 指其中胶原分子并未单体化 (individualize) 或单体化不良， 并因此包含由通过弱键和共价键及此类结构的集合天然地相互连接的胶原分子构成的纤维和原 纤维的胶原。纤维胶原特别包含在水性介质中分散得到均一悬液的长颗粒 ( 当水合时大多 大于 5μm)。
特别地， 纤维胶原可为皮肤纤维胶原或腱纤维胶原。皮肤纤维胶原由于该组织的 天然架构 (organization) 包含相对较短的纤维， 可溶于酸的胶原和小聚集物。腱的胶原包 含长纤维和非常少的可溶性胶原。
优选地， 本发明的方法是用腱纤维胶原， 优选用猪腱纤维胶原， 且更优选用幼于 10 个月的猪的腱纤维胶原实施的。
有利地， 本发明的方法使用根据如上所述的方法制备、 具有长纤维的酸性腱纤维 胶原。
因此， 第一步包括将胶原溶于水。这是根据文献中描述的标准方法进行的。当所 述胶原为酸性纤维胶原时， 该步骤使得由微纤维胶原和保持纤维化所需结构的所谓可溶性 胶原围绕的纤维的悬浮。
通常， 所述胶原水溶液包含按重量计 0.05％至 3％的胶原和优选 0.05％和 0.1％、 0.8％、 1％、 1.5％、 2％、 2.5％、 以及和 3％之间的胶原。有利地， 所述水溶液包含按重量计 0.8％的胶原。所述溶解通常是在水中通过机械搅拌， 优选在减压下进行的。所述悬液或溶 液亦可在 30-100℃的温度加热 2 分钟至 20 分钟以使所述胶原部分或完全变性。 本发明的方法使得可能获得按照模塑或浇注中选定的形式的多种胶原材料。因 此， 所述胶原材料可特别地成为膜、 基质、 薄膜、 线状物、 凝胶、 管状物或海绵状物的形式。
胶原水溶液的浇注或模塑对本领域技术人员是公知的， 并在文献中有所描述。因 此， 第二步为将所述胶原溶液浇注或模塑入模中， 其中其厚度根据所需材料和模表面而变 化。
胶原膜为在含有一部分纤维和原纤维的胶原溶液或均一悬液的平模 (flat mold) 中干燥所得的二维材料。该胶原可为交联或非交联的。干燥的悬液的浓度确定最终材料的 厚度， 其范围可为数微米至几百微米。
胶原薄膜是在均一胶原溶液的平模中干燥所得的二维材料。 该胶原可为交联或非 交联的。 干燥的悬液的浓度确定最终材料的厚度。 薄膜和膜可折叠形成筒， 视需要可用缝线 或胶使筒闭合。其厚度可从几微米变动至几百微米。胶原管状物是中空的三维圆柱形物， 其壁可为胶原膜或薄膜。管状物可通过在模周围模塑或通过挤出获得。壁厚度是由沉积于 膜上或用于挤出溶液的胶原的量确定的。
胶原线状物是下述胶原的大量集合， 其机械强度足以使其称为更大的多链线状 物、 复合或非复合纺织品或其他胶原材料的组合物的部分。
胶原海绵状物可通过冻干胶原溶液或悬液 ( 或这两种的混合物 ) 来获得。在冻干 之前或之后， 可交联所述胶原。冻干一般导致三维材料或粉末。
为了获得膜或薄膜， 可将胶原溶液沉积于平模上以在使溶液或悬液干燥之后获得 二维材料。所述膜或薄膜可通过蒸发溶剂获得。
胶原管状物是通过将所述溶液或悬液沉积于圆柱形模并干燥或冻干来获得的。
为了获得海绵状物， 可通过冻干， 而不通过蒸发液体形式的溶剂来去除溶剂。
之前已知使用氨用来凝结并形成胶原， 但一般而言已知方法涉及使用氨以在例如 挤出中凝结溶液或凝胶。然后， 用氨处理非常迅速， 在浴中进行。本发明的方法依赖于氨在 胶原溶液中的扩散速率， 该速率主要取决于该碱在溶液表面的浓度。使胶原和氨接触充分 时间以使得胶原在整个经处理的溶液中能够凝结， 但亦能够纤维化。这导致下述胶原材料 的制备， 其具有现有技术方法无法获得的机械特性， 包括拉伸强度、 弹性和缝线保持强度。
因此， 第三步是通过用氨处理胶原一段足以而胶原凝结和纤维化的时间而使其凝 结。通常， 氨处理进行 4 小时、 8 小时、 12 小时、 24 小时、 36 小时或 48 小时。优选地， 处理期 间大于 24 小时或 36 小时。
可调整氨的量以将酸性 pH 的胶原凝胶的 pH 增加至至少大于 8。 更特别地， 凝胶的 交联起始于胶原凝胶达到至少大于 8 的 pH。 该长时间处理使得胶原 pH 持续增加， 这不仅导 致其凝胶， 还导致其纤维化。取决于使用的胶原纤维的长度， 所述纤维化形成网络， 赋予所 述材料机械强度和弹性两者。
在 一 个 优 选 实 施 方 案 中， 氨 气 是 从 释 放 其 的 氨 溶 液 制 备 的。 一 般 而 言， 在 10℃ -25℃的温度从至少 30％的氨溶液获得合适量的氨气。优选地， 该步骤是在气密外壳 中以使得氨气在该外壳内扩散并与胶原溶液接触的方式进行的， 其中所述胶原溶液不与氨 溶液相接触。
处理获得的胶原凝胶以去除过量氨， 并照原样或以脱水状态保存。 为此目的， 可将 凝胶置于配备有去除水分的系统和 / 或氨吸收仪 (absorber) 的外壳中。在去除过量氨之 后， 通过将凝胶在干燥空气流下脱水来获得膜、 薄膜和管状物， 而通过冻干凝胶获得海绵状 物、 3-D 基质和管状物。可将凝胶维持在水合状态。
在所述制备胶原材料的方法中， 纤维化工艺发生于高度粘稠的液体介质中。由于 氨的扩散， 所述纤维化从溶液外侧向内侧发生， 并随着 pH 的增加而进行。其发生于 pH 达到 大于 4 或 5 的值时。氨蒸汽方法的优点是无需将材料浸没于中和溶液， 这节约了时间， 增加 了利润和均一度。
当需要增加胶原医疗装置的吸收时间时和强化其机械特性， 可将胶原材料交联。 对于本领域技术人员有许多公知的胶原交联方法。 其分为两大类 ： 物理交联如例如热脱水， 和通过添加或与交联剂接触的化学交联。最为人熟知的胶原交联剂为醛试剂， 特别是甲醛 和戊二醛。所述交联方法可当然地用于由上所获得的胶原材料。
因此， 可将胶原和胶原材料交联以增加其机械强度。所述交联步骤因此在该方法 的最后步骤 d) 之后进行， 导致获得胶原材料。例如， 其为通过将胶原材料浸没于包含选自 甲醛、 戊二醛、 氧化的糖原和氧化的支链淀粉的交联剂的浴中来进行的。
特别有利地， 交联可相反地在一个单一步骤中发生， 但以顺次方式随着胶原的凝 结和纤维化发生。在该情况下， 将不与胶原在酸性 pH 反应的醛试剂添加至起始胶原溶液然 后进行氨处理以获得至少大于 8 的 pH。
所述醛交联剂优选选自多糖， 更特别地氧化的多糖。 优选地， 所述醛交联剂选自下 组： 氧化的糖原和氧化的支链淀粉。可用于本发明方法的交联剂为， 例如， 本领域技术人员 已知的氧化的淀粉， 氧化的右旋糖酐和氧化的纤维素。优选地， 所述醛交联剂是氧化的糖 原。
将交联剂以从 0.05、 0.1、 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3、 3.5、 4、 4.5 至 5 的醛交联剂的 CHO比对于胶原的 NH2 的比例范围添加。交联剂的比例可由本领域技术人员根据所需的交联率 进行调整。因此， 待添加至胶原溶液的交联剂的量可使用本领域技术人员的一般知识来确 定。
优选地， 由此制备了选定的氧化的多糖的浓缩 (15％ ) 水溶液。 氧化率和待添加的 交联剂的量是根据所需的吸收和所寻求的机械特性确定的。 然后可以将交联剂以完美控制 和可重现的量添加至胶原 ( 不像例如通过甲醛蒸汽或浸没于浴进行的交联 )。 在此， 仅添加 的交联剂可参与反应。在浇注或成型之前将交联溶液添加至胶原溶液， 即在减压下匀浆结 束时添加。 所得的介质是胶原和交联剂的均一混合物， 尽管状物两者之间的键合尚未形成， 因为该混合物尚未达到碱性 pH。后续步骤与胶原的纤维化相同， 其中纤维化和交联以此顺 序连续进行。
本领域技术人员能够调适氨的量和暴露时间以取得所需的纤维化和交联。
本发明方法的该步骤由于几个原因是重要的。通过醛多糖的交联已描述于文献 (Gagnieu CH 和 Forest PO， EP0862468)。此种交联可通过下述方法进行， 将待交联的材料 浸没于氧化的多糖溶液中， 或者将氧化的多糖添加至该材料然后将干燥产物浸没于浴中， 使得交联反应能够发生 (pH 增加 )。一般而言， pH 的变化是通过缓冲液进行的。考虑到公 知的交联原理 (Maillard 反应→交联剂的 CHO 基团与胶原的 NH2 基团的反应 )， 应避免使用 自身具有胺残基的碱改变 pH。 因此， 在氨的存在下， 该理论预测氧化的多糖会与氨的氨基反 应并接着会失活。因此交联无法进行。
实践中， 结果发现氨的存在令人满意地改变了胶原凝胶的 pH 以使得不仅纤维化 而且交联能够进行。 以非常令人惊讶的方式， 交联以有效的速率进行， 因为本应必然发生在 氨和交联剂的醛之间， 从而使后者失活的 Mailard 反应不存在或非常弱， 或无法与氧化的 多糖的醛基团和胶原的赖氨酸氨基之间的交联反应相竞争。 这可由下述事实说明 ： 首先， 以 此方式交联的材料不再溶于酸性水性介质， 并与非交联材料相比， 在与蛋白分解酶接触时 具有较少的降解， 其次， 水合形式的材料的机械特性， 特别是机械强度， 与非交联材料相比 也有所改善。
本发明还涉及可通过本发明的方法获得的胶原材料。优选地， 所述胶原材料是交 联的。所述胶原材料可例如包括胶原膜、 胶原线状物、 胶原管状物、 胶原海绵状物或胶原凝 胶。
因此， 本发明还涉及可通过本发明的方法获得的胶原薄膜、 线状物和管状物。 在一 个实施方案中， 本发明涉及可通过本发明方法获得的胶原膜。
根据本发明的方法使得能够制备从数微米至数百微米范围的不同厚度的干燥膜。 一般用于确保引导的瘢痕形成 ( 维持切割平面 ) 或组织替代物 ( 泌尿科、 妇科、 心脏、 胸部、 血管、 关节、 消化道、 整形外科、 脊椎、 神经科、 骨科、 创伤、 牙科、 口腔科和颌面手术中 )， 用于 引导的组织瘢痕形成 ( 硬膜 (dura matter)、 牙龈、 骨、 神经、 腱、 韧带、 内脏、 心包、 腹膜、 一 般结缔组织、 真皮、 肌肉、 软骨 ) 的厚度是 30μm 至 200μm。
因此， 本发明涉及可通过本发明方法获得、 具有 30μm 至 200μm 的干燥厚度的胶 原膜。优选地， 所述膜是交联的。
有利地， 所述膜包含具有 50μm 至 150μm 干燥厚度的非孔状胶原单层。
在一个实施方案中， 本发明的目标涉及具有 80μm 至 120μm 的干燥厚度， 12mg/cm2 至 16mg/cm2 的密度， 低于 6 的溶胀比， 大于 1N 的缝线保持强度， 大于 4MPa 的屈服强度 和少于 35％的通过胰蛋白酶的酶降解百分比的胶原膜。
在一个优选实施方案中， 本发明涉及具有 4 至 6 的溶胀比， 1N 至 2.5N 的缝线保持 强度， 4MPa 至 7MPa 的屈服强度和 20％至 35％的通过胰蛋白酶的酶降解百分比的如上所述 的胶原膜。
溶胀比的测量如下所述 ： 将 20mg 材料在 37℃浸没于 1X 磷酸盐缓冲盐水， pH 7.4 进行 60 分钟。在一小时之后， 用吸收纸去除过量水并再次称量样品。溶胀比是通过湿材料 的重量对干燥材料的重量的比来计算的。
机械应力 ( 缝线保持强度和屈服强度 ) 的测量是在润湿的 5mm 宽试管中使用拉伸 强度测试台进行的。对于缝线保持强度， 将编织的 3-0 聚酰胺缝线穿过膜， 然后使用拉伸强 度测试台测量使缝线断裂所施加的最大力。
为了确定通过胰蛋白酶的酶降解， 将重量为 10mg 至 20mg 的材料碎片浸没于 3ml 的 1XPBS， pH 7.6， 并将 500 单位的胰蛋白酶添加至样品。在降解 48 小时之后， 收集、 脱水 并称重消化的样品。然后计算相对于起始重量的重量丧失。
本发明还涉及用可吸收的的不可吸收的纺织品强化的胶原膜。 所述经纺织品强化 的膜构成颅顶强化材料， 并特别适于内脏和泌尿生殖系统手术或适于强化、 延伸或替代韧 带或腱的韧带补片 (ligament patch)。 因此， 本发明的另一个目的涉及复合材料， 其包含在一侧由如上所述的胶原材料 覆盖的纺织品， 或由其组成。
特别地， 其可为在其一侧携带本发明的胶原膜的纺织品。此种假体织物及其制造 方法， 描述于， 例如 US6451032。
本发明的织物强化的胶原膜可进一步根据本领域技术人员公知的方法来制造。
在本发明的上下文中， 此种方法可包括下述步骤 ：
- 制备酸性形式的胶原水溶液，
- 添加在酸性 pH 非反应性的醛交联剂，
- 对胶原水溶液进行模塑或浇注，
- 将所述纺织物沉积于胶原上，
- 通过用氨处理使所述胶原水溶液凝结和交联，
- 去除氨并获得胶原材料。
根据如上所述的方法在一侧用纺织品强化的膜特别适于颅顶手术。
或者， 所述方法可包括下述步骤 ：
- 制备酸性形式的胶原水溶液，
- 添加在酸性 pH 非反应性的醛交联剂，
- 对胶原水溶液进行模塑或浇注，
- 将纺织品纳入胶原中，
- 通过用氨处理使所述胶原水溶液凝结和交联，
- 去除氨并获得所述胶原材料。
因此， 在其两侧包含本发明的膜的纺织品特别适于， 例如韧带手术。
因此， 本发明的另一个目的涉及复合材料， 其包含用如上所述的胶原材料覆盖其
两侧， 更特别是每一侧的纺织品， 其中特别是该纺织品可容纳于所述胶原材料中。
将本发明的胶原材料与纺织品组合的其他方法对于本领域技术人员是已知的。
因此， 本发明还涉及本发明的胶原材料， 特别是膜， 与纺织品组合。
本发明的方法还导致制备管状物以确保在神经、 腱、 韧带和血管手术中引导器官。 用于该适应症的膜亦可为卷拢的和通过缝线和 / 或胶封闭为筒的。
最后， 所述方法使得能够制备厚度大于 200μm 的多孔或无孔状 3D 基质， 其使得能 够在手术植入所述材料以供再生医学中的应用时或之前接种细胞， 但不限于此， 且其使得 供心脏应用、 硬膜再生和软组织和硬组织的引导的可缝性和弹性补片可以获得。
实施例
实施例 1 ： 酸性腱纤维胶原的产生
→腱的溶胀
清理一千克来自猪足部的腱去除肌肉和腱膜组织。将其在 20℃ (±2℃ ) 在缓慢 搅拌下浸没于 25l 的 0.3M 乙酸水溶液中 10 日。
→研磨腱
将获得的三升悬液以 3000rpm 在刀式粉碎机 (knife mill) 中粉碎 2 分钟。 将介质 用 2l 水稀释， 然后匀浆 1 分钟。将介质在具有 200μm 孔径大小的过滤器上过滤， 并用 0.6M NaCl 调整滤过物以沉淀胶原。 →胶原的回收和洗涤
将悬液过滤或离心以从上清分离沉淀。收集沉淀并将其在 10l 的 0.6MNaCl 中在 搅拌下洗涤至少 1 小时 ； 再次通过在织物上过滤或离心收集沉淀。洗涤步骤可根据最终胶 原的所需纯度进行所需次数的洗涤 ( 理想为两次 )。
→病毒失活和洗涤
将沉淀和旋转干燥的胶原在搅拌下溶解 16 小时于水至 1％。将介质的浓度调至 1M NaOH， 并在 20℃将溶液搅拌 1 小时。 在失活步骤结束时， 用 6M 盐酸中和溶液直至胶原沉 淀。通过过滤或离心回收胶原。可将胶原再次在 10l 的 0.6M NaCl 中洗涤， 然后通过在织 物上过滤或通过离心收集。洗涤步骤可根据最终胶原的所需纯度进行所需次数的洗涤 ( 理 想为两次 )。
→收获和干燥
在纯化工艺结束时， 将沉淀的胶原旋转干燥， 然后在丙酮浴中干燥。 将胶原在控制 气流下最终干燥以去除剩余的丙酮， 然后在例如 -20℃储存。
实施例 2 ： 酸性腱纤维胶原的批次的表征
将 603mg 具有 17.05％水含量的酸性腱纤维胶原在磁力搅拌下分散于 500ml 去矿 物质水中 16 小时。将具有 50μm 孔径的织物置于容器上的 9cm 直径的圆柱形支持物。将 一定体积的胶原溶液以不超过 4cm 高度的方式倾于织物上。将 7cm 直径的叶片置于距织物 2cm 处， 并以 80rpm 旋转 ； 将胶原溶液逐渐流过织物。 当上部腔室中所含的体积不再减少时， 以不超过 4cm 高度的方式重新加载系统。进行所述操作直至制备的溶液耗尽。在系统平衡 时， 将渗余物用 3x50ml 的 0.05M 乙酸用相同系统洗涤， 而保持各自的压力差。收集上部级 分。
回收下部级分并继续以相同方式继续在具有 5μm 孔径的织物上进行分析。收集
渗余物以及滤过物。
将三个级分， 即来自 50μm 过滤的渗余物和来自 5μm 过滤的渗余物和滤过物调 至 0.6M NaCl， 并通过离心回收胶原， 然后在两个 70％丙酮和三个 100％丙酮的浴中干燥。 通过在空气流下干燥来去除过量的丙酮。称量级分， 并将其与收集的总重量相比较。分析 显示 6.5 ％的纤维保留在 50μm 过滤器上， 27 ％的纤维穿过 5μm 过滤器， 因此 66.5 ％为 5μm-50μm。
实施例 3 ： 交联胶原膜 / 薄膜 #1 的制备
将 800mg 的酸性腱纤维胶原在机械搅拌下悬于 100ml 水中进行 16 小时。将粘稠 的悬液以 4mg 胶原 /cm2 的密度倾倒至模中。 将含有所述胶原溶液的模在 20℃置于含有 2ml 的 30％氨的 3l 气密外壳中 24 小时。 将凝胶置于外壳中以用氨和水分吸收器去除过量的氨 以获得厚度大约 40μm 的薄膜。所述薄膜可照原样使用或通过浸没于不同浓度的甲醛、 戊 二醛、 氧化的糖原或氧化的支链淀粉浴中以 2 分钟至 24 小时的时间进行交联。通过将薄膜 在 pH 8 浸没于 0.1M 甘氨酸溶液 2 小时来使交联剂失活。然后再次干燥薄膜。
例如， 将在第一次干燥之后获得的薄膜在 0.1％甲醛浴在 pH 8 中浸没 1 小时， 然后 在 0.1M 甘氨酸浴， pH 8 中漂洗 2 小时。在用水漂洗之后， 再次干燥薄膜。
实施例 4 ： 交联胶原膜 #2 的制备
为了获得含有 10mg 胶原 /cm2 的膜， 将 100g 的胶原在机械搅拌下悬于 12.5l 水中 进行 16 小时。与此同时， 制备在 pH 7.7 磷酸缓冲液中溶解至 15％的 2.5g 的氧化的糖原， 并在所述 16 小时结束时添加至悬液。在匀浆之后， 将溶液倾倒至 1m2 模中 ( 或等同物 )。 将含有胶原溶液的模在 20℃置于含有 160ml 的 32％均匀分布的氨的大约 300l 气密外壳中 48 小时。在纤维化和交联期结束时， 将凝胶置于外壳中以用氨和水分吸收器去除过量的氨 以获得大约 100μm 厚度的膜。
实施例 5 ： 实施例 4 中制备的膜的溶胀比的测量
精确称量 20.5mg、 22mg 和 20mg 材料的三个样品， 并将其在 37℃浸没于 3ml 的 1X PBS， pH 7.4 中 1 小时。在一小时后， 去除来自每个样品的多余水分， 并再次称量样品。结 果如下所述 ：
实施例 6 ： 通过氧化的支链淀粉交联的酸性纤维胶原的海绵状物
酸性纤维胶原的水溶液是通过将 0.8g 的酸性纤维胶原混合于 100ml 水中来获得 的。将介质在 20℃搅拌 16 小时。将含有 1.4 摩尔醛 / 摩尔糖的 28mg 的支链淀粉在 75℃ 在 1ml 的 0.1M 磷酸盐缓冲液， pH 7.7 中加热， 直至完全溶解。在冷却至 20℃之后， 将所述 溶液在搅拌下倾倒入 0.8％胶原溶液。 将均一介质倾倒至模中至 5mm 的高度， 并转移至含有 3ml 的 28％氨的大约 3l 体积的气密外壳中进行 16 小时。然后将含有所述凝胶的装置置于 含有氨吸收器的气密外壳中直至去除外壳中的所有氨。然后冻结胶原凝胶， 然后将其冻干
以得到交联的 atelocollagen 的海绵状物。
实施例 7 ： 交联均一性的测量
通过实施例 4 的方法直至交联步骤制备大约厚度为 1cm 的凝胶。
在该交联步骤结束时， 将凝胶从模中取出 (unmold)， 大约从中间在水平方向切成 两块， 并分别将两部分干燥。
从分别对应于凝胶外侧和内侧部分的区域取 “外侧” 和 “内侧” 材料样品 ( 每个大 约 10mg)。
交联速率是通过用 TNBS(2， 4， 6- 三硝基苯磺酸 ) 测定在胶原中保持游离的胺来确 定的。所述 TNBS 试剂特异性与赖氨酸残基和游离末端氨基酸的胺反应。
取内侧和外侧样品， 并在 60℃在水 / 丙醇溶液 (1ml) 中温育 1 小时。添加稀释至 1/120 的 1ml TNBS 和 500μl 的 8％碳酸氢盐。反应在 40℃进行 3 小时。
在冷却之后， 添加 200μl 的 6N HCl 以淬灭反应。用 5ml 的乙酸乙酯提取过量的 TNBS。酸水解 (3ml 的 6N HCl 进行 1.25 小时 ) 释放所有的氨基酸。以与过量 TNBS 相同方 式提取 N-TNBS 末端氨基酸。
在充足稀释之后， 在 345nm 处测量水相的吸光度。根据 Kakade 等所述的实验方案 测得的在 345nm 处的复合物的摩尔消光系数为 1.46·10-4M-1·cm-1， 这使得能够计算在膜中 保持游离的赖氨酸的量。结果表示为 μmol 游离赖氨酸每 mg 膜。
对于用氧化的糖原以 0.4 氧化的糖原的 CHO 对 1NH2 的比例交联的膜， 结果如下所 述：
μmol 游离赖氨酸 /mg 膜 外侧样品 内侧样品
0.161 0.150因此， 交联差异为 3.5％， 其为 ((0.161-0.150)/(0.161+0.150)x100)。外侧部分 和内侧部分的交联率大约相同。因此， 在整个材料厚度中， 交联十分均一。
实施例 8 ： 交联的测量
根据实施例 4 中所述方法制备所谓 “交联的” 膜， 包括添加氨的步骤。
根据实施例 4 中所述方法制备所谓 “非交联的” 膜， 其中省略了添加氨的步骤。
可使用差示扫描量热法 (DSC) 测量交联。所述方法测量待分析的样品和参照之间 的热转移的差异。
使用 DSC 检测相变 ：
·玻璃转变温度 (Tg)
·融合或变性温度
·反应焓 ( 以确定聚合物的交联率 )。
分析是在惰性气体 ( 例如氮或氩 ) 流下进行的， 以避免任何研究的材料与熔炉中 空气的反应。
对于胶原， 交联增加变性温度。为了阐明在氨蒸汽中温育含有交联剂的胶原溶液导致胶原与交联剂之间稳定化学交联键合的形成， 确定了交联膜和非交联膜的 DSC 分布 (profile)。
变性温度 (℃ ) 交联膜 非交联膜
49.62 42.37因此， 交联膜的变性温度明显高于非交联膜。 因此， 在氨蒸汽中温育溶液过程中明 显发生了醛交联剂与胶原之间的反应。
参考文献
Forest PO， Karoum R， Gagnieu CH.Influence of gradual introduction of hydrophobic groups(stearic acid)in denatured atelocollagen on fibroblasts behavior in vitro， J Biomed Mater Res A.2007 Mar 1 ； 80(3) ： 758-67.
Gagnieu CH， Forest PO.In vivo biodegradability and biocompatibility Biomed ofporcine type I atelocollagen newly crosslinked by oxidized glycogen， Mater Eng.2007 ； 17(1) ： 9-18).
Rousseau CF 和 Gagnieu CH.In vitro cytocompatibility of porcine type I atelocollagen crosslinked by oxidized glycogen.Biomaterials， 2002.23(6) ： p.1503-10.
Kakade ML， Liener IE.Determination of available lysine in proteins.Anal Biochem， 1969 ； 27(2) ： 273-280
专利文献
WO2007/147739
FR2810889
FR2877669
EP0862468
US493154616