一种精子的冷冻方法及其冷冻液.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010519566.7	申请日：	2010.10.26
公开号：	CN102450248A	公开日：	2012.05.16
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A01N 1/02申请公布日:20120516\|\|\|公开
IPC分类号：	A01N1/02	主分类号：	A01N1/02
申请人：	陈浩杰
发明人：	陈浩杰
地址：	215400 江苏省苏州市太仓市城厢镇大庆锦绣新城涵乐苑17幢304室
优先权：
专利代理机构：	北京连和连知识产权代理有限公司 11278	代理人：	贺小明
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内容摘要

本发明涉及一种精子的冷冻方法，其主要包括步骤：1)将精液与冷冻液按1∶1的比例稀释混匀；2)4℃缓慢降温，3h后用0.25～0.35ml塑料细管分装封口，置于悬浮物上，距液氮面4～6cm，其温度为-90～-95℃；3)10～15分钟后投入液氮中。本发明提供的精子冷冻方法，操作简单，而且冻融后的精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率。

权利要求书

1：一种精子的冷冻方法，其特征在于，包括步骤： 1) 将精液与冷冻液按 1 ∶ 1 的比例稀释混匀； 2)4℃缓慢降温， 3h 后用 0.25 ～ 0.35ml 塑料细管分装封口，置于悬浮物上，距液氮面 4 ～ 6cm，其温度为 -90 ～ -95℃ ； 3)10 ～ 15 分钟后投入液氮中。
2：根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤 1) 中所述的冷冻液含有：去离子水、 Tris·HCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。
3：根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于，所述的冷冻液通过下述方法获得： 100ml 去离子水中加入 3.52gTris·HCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。
4：一种冷冻液，其特征在于，含有：去离子水、 Tris·HCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。
5：根据权利要求 4 所述的冷冻液，其特征在于，每 100ml 冷冻液中包含 76ml 由去离子水、 Tris·HCL、柠檬酸和葡萄糖组成的基础液以及 20ml 卵黄和 4ml 甘油；所述基础液中各组分的比例为去离子水 ∶ Tris·HCL ∶ 柠檬酸 ∶ 葡萄糖＝ 100ml ∶ 3.52g ∶ 1.96g ∶ 1.59g。
6：权利要求 5 所述的冷冻液的制备方法，其特征在于，包括步骤： 100ml 去离子水中加入 3.52gTris·HCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。
7：权利要求 4 或 5 所述的冷冻液在冷冻精子中的应用。

说明书

一种精子的冷冻方法及其冷冻液
    技术领域本发明属于生物工程领域，涉及一种冷冻处理方法，尤其涉及一种精子的冷冻方法及其冷冻液。
     背景技术卵母细胞胞质内单精子注射技术 (ICSI) 作为辅助受精的一种手段，在短短几十年里得到了迅猛的发展，就 ICSI 应用的性质和范围来看，当前 ICSI 的应用可以归为两大类，一是它可以解决精子本身因素及输卵管阻塞等原因所导致的一系列不育问题，故而被广泛用于生殖医学的不育症治疗；二是作为一种生物技术用于生物工程领域，对畜牧生产、野生动物保护和受精机理等发育生物学基础理论的研究均具有非常重要的意义。
     ICSI 技术通常包括精子和卵子的准备或预处理、精子胞质内显微注射、注射卵的激活以及注射卵体外发育情况的观察与评定。而精子的质量是 ICSI 技术成功的重要因素。
     近些年来，尽管人们对精子冷冻的研究日益深入，但冷冻精子的存活及受精尚未有显著的改善。
     发明内容本发明的目的在于提供一种冷冻精子的方法，其主要包括步骤：
     1) 将精液与冷冻液按 1 ∶ 1 的比例稀释混匀；
     2)4℃缓慢降温， 3h 后用 0.25 ～ 0.35ml 塑料细管分装封口，置于悬浮物上，距液氮面 4 ～ 6cm，其温度为 -90 ～ -95℃ ；
     3)10 ～ 15 分钟后投入液氮中。
     步骤 1) 中所述的冷冻液含有：去离子水、 Tris·HCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。所述的冷冻液通过下述方法获得： 100ml 去离子水中加入 3.52gTris·HCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。
     本发明还提供一种冷冻液，其主要含有：去离子水、 Tris·HCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。每 100ml 冷冻液中包含 76ml 由去离子水、 Tris· HCL、柠檬酸和葡萄糖组成的基础液以及 20ml 卵黄和 4ml 甘油；所述基础液中各组分的比例为去离子水∶ Tris· HCL ∶柠檬酸∶葡萄糖＝ 100ml ∶ 3.52g ∶ 1.96g ∶ 1.59g。所述的冷冻液通过下述方法制备： 100ml 去离子水中加入 3.52gTris·HCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。
     所述的冷冻液可以用于冷冻精子。
     本发明提供的精子冷冻方法，操作简单，而且冻融后的精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率。
     为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
     附图说明
     图 1 是操作盘示意图；图 2 是雌雄原核和第一二极体示意图；图 3 是 2- 细胞胚胎示意图；图 4 是 4- 细胞胚胎示意图；图 5 桑椹胚示意图；图 6 是囊胚示意图；图 7 是扩张囊胚示意图；图 8 是孵化囊胚示意图；图 9 是冻融后活的胚胎示意图；图 10 是冻融后死的胚胎；图 11 是显微操作示意图；图 12 是出生的仔兔。具体实施方式
     实施例 1 精子的准备
     1. 新鲜精子：
     取兔 (6 ～ 8 月龄新西兰兔， SPF 级，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号： SCXK< 沪 >2004-0005) 新鲜精液用 D-PBS 液 ( 商购 )2000r/min 离心洗涤三次然后缓 100％湿度下的培养箱中缓慢上游 10 分钟。慢的加入 D-PBS 液，放在 38.5℃、 5％ CO2、 2. 冻融的精子：
     采集兔精液与冷冻液 ( 冷冻液的配方为： 100ml 去离子水中加入 3.52gTris· HCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 100ml 冷冻液∶ 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油，混匀分装， 4 ℃冰箱保存。)1 ∶ 1 稀释混匀， 4 ℃缓慢降温， 3h 后用 0.25 ～ 0.30ml 塑料细管分装封口，置于漂浮器上 ( 距液氮面 4cm， -90--95℃ )， 10 分钟后投入液氮。将装有要解冻精子的细管置于 42℃水浴中 20 秒。兔冻融精液直接放入 D-PBS 液中，在 38.5℃、 5％ CO2、 100％湿度下的培养箱中缓慢上游 10 分钟。
     实施例 2 卵母细胞的准备
     1. 新鲜卵母细胞
     供体母兔为 6-8 月龄、体重 3kg 左右的初产新西兰兔，按 Kennelly 和 Foote(1965) 的方法，即连续 3 天每天 2 次 ( 间隔 12h) 每次皮下注射 FSH50IU/ 只 ( 宁波第二激素厂生产 )，最后一次注射 FSH 后 12h，耳缘静脉注射 HCG( 宁波第二激素厂生产 )100IU/ 只并与结扎公兔交配， HCG 注射后 14、 16、 18h 进行取卵，在无菌条件下剪下输卵管，吸取 10ml 的冲卵液，由喇叭口向宫管结合部方向冲卵，每侧用 5mL 冲卵液，将卵丘卵母细胞复合体放在装有含 0.2％透明质酸酶的 D-PBS 液的 Eppendorf 管中，在涡旋混合器上震荡消化 5min 去除颗粒细胞，在体视显微镜下捡出经酶消化的卵母细胞，用培养液洗涤三次，然后放入 38.5℃、 100％湿度下平衡 12h 以上的培养液微滴中，直到显微注射。 5％ CO2、
     2. 冻融的卵母细胞
     1) 卵母细胞的冷冻
     冷冻前 2h 左右将室温调至 25℃，同时将所有溶液及试验器具在 25℃室温下平衡 1 ～ 2h。采用 0.25 ～ 0.30ml 塑料细管 (France)，用记号笔标记，然后用细乳胶管与注射器相连接。按顺序吸入 0.5mol 蔗糖溶液 (5.5cm) →空气 (1.5cm) →玻璃化溶液 (0.5cm) → 空气 (0.5cm) →玻璃化溶液 (1.5cm)，平行放置于操作台上，将卵母细胞移入玻璃化溶液中洗一次，然后将 10 枚卵母细胞置于细管中的玻璃化溶液中，卵母细胞导入后依次再吸入空气 (0.5cm) →玻璃化溶液 (0.5cm) →空气 (0.5cm)，最后吸 0.5mol 蔗糖溶液 (1cm)。用封口机将塑料细管封口。将含有卵母细胞的细管一端直接投入液氮，另一半用液氮气熏蒸冷冻，待蔗糖部分冻结后转入液氮罐中长期保存，从卵母细胞移入玻璃化溶液到细管投入液氮为止整个过程为 1 分钟，如果室温调至 20℃，则整个过程需要 2 分钟。
     2) 卵母细胞的解冻
     塑料细管从液氮中取出后，快速置于 25℃水浴中轻轻摆动约 10 秒钟，待细管中蔗糖溶液段由乳白色变为透明后取出，用吸水纸吸去细管表面水分，剪去细管两端的封口，用吸有 1mL0.5mol 蔗糖溶液的注射器将细管内容物冲入表面皿内，在实体显微镜下回收卵母细胞，回收的卵母细胞移入 0.5mol 蔗糖溶液内平衡 5 分钟去除乙二醇和聚蔗糖后，再转入 D-PBS 液中，然后待卵母细胞恢复正常形态后再用培养液洗涤 2-3 次继续培养。解冻后放入 38.5℃、 5％ CO2、 100％湿度下平衡 12h 以上的培养液微滴中至少 3h，然后进行操作。
     实施例 3 将精子注射到卵母细胞中
     1. 操作盘的制作
     操作盘的设计方式按《小鼠胚胎操作实验手册》第三版 ICSI 章节所介绍的样式设计，即于 90mm 细胞培养皿盖上依次做成 4-5 排操作小滴，每排操作液滴由三个 3ul 10％ PVP( 聚乙烯吡咯酮 ) 滴和三个 5ulmTCM199 滴组成，吸取 2ul 浮游的上层精子加入到第二个 PVP 滴中，卵子置于第四个 mTCM199 滴中，盘中间其余小滴都做 holding 管和注射针的清洗滴用，全部操作滴做好后，最后用 3-5ml 石蜡油覆盖整个操作盘，操作盘操作滴的设计样式见图 ( 图 1)。
     2.PVP 滴中精子的加入
     PVP(1gPVP 倒入 10mlD-PBS 液中配置而成 ) 滴中根据精子密度的大小按合适的比例加入，每个 PVP 滴中混合 2.0ul 精子悬浮液，具体操作是用 10ul 移液枪吸取 2.0ul 的精子游离液，在体视显微镜下，将枪头深入到 PVP 滴中，吹出精子悬浮液到 PVP 滴中，反复吹吸操作数次，使精子在 PVP 滴中混合均匀，精子加完后，覆盖石蜡油。
     3. 显微操作系统的装针与调试
     在操作系统注射针时，用一根前端细长的水银塑料吸管吸取 1 ～ 2ul 水银，把水银吸管前端细长的部分从注射针的后端伸入进注射针，在离注射针末段 1.0 ～ 1.5cm 的位置缓慢吹出吸管内的水银，使水银柱在针管中长度在 2 ～ 3mm 之间即可，水银灌好后，把注射针连接到 Piezo 操作臂上。
     注射前，用捡卵针把 5-10 枚卵母细胞移入操作液滴中，然后用注射针抓取一个精子放入第三个 PVP 液滴中，用针尖在精子尾部迅速划过进行制动，看到尾部打折即可，随后从尾部吸入注射针内。注射时第一极体在 12 点钟位置，从 3 点钟的位置进针，设置强度和频率参数为 2×2 或 3×2，激发 1 至 2 个脉冲击穿透明带，继续进针同时将精子小心的推至针
     尖处，直至针尖插入卵母细胞深处，几乎贴近对侧质膜时，调换参数到 1×1 的档，用 Piezo 弱脉冲击穿卵母细胞质膜，将精子吐出，回吸注入卵内多余的液体，轻轻退针，完成一次注射。依次操作，每次注射从开始制动到注射完毕在 2min 内完成，所有显微操作在室温下完成。
     4. 受精卵和孤雌活化卵的判定标准
     注射后 6-8h 检查原核和第二极体形成情况，只有当出现 2 原核 2 极体 (2PN、 2PB) 时判定为受精；当出现 1 原核 1 极体 (1PN、 1PB)、 1 原核 2 极体 (1PN、 2PB)、 2 原核 1 极体 (2PN、 1PB) 时判定为活化。
     实施例 4 受精卵的培养
     显微注射后，注射卵经培养液洗涤三次后，移入平衡好的培养液微滴中，放在 38.5℃、 5％ CO2、 100％湿度下的培养箱中培养 3-4 天，培养 6 ～ 8h 后观察原核和第二极体形成情况，每隔 12h 观察并记录卵裂情况，间隔 24h 换液，适时照相。
     实施例 5 胚胎冷冻和解冻
     方法同实施例 2 中的卵母细胞的冷冻和解冻方法。
     实施例 6 胚胎移植
     新鲜的 ICSI 胚胎或冻融的胚胎，在 TCM199 培养液 (18mlTCM199 中加入 2mlFBS、 0.00275g 丙酮酸钠、 0.00075gEDTA、 0.0015g 青霉素、 0.001g 链霉素，充分混匀，调 pH 为 7.3， 0.22um 滤器过滤分装， 4℃冰箱保存 ) 中培养 2-3 小时，形态正常的胚胎供移植用，受体为注射 HCG 后假孕 60h、生过一胎、体质健康、体重 3.5kg 左右的成年母兔。受体兔在手术前禁食 12h。首先用 0.5mL 速眠新 ( 即 846 合剂 ) 肌肉注射麻醉，待兔麻醉后保定，在两肷部附近分别剪毛、消毒、手术开口，暴露子宫，用针头在子宫体上扎一小孔，然后用头部钝化的移卵管将胚胎移入子宫中，每侧子宫移入 7-8 枚胚胎，每只母兔 15-16 枚胚胎。整个手术过程在无菌条件下进行，尽量在较短时间内 (40-50min) 完成手术，对术后母兔精心饲养管理。
     实施例 7 结果分析
     采用 SSPS 13.0 中的卡方 (x2) 检验对结果进行显著性分析，以 P ＜ 0.05 为差异显著性判定标准。
     请参照图 2 ～ 12，其中图 2 是雌雄原核和第一二极体示意图；图 3 是 2- 细胞胚胎示意图；图 4 是 4- 细胞胚胎示意图；图 5 桑椹胚示意图；图 6 是囊胚示意图；图 7 是扩张囊胚示意图；图 8 是孵化囊胚示意图；图 9 是冻融后活的胚胎示意图；图 10 是冻融后死的胚胎；图 11 是显微操作示意图；图 12 是出生的仔兔。
     1. 不同卵龄时期取卵：
     HCG 注射后 14、 16、 18h 进行取卵，用新鲜活精子进行注射，激活用机械刺激的方法，第一极体在 12 点钟位置， 3 点钟的位置进针，分三组进行，每组重复 3 次，统计其受精率、囊胚率。结果见表 1。
     从表 1 中可以看出 hCG 注射后 14h 取卵，其卵裂率、桑椹胚率和囊胚率 (82.2％、 72.9％和 62.2％ ) 都比 16h(75.9％、 70.0％和 53.3％ ) 的高，但是差异不显著 (P ＞ 0.05) ； 18h 取的卵注射后不能卵裂，与 14h 和 16h 差异显著 (P ＜ 0.05)。可见，注射 HCG 后 14h 和 16h 取卵都可以，但是 14h 取卵最佳。表1注：相同字母差异不显著 (p ＞ 0.05)，不同字母差异显著 (p ＜ 0.05)
     2. 单精子注射及激活注射卵：
     按照注射操作情况和不同的激活处理方法进行配对分组，精子用新鲜活精子，卵子用新鲜卵母细胞，分三组，第一组用机械刺激；第二组为 5umol/L 离子霉素 (5min)+2mmol/L6-DMAP(3h) ；第三组为假性注射对照组，将注射后存活的卵母细胞随机分到各组，各处理组注射后卵母细胞的激活效果，以 ICSI 后卵母细胞的激活率、受精率和孤雌发育率进行衡量 ( 卵母细胞至少形成一个原核或发生卵裂计为激活，形成雌雄原核计为受精，在无精子注射的情况下至少形成两个原核或发生卵裂计为孤雌发育 )，每组重复 3 次。结果见表 2。
     从表 2 中可以看出，机械刺激组与离子霉素 +6-DMAP 组卵裂率 (82.2 ％和 81.1 ％ )，桑椹胚率 (72.9 ％和 66.2 ％ ) 差异不显著 (P ＞ 0.05)，但是囊胚率 (51.3 ％和 62.3％ ) 差异显著 (P ＜ 0.05)。离子霉素 +6-DMAP 组胚胎形态较好，囊胚率较高，激活方式离子霉素 +6-DMAP 更适合于兔 ICSI 卵的激活。
     表2
     注：相同字母差异不显著 (p ＞ 0.05)，不同字母差异显著 (p ＜ 0.05)， + 精子注射； - 未注射精子
     3. 用培养液培养 ICSI 兔胚胎：
     用 TCM199+10％ FBS+1.25mM 丙酮酸钠 +0.1mM EDTA 培养液进行培养，重复 3 次，统计其发育率。结果见表 3。
     从表 3 中可以看出 A 组和 B 组中 2- 细胞率 (84.5％和 79.0％ ) 差异不显著 ((P ＞ 0.05)，但是桑椹胚率 (69.0 ％和 58.0 ％ ) 和囊胚率 (57.1 ％和 38.7 ％ ) 差异显著 (P ＜ 0.05)。
     表3
     注：相同字母差异不显著 (p ＞ 0.05)，不同字母差异显著 (p ＜ 0.05)
     4.ICSI 后兔胚胎的体外发育：
     卵子用兔新鲜卵母细胞，对照组用兔新鲜活精子，实验组为冷冻后的活精子进行 ICSI，在表 1 ～ 3 结果的基础上的进行实验，每组重复 3 次，统计其体外发育率。结果见表 4。
     从表 4 中可以看出，新鲜精子组和冻融活精子组卵裂率 (81.1％和 68.8％ ) 和囊胚率 (62.3％和 40.4％ ) 差异显著 (P ＜ 0.05)，而桑椹胚率 (66.2％和 61.9) 差异不显著 (P ＞ 0.05)。可见冷冻后的兔精子仍具有非常好的受精能力。
     表4
     注：相同字母差异不显著 (p ＞ 0.05)，不同字母差异显著 (p ＜ 0.05)
     5. 冻融的兔卵母细胞的受精情况：
     精子用新鲜的兔精子，对照组为新鲜的兔卵母细胞，实验组为冷冻后活的卵母细胞进行 ICSI，在表 1 ～ 3 结果的基础上进行实验，每组重复 3 次，统计其体外发育率。结果见表 5。
     从表 5 中可以看出，冷冻后的兔卵母细胞卵裂能力很差，不能继续发育到囊胚。
     表5
     注：相同字母差异不显著 (p ＞ 0.05)，不同字母差异显著 (p ＜ 0.05)
     从上述结果可以看出，冻融后的兔精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率。
     虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

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1、(10)申请公布号 CN 102450248 A (43)申请公布日 2012.05.16 CN 102450248 A *CN102450248A* (21)申请号 201010519566.7 (22)申请日 2010.10.26 A01N 1/02(2006.01) (71)申请人陈浩杰地址 215400 江苏省苏州市太仓市城厢镇大庆锦绣新城涵乐苑 17 幢 304 室 (72)发明人陈浩杰 (74)专利代理机构北京连和连知识产权代理有限公司 11278 代理人贺小明 (54) 发明名称一种精子的冷冻方法及其冷冻液 (57) 摘要本发明涉及一种精子的冷冻方法，其主要包。

2、括步骤： 1) 将精液与冷冻液按 1 1 的比例稀释混匀； 2)4缓慢降温， 3h 后用 0.25 0.35ml 塑料细管分装封口，置于悬浮物上，距液氮面 4 6cm，其温度为 -90 -95 ； 3)10 15 分钟后投入液氮中。本发明提供的精子冷冻方法，操作简单，而且冻融后的精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 7 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 7 页附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种精子的冷冻方法，其特征在于，包括步骤：。

3、 1) 将精液与冷冻液按 1 1 的比例稀释混匀； 2)4缓慢降温， 3h 后用 0.25 0.35ml 塑料细管分装封口，置于悬浮物上，距液氮面 4 6cm，其温度为 -90 -95 ； 3)10 15 分钟后投入液氮中。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤 1) 中所述的冷冻液含有：去离子水、 TrisHCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。 3. 根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于，所述的冷冻液通过下述方法获得： 100ml 去离子水中加入 3.52gTrisHCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 76ml 。

4、基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。 4. 一种冷冻液，其特征在于，含有：去离子水、 TrisHCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。 5. 根据权利要求 4 所述的冷冻液，其特征在于，每 100ml 冷冻液中包含 76ml 由去离子水、 TrisHCL、柠檬酸和葡萄糖组成的基础液以及 20ml 卵黄和 4ml 甘油；所述基础液中各组分的比例为去离子水 TrisHCL 柠檬酸葡萄糖 100ml 3.52g 1.96g 1.59g。 6. 权利要求 5 所述的冷冻液的制备方法，其特征在于，包括。

5、步骤： 100ml 去离子水中加入 3.52gTrisHCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。 7. 权利要求 4 或 5 所述的冷冻液在冷冻精子中的应用。权利要求书 CN 102450248 A 2 1/7 页 3 一种精子的冷冻方法及其冷冻液技术领域 0001 本发明属于生物工程领域，涉及一种冷冻处理方法，尤其涉及一种精子的冷冻方法及其冷冻液。背景技术 0002 卵母细胞胞质内单精子注射技术 (ICSI) 作为辅助受精的一种手段，在短短几十年里得到了迅猛。

6、的发展，就 ICSI 应用的性质和范围来看，当前 ICSI 的应用可以归为两大类，一是它可以解决精子本身因素及输卵管阻塞等原因所导致的一系列不育问题，故而被广泛用于生殖医学的不育症治疗；二是作为一种生物技术用于生物工程领域，对畜牧生产、野生动物保护和受精机理等发育生物学基础理论的研究均具有非常重要的意义。 0003 ICSI 技术通常包括精子和卵子的准备或预处理、精子胞质内显微注射、注射卵的激活以及注射卵体外发育情况的观察与评定。而精子的质量是 ICSI 技术成功的重要因素。 0004 近些年来，尽管人们对精子冷冻的研究日益深入，但冷冻精子的存活及受精尚未有显著。

7、的改善。发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种冷冻精子的方法，其主要包括步骤： 0006 1) 将精液与冷冻液按 1 1 的比例稀释混匀； 0007 2)4缓慢降温， 3h后用0.250.35ml塑料细管分装封口，置于悬浮物上，距液氮面 4 6cm，其温度为 -90 -95 ； 0008 3)10 15 分钟后投入液氮中。 0009 步骤 1) 中所述的冷冻液含有：去离子水、 TrisHCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。所述的冷冻液通过下述方法获得： 100ml 去离子水中加入 3.52gTrisHCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基。

8、础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。 0010 本发明还提供一种冷冻液，其主要含有：去离子水、 TrisHCL、柠檬酸、葡萄糖、卵黄、甘油。每100ml冷冻液中包含76ml由去离子水、 Tris HCL、柠檬酸和葡萄糖组成的基础液以及 20ml 卵黄和 4ml 甘油；所述基础液中各组分的比例为去离子水 Tris HCL 柠檬酸葡萄糖 100ml 3.52g 1.96g 1.59g。所述的冷冻液通过下述方法制备： 100ml 去离子水中加入 3.52gTrisHCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀。

9、作为基础液； 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油获得 100ml 冷冻液。 0011 所述的冷冻液可以用于冷冻精子。 0012 本发明提供的精子冷冻方法，操作简单，而且冻融后的精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率。 0013 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。说明书 CN 102450248 A 3 2/7 页 4 附图说明 0014 图 1 是操作盘示意图； 0015 图 2 是雌雄原核和第一二极体示意图； 0016 图 3 是 2- 细胞胚胎示意图； 0017 图 4 是 4。

10、- 细胞胚胎示意图； 0018 图 5 桑椹胚示意图； 0019 图 6 是囊胚示意图； 0020 图 7 是扩张囊胚示意图； 0021 图 8 是孵化囊胚示意图； 0022 图 9 是冻融后活的胚胎示意图； 0023 图 10 是冻融后死的胚胎； 0024 图 11 是显微操作示意图； 0025 图 12 是出生的仔兔。具体实施方式 0026 实施例 1 精子的准备 0027 1. 新鲜精子： 0028 取兔 (6 8 月龄新西兰兔， SPF 级，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号： SCXK2004-0005) 新鲜精液用 D-PBS 液 ( 商购 )。

11、2000r/min 离心洗涤三次然后缓慢的加入 D-PBS 液，放在 38.5、 5 CO2、 100湿度下的培养箱中缓慢上游 10 分钟。 0029 2. 冻融的精子： 0030 采集兔精液与冷冻液 ( 冷冻液的配方为： 100ml 去离子水中加入 3.52gTris HCL、 1.96g 柠檬酸、 1.59g 葡萄糖混匀作为基础液； 100ml 冷冻液 76ml 基础液中加入 20ml 卵黄、 4ml 甘油，混匀分装， 4冰箱保存。)1 1 稀释混匀， 4缓慢降温， 3h 后用 0.25 0.30ml 塑料细管分装封口，置于漂浮器上 ( 距液氮面 4cm， -90-95 )。

12、， 10 分钟后投入液氮。将装有要解冻精子的细管置于 42水浴中 20 秒。兔冻融精液直接放入 D-PBS 液中，在 38.5、 5 CO2、 100湿度下的培养箱中缓慢上游 10 分钟。 0031 实施例 2 卵母细胞的准备 0032 1. 新鲜卵母细胞 0033 供体母兔为6-8月龄、体重3kg左右的初产新西兰兔，按Kennelly和Foote(1965) 的方法，即连续 3 天每天 2 次 ( 间隔 12h) 每次皮下注射 FSH50IU/ 只 ( 宁波第二激素厂生产 )，最后一次注射 FSH 后 12h，耳缘静脉注射 HCG( 宁波第二激素厂生产 )100IU/ 只并与。

13、结扎公兔交配， HCG 注射后 14、 16、 18h 进行取卵，在无菌条件下剪下输卵管，吸取 10ml 的冲卵液，由喇叭口向宫管结合部方向冲卵，每侧用 5mL 冲卵液，将卵丘卵母细胞复合体放在装有含 0.2透明质酸酶的 D-PBS 液的 Eppendorf 管中，在涡旋混合器上震荡消化 5min 去除颗粒细胞，在体视显微镜下捡出经酶消化的卵母细胞，用培养液洗涤三次，然后放入 38.5、 5 CO2、 100湿度下平衡 12h 以上的培养液微滴中，直到显微注射。 0034 2. 冻融的卵母细胞 0035 1) 卵母细胞的冷冻说明书 CN 102450248 A。

14、 4 3/7 页 5 0036 冷冻前 2h 左右将室温调至 25，同时将所有溶液及试验器具在 25室温下平衡 1 2h。采用 0.25 0.30ml 塑料细管 (France)，用记号笔标记，然后用细乳胶管与注射器相连接。按顺序吸入 0.5mol 蔗糖溶液 (5.5cm) 空气 (1.5cm) 玻璃化溶液 (0.5cm) 空气 (0.5cm) 玻璃化溶液 (1.5cm)，平行放置于操作台上，将卵母细胞移入玻璃化溶液中洗一次，然后将 10 枚卵母细胞置于细管中的玻璃化溶液中，卵母细胞导入后依次再吸入空气(0.5cm)玻璃化溶液(0.5cm)空气(0.5cm)，最后吸0.5。

15、mol蔗糖溶液(1cm)。用封口机将塑料细管封口。将含有卵母细胞的细管一端直接投入液氮，另一半用液氮气熏蒸冷冻，待蔗糖部分冻结后转入液氮罐中长期保存，从卵母细胞移入玻璃化溶液到细管投入液氮为止整个过程为 1 分钟，如果室温调至 20，则整个过程需要 2 分钟。 0037 2) 卵母细胞的解冻 0038 塑料细管从液氮中取出后，快速置于 25水浴中轻轻摆动约 10 秒钟，待细管中蔗糖溶液段由乳白色变为透明后取出，用吸水纸吸去细管表面水分，剪去细管两端的封口，用吸有 1mL0.5mol 蔗糖溶液的注射器将细管内容物冲入表面皿内，在实体显微镜下回收卵母细胞，回收。

16、的卵母细胞移入 0.5mol 蔗糖溶液内平衡 5 分钟去除乙二醇和聚蔗糖后，再转入 D-PBS 液中，然后待卵母细胞恢复正常形态后再用培养液洗涤 2-3 次继续培养。 0039 解冻后放入 38.5、 5 CO2、 100湿度下平衡 12h 以上的培养液微滴中至少 3h，然后进行操作。 0040 实施例 3 将精子注射到卵母细胞中 0041 1. 操作盘的制作 0042 操作盘的设计方式按小鼠胚胎操作实验手册第三版 ICSI 章节所介绍的样式设计，即于 90mm 细胞培养皿盖上依次做成 4-5 排操作小滴，每排操作液滴由三个 3ul 10 PVP(聚乙烯吡咯酮)滴和三个5ulm。

17、TCM199滴组成，吸取2ul浮游的上层精子加入到第二个 PVP 滴中，卵子置于第四个 mTCM199 滴中，盘中间其余小滴都做 holding 管和注射针的清洗滴用，全部操作滴做好后，最后用 3-5ml 石蜡油覆盖整个操作盘，操作盘操作滴的设计样式见图 ( 图 1)。 0043 2.PVP 滴中精子的加入 0044 PVP(1gPVP 倒入 10mlD-PBS 液中配置而成 ) 滴中根据精子密度的大小按合适的比例加入，每个 PVP 滴中混合 2.0ul 精子悬浮液，具体操作是用 10ul 移液枪吸取 2.0ul 的精子游离液，在体视显微镜下，将枪头深入到PVP滴中。

18、，吹出精子悬浮液到PVP滴中，反复吹吸操作数次，使精子在 PVP 滴中混合均匀，精子加完后，覆盖石蜡油。 0045 3. 显微操作系统的装针与调试 0046 在操作系统注射针时，用一根前端细长的水银塑料吸管吸取12ul水银，把水银吸管前端细长的部分从注射针的后端伸入进注射针，在离注射针末段 1.0 1.5cm 的位置缓慢吹出吸管内的水银，使水银柱在针管中长度在 2 3mm 之间即可，水银灌好后，把注射针连接到 Piezo 操作臂上。 0047 注射前，用捡卵针把 5-10 枚卵母细胞移入操作液滴中，然后用注射针抓取一个精子放入第三个 PVP 液滴中，用针尖。

19、在精子尾部迅速划过进行制动，看到尾部打折即可，随后从尾部吸入注射针内。注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为 22 或 32，激发 1 至 2 个脉冲击穿透明带，继续进针同时将精子小心的推至针说明书 CN 102450248 A 5 4/7 页 6 尖处，直至针尖插入卵母细胞深处，几乎贴近对侧质膜时，调换参数到 11 的档，用 Piezo 弱脉冲击穿卵母细胞质膜，将精子吐出，回吸注入卵内多余的液体，轻轻退针，完成一次注射。依次操作，每次注射从开始制动到注射完毕在 2min 内完成，所有显微操作在室温下完成。 004。

20、8 4. 受精卵和孤雌活化卵的判定标准 0049 注射后 6-8h 检查原核和第二极体形成情况，只有当出现 2 原核 2 极体 (2PN、 2PB) 时判定为受精；当出现 1 原核 1 极体 (1PN、 1PB)、 1 原核 2 极体 (1PN、 2PB)、 2 原核 1 极体 (2PN、 1PB) 时判定为活化。 0050 实施例 4 受精卵的培养 0051 显微注射后，注射卵经培养液洗涤三次后，移入平衡好的培养液微滴中，放在 38.5、 5 CO2、 100湿度下的培养箱中培养 3-4 天，培养 6 8h 后观察原核和第二极体形成情况，每隔 12h 观察并记录卵裂情况，。

21、间隔 24h 换液，适时照相。 0052 实施例 5 胚胎冷冻和解冻 0053 方法同实施例 2 中的卵母细胞的冷冻和解冻方法。 0054 实施例 6 胚胎移植 0055 新鲜的 ICSI 胚胎或冻融的胚胎，在 TCM199 培养液 (18mlTCM199 中加入 2mlFBS、 0.00275g 丙酮酸钠、 0.00075gEDTA、 0.0015g 青霉素、 0.001g 链霉素，充分混匀，调 pH 为 7.3， 0.22um滤器过滤分装， 4冰箱保存)中培养2-3小时，形态正常的胚胎供移植用，受体为注射 HCG 后假孕 60h、生过一胎、体质健康、体重 3.5kg 左。

22、右的成年母兔。受体兔在手术前禁食 12h。首先用 0.5mL 速眠新 ( 即 846 合剂 ) 肌肉注射麻醉，待兔麻醉后保定，在两肷部附近分别剪毛、消毒、手术开口，暴露子宫，用针头在子宫体上扎一小孔，然后用头部钝化的移卵管将胚胎移入子宫中，每侧子宫移入 7-8 枚胚胎，每只母兔 15-16 枚胚胎。整个手术过程在无菌条件下进行，尽量在较短时间内 (40-50min) 完成手术，对术后母兔精心饲养管理。 0056 实施例 7 结果分析 0057 采用 SSPS 13.0 中的卡方 (x2) 检验对结果进行显著性分析，以 P 0.05 为差异显著性判定标准。 0。

23、058 请参照图 2 12，其中图 2 是雌雄原核和第一二极体示意图；图 3 是 2- 细胞胚胎示意图；图 4 是 4- 细胞胚胎示意图；图 5 桑椹胚示意图；图 6 是囊胚示意图；图 7 是扩张囊胚示意图；图 8 是孵化囊胚示意图；图 9 是冻融后活的胚胎示意图；图 10 是冻融后死的胚胎；图 11 是显微操作示意图；图 12 是出生的仔兔。 0059 1. 不同卵龄时期取卵： 0060 HCG 注射后 14、 16、 18h 进行取卵，用新鲜活精子进行注射，激活用机械刺激的方法，第一极体在12点钟位置， 3点钟的位置进针，分三组进。

24、行，每组重复3次，统计其受精率、囊胚率。结果见表 1。 0061 从表 1 中可以看出 hCG 注射后 14h 取卵，其卵裂率、桑椹胚率和囊胚率 (82.2、 72.9和62.2)都比16h(75.9、 70.0和53.3)的高，但是差异不显著(P0.05) ； 18h 取的卵注射后不能卵裂，与 14h 和 16h 差异显著 (P 0.05)。可见，注射 HCG 后 14h 和 16h 取卵都可以，但是 14h 取卵最佳。说明书 CN 102450248 A 6 5/7 页 7 0062 表 1 0063 0064 注：相同字母差异不显著 (p 0.05)，不同字。

25、母差异显著 (p 0.05) 0065 2. 单精子注射及激活注射卵： 0066 按照注射操作情况和不同的激活处理方法进行配对分组，精子用新鲜活精子，卵子用新鲜卵母细胞，分三组，第一组用机械刺激；第二组为 5umol/L 离子霉素 (5min)+2mmol/L6-DMAP(3h) ；第三组为假性注射对照组，将注射后存活的卵母细胞随机分到各组，各处理组注射后卵母细胞的激活效果，以 ICSI 后卵母细胞的激活率、受精率和孤雌发育率进行衡量 ( 卵母细胞至少形成一个原核或发生卵裂计为激活，形成雌雄原核计为受精，在无精子注射的情况下至少形成两个原核或发生卵裂计为孤雌。

26、发育 )，每组重复 3 次。结果见表 2。 0067 从表 2 中可以看出，机械刺激组与离子霉素 +6-DMAP 组卵裂率 (82.2和 81.1 )，桑椹胚率 (72.9和 66.2 ) 差异不显著 (P 0.05)，但是囊胚率 (51.3和 62.3 ) 差异显著 (P 0.05)。离子霉素 +6-DMAP 组胚胎形态较好，囊胚率较高，激活方式离子霉素 +6-DMAP 更适合于兔 ICSI 卵的激活。 0068 表 2 0069 0070 注：相同字母差异不显著 (p 0.05)，不同字母差异显著 (p 0.05)， + 精子注射； - 未注射精子 0071 3. 。

27、用培养液培养 ICSI 兔胚胎： 0072 用TCM199+10FBS+1.25mM丙酮酸钠+0.1mM EDTA培养液进行培养，重复3次，统计其发育率。结果见表 3。说明书 CN 102450248 A 7 6/7 页 8 0073 从表 3 中可以看出 A 组和 B 组中 2- 细胞率 (84.5和 79.0 ) 差异不显著 (P 0.05)，但是桑椹胚率 (69.0和 58.0 ) 和囊胚率 (57.1和 38.7 ) 差异显著 (P 0.05)。 0074 表 3 0075 0076 注：相同字母差异不显著 (p 0.05)，不同字母差异显著 (p 0.05) 0。

28、077 4.ICSI 后兔胚胎的体外发育： 0078 卵子用兔新鲜卵母细胞，对照组用兔新鲜活精子，实验组为冷冻后的活精子进行 ICSI，在表 1 3 结果的基础上的进行实验，每组重复 3 次，统计其体外发育率。结果见表 4。 0079 从表 4 中可以看出，新鲜精子组和冻融活精子组卵裂率 (81.1和 68.8 ) 和囊胚率 (62.3和 40.4 ) 差异显著 (P 0.05)，而桑椹胚率 (66.2和 61.9) 差异不显著 (P 0.05)。可见冷冻后的兔精子仍具有非常好的受精能力。 0080 表 4 0081 0082 注：相同字母差异不显著 (p 0.05)，。

29、不同字母差异显著 (p 0.05) 0083 5. 冻融的兔卵母细胞的受精情况： 0084 精子用新鲜的兔精子，对照组为新鲜的兔卵母细胞，实验组为冷冻后活的卵母细胞进行 ICSI，在表 1 3 结果的基础上进行实验，每组重复 3 次，统计其体外发育率。结果见表 5。 0085 从表 5 中可以看出，冷冻后的兔卵母细胞卵裂能力很差，不能继续发育到囊胚。 0086 表 5 0087 说明书 CN 102450248 A 8 7/7 页 9 0088 注：相同字母差异不显著 (p 0.05)，不同字母差异显著 (p 0.05) 0089 从上述结果可以看出，冻融后的兔。

30、精子仍具有较高的受精能力和胚胎发育率。 0090 虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。说明书 CN 102450248 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2图 3 说明书附图 CN 102450248 A 10 2/3 页 11 图 4图 5 图 6图 7 图 8图 9 说明书附图 CN 102450248 A 11 3/3 页 12 图 10图 11 图 12 说明书附图 CN 102450248 A 12 。

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