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1、(10)申请公布号 CN 103276097 A (43)申请公布日 2013.09.04 CN 103276097 A *CN103276097A* (21)申请号 201310228445.0 (22)申请日 2013.06.07 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 浙江省水产技术推广总站 地址 310012 浙江省杭州市西湖区益乐路 20 号 (72)发明人 何中央 张海琪 张超 许晓军 王春琳 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 杜军 (54) 发明名称 中华鳖四个种群种质鉴定 PCR 检测法。
2、、 引物 组和试剂盒 (57) 摘要 本发明公开中华鳖四个种群种质鉴定 PCR 检 测法、 引物组和试剂盒。该引物组为 SEQNo.1/ SEQNo.4、 SEQNo.2/SEQNo.5 和 SEQNo.3/SEQNo.6。 该试剂盒包括 2TaqPCR 预混液、 5U/l 酶BglI 及 10 酶切缓冲液 A、 5U/l 酶HpaII 及 10 酶 切缓冲液 B、 5U/l 酶ClaI 及 10 酶切缓冲液 C、 10mg/mlBSA、 对照 DNA 模板、 10pM 扩增引物。该方 法用引物组对提取到的DNA进行PCR扩增， 然后酶 切得到酶切产物， 最后进行琼脂糖凝胶电泳， 将电 泳结果。
3、与标准电泳图谱比对得出结果。该检测方 法简单、 反应稳定性、 重复性好， 且节约成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103276097 A CN 103276097 A *CN103276097A* 1/2 页 2 1. 中华鳖四个种群的种质鉴定 PCR 检测方法， 其特性在于该方法包括以下步骤 ： 步骤 (1). 总 DNA 的提取 ： 按照常规方法提取待测样品的 DNA， 然后将提取到的 DNA。
4、 稀释至 50 150ng/l， 保存 于 -20 ； 步骤 (2).PCR 扩增 ： 以步骤 (1) 提取到的 DNA 为模板， 分别用 3 对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5 和 SEQ No.3/SEQ No.6 进行 PCR 扩增， 同时也对已知的中华鳖太湖种群、 台 湾种群、 黄河种群和中华鳖日本品系新品种对照 DNA 模板进行 PCR 扩增 ； 所述的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物、 1l 对应的下游引物、 1l 模板和余量的 ddH2O 组成 ； 所述的 2Taq。
5、 PCR 预混液为 0.1U/l Taq 酶、 500uM dNTP、 2PCR 缓冲液的混合液 ； 所述的PCR扩增反应条件为 ： 95预变性3min， 95变性30s， 5557退火30s， 72 延伸 1min， 反应进行 35 个循环， 最后 72延伸 10min ； 步骤 (3). 酶切反应 ： 对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增产物进行Bgl I 酶切， 所用的酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 A ； 对扩增引物 SEQ No.2/SEQ No.5 的扩增产物进行Hpa II 酶切， 所用的 酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 B ； 对扩增引物 SEQ No.3。
6、/SEQ No.6 的扩增产物进行Cla I 酶切， 所用的酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 C ； 所述的酶切反应体系为 25l 由 15l 步骤 (2) 某一扩增引物或对照 DNA 模板扩增得到 的扩增产物、 2.5l 10 酶切缓冲液、 0.25l BSA、 5U 限制性内切酶和余量的 ddH2O 组成 ； 所述的酶切反应条件为酶切反应体系在 37下孵育 4 小时以上 ； 所述10酶切缓冲液A为1M 、 500mM 、 100mM 、 10mM 的混合液， pH 值为 7.9 ； 所述 10 酶切缓冲液 B 为 100mM 、 100mM 、 10mM 的混合液， pH 值为 7.0 ； 。
7、所述 10 酶切缓冲液 C 为 500mM 、 200mM 、 100mM 、 10mM 的混合液 ； 步骤 (4). 标准电泳图谱的建立 ： 将对照 DNA 模板扩增得到的扩增产物的酶切产物进行 1.5 琼脂糖凝胶电泳检测， 构 建每种中华鳖的标准 PCR-RFLP 图谱 ； 步骤 (5). 待测样品的种质来源鉴定 ： 将待测样品的三种扩增引物扩增得到的扩增产物的酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳， 引 物对 SEQ No.1/SEQ No.4 的扩增产物经Bgl I 酶切后， 在黄河种群中出现长度为 1450bp 的 一条带， 而其他种群中出现618bp和832bp的两条带 ； 引物对SEQ No。
8、.2/SEQ No.5的扩增产 物经Hpa II 酶切后， 在黄河种群和台湾种群中出现长度为 715bp 的一条带， 在日本品系新 品种和太湖种群中出现330bp和385bp的两条带 ； SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物经Cla I 酶切后， 在日本品系新品种中出现长度为980的一条带， 在其他种群中出现长度为481bp和 499bp 的两条带 ； 将电泳结果与标准电泳图谱进行比对， 得出结果。 权 利 要 求 书 CN 103276097 A 2 2/2 页 3 2. 如权利要求 1 所述的中华鳖四个种群的种质鉴定 PCR 检测方法所用的引物组， 其特 征在于该引物组包括3对扩增。
9、引物SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/ SEQ No.6， 具体是 ： SEQ No.1 ： 5 -GAACCCCTATCACGAAAACG-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.2 ： 5 -TACAATATTACTCACAGACCGAAAC-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.3 ： 5 -ATAGGACAACCACGATTTCAGC-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.4 ： 5 -GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.5 ： 5 -TGGGTAGTCA。
10、GAATAGCGTCGT-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.6 ： 5 -TATTAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC-3 ， 浓度为 10pM。 3. 如权利要求 1 所述的中华鳖四个种群的种质鉴定 PCR 检测方法所用的试剂盒， 其特 征在于该试剂盒包括pH值为 8.3的2Taq PCR 预混液、 浓度为5U/l的限制性内切酶Bgl I 及对应的 10 酶切缓冲液 A、 浓度为 5U/l 的限制性内切酶Hpa II 及对应的 10 酶切 缓冲液 B、 浓度为 5U/l 的限制性内切酶Cla I 及对应的 10 酶切缓冲液 C、 浓度为 10mg/ ml 的牛血清白蛋白 BSA。
11、、 4 种已知来源中华鳖的对照 DNA 模板和浓度为 10pM 的 3 对扩增引 物 ； 所述的 2Taq PCR 预混液为 0.1U/l Taq 酶、 500uM dNTP、 2PCR 缓冲液的混合液 ； 所述 10 酶切缓冲液 A 为 1M 、 500mM 、 100mM 、 10mM 的 混合液， pH 值为 7.9 ； 所述 10 酶切缓冲液 B 为 100mM 、 100mM 、 10mM 的混合液， pH 值为 7.0 ； 所述 10 酶切缓冲液 C 为 500mM 、 200mM 、 100mM 、 10mM 的混合液。 权 利 要 求 书 CN 103276097 A 3 1/。
12、7 页 4 中华鳖四个种群种质鉴定 PCR 检测法、 引物组和试剂盒 技术领域 0001 本发明属水产种质检测领域， 涉及中华鳖四种群种质鉴定 PCR 检测法、 引物组和 试剂盒， 具体涉及一种中华鳖太湖种群、 台湾种群、 黄河种群和中华鳖日本品系新品种种质 鉴定的快速检测方法及其引物组及试剂盒。 背景技术 0002 中华鳖 （Pelodiscus sinensis） , 俗称团鱼、 甲鱼等， 隶属于爬行纲龟鳖目鳖科鳖 属， 广泛分布于我国各地， 现已发展成为我国重要的名特水产养殖品种。据统计， 2012 年全 国中华鳖养殖产量达 33 余万吨， 产值逾 200 亿元， 苗种放养量约 10 亿。
13、只， 其中一半以上的 苗种依赖境外输入。 目前我国中华鳖养殖的种类主要包括中华鳖太湖种群、 台湾种群、 黄河 种群和中华鳖日本品系等， 不同种群的中华鳖生长速度差异较大， 鳖苗市场价格也变化较 大。如 2012 年中华鳖太湖种群和黄河种群的鳖苗价格 23 元 / 只， 台湾种群的鳖苗售价 12 元 / 只， 中华鳖日本品系苗价 46 元 / 只。为满足养殖生产需要， 各地加大了中华鳖的 引种与扩繁， 伴随而来的是中华鳖种质的混杂， 严重影响中华鳖种质资源保护工作。同时， 因优质鳖苗市场价格高， 利润大， 市场上出现了一些不法商贩以劣质鳖苗冒充中华鳖日本 品系等优质鳖苗来谋取非法暴利的现象， 给。
14、养鳖者造成重大的经济损失。 因此， 准确鉴别中 华鳖的种质来源， 已成为我国中华鳖种质资源保护与育种研究的首要工作之一。 0003 根据现行中华鳖种质标准 GB21044-2007 要求， 主要采用外部形态、 内部构造、 生 化同工酶、 染色体核型等方法进行种质鉴定， 但该标准无法对不同种群的中华鳖进行区别 鉴定。常规检测中华鳖不同种群的鉴别方法有形态标记鉴别、 同工酶标记鉴别和 mtDNA 线 粒体序列鉴别法等， 但外部形态标记鉴别法受中华鳖养殖环境影响较大， 容易出现误判 ； 同 工酶标记具有组织特异性和个体差异， 并且受到个体发育阶段的影响， 因而无法达到较高 的准确度要求 ； RAPD。
15、 方法重复性差、 且对模板要求高， 因而鉴定结果的可靠性也受到限制 ； mtDNA 线粒体序列鉴别法尽管准确， 但需要借助大型测序仪来完成， 大多实验室往往因仪器 价格昂贵而没能采购， 从而只能将扩增好的样品外送测序后再进行种质鉴别， 时效性不能 保证。经国内外文献查询， 尚未见有稳定、 可靠、 简便的中华鳖四种不同种群种质鉴别的相 关报道。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供中华鳖四个种群的种质鉴定 PCR 检测引物， 它们是 3 对 扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5 和 SEQ No.3/SEQ No.6 ： SEQ No.1 。
16、： 5 -GAACCCCTATCACGAAAACG-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.2 ： 5 -TACAATATTACTCACAGACCGAAAC-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.3 ： 5 -ATAGGACAACCACGATTTCAGC-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.4 ： 5 -GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG-3 ， 浓度为 10pM ； SEQ No.5 ： 5 -TGGGTAGTCAGAATAGCGTCGT-3 ， 浓度为 10pM ； 说 明 书 CN 103276097 A 4 2/7 页 5 SEQ No.6 ： 5 -TAT。
17、TAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC-3 ， 浓度为 10pM。 0005 本发明的另一个目的是提供了中华鳖四个种群的种质鉴定 PCR 检测试剂盒。 0006 所述的试剂盒组成包括 pH 值为 8.3 的 2Taq PCR 预混液、 浓度为 5U/l 的限制 性内切酶Bgl I及对应的10酶切缓冲液A、 浓度为5U/l的限制性内切酶Hpa II及对应 的 10 酶切缓冲液 B、 浓度为 5U/l 的限制性内切酶Cla I 及对应的 10 酶切缓冲液 C、 浓度为 10mg/ml 的牛血清白蛋白 BSA、 4 种已知来源中华鳖的对照 DNA 模板和浓度为 10pM 的 3 对扩增引物。 0。
18、007 所述的2Taq PCR 预混液为0.1U/l Taq酶、 500uM dNTP、 2PCR缓冲液的混合 液 ； 所述 10 酶切缓冲液 A 为 1M 、 500mM 、 100mM 、 10mM 的混合液， pH 值为 7.9 ； 所述 10 酶切缓冲液 B 为 100mM 、 100mM 、 10mM 的混 合液， pH 值为 7.0 ； 所述 10 酶切缓冲液 C 为 500mM 、 200mM 、 100mM 、 10mM 的 混合液。 0008 本发明的又一个目的是提供了中华鳖四个种群的种质鉴定 PCR 检测方法。 0009 步骤 (1). 总 DNA 的提取 ： 按照常规方法。
19、提取待测样品的 DNA， 然后将提取到的 DNA 稀释至 50 150ng/l， 保存 于 -20 ； 该 DNA 提取方法可参考 Takara 总 DNA 提取试剂盒体取总 DNA。 0010 步骤 (2).PCR 扩增 ： 以步骤 (1) 提取到的 DNA 为模板， 分别用 3 对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5 和 SEQ No.3/SEQ No.6 进行 PCR 扩增， 同时也对已知的中华鳖太湖种群、 台 湾种群、 黄河种群和中华鳖日本品系新品种对照 DNA 模板进行 PCR 扩增。 0011 所述的 PCR 扩增反应体系为 50u。
20、l 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物、 1l 对应的下游引物、 1l 模板和余量的 ddH2O 组成。 0012 其中， 扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4 的上游引物为 SEQ No.1， 对应的下游引物 为 SEQ No.4 ； 扩增引物 SEQ No.2/ SEQ No.5 的上游引物为 SEQ No.2， 对应的下游引物为 SEQ No.5 ； 扩增引物 SEQ No.3/ SEQ No.6 的上游引物为 SEQ No.3， 对应的下游引物为 SEQ No.6。 0013 所述的2Taq PCR 预混液为0.1U/l Taq酶、 500uM dN。
21、TP、 2PCR缓冲液的混合 液。 0014 所述的PCR扩增反应条件为 ： 95预变性3min， 95变性30s， 5557退火30s， 72延伸 1min， 反应进行 35 个循环， 最后 72延伸 10min。 0015 步骤 (3). 酶切反应 ： 对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增产物进行Bgl I 酶切， 所用的酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 A ； 对扩增引物 SEQ No.2/SEQ No.5 的扩增产物进行Hpa II 酶切， 所用的 酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 B ； 对扩增引物 SEQ No.3/SEQ No.6 的扩增产物进行Cla I 酶切。
22、， 所用的酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 C。 说 明 书 CN 103276097 A 5 3/7 页 6 0016 所述的酶切反应体系为 25l 由 15l 步骤 (2) 某一扩增引物或对照 DNA 模板扩增 得到的扩增产物、 2.5l 10 酶切缓冲液、 0.25l BSA、 5U 限制性内切酶和余量的 ddH2O 组 成。 0017 所述的酶切反应条件为酶切反应体系在 37下孵育 4 小时以上。 0018 步骤 (4). 标准电泳图谱的建立 ： 将对照 DNA 模板扩增得到的扩增产物的酶切产物进行 1.5 琼脂糖凝胶电泳检测， 构 建每种中华鳖的标准 PCR-RFLP 图谱。 0019。
23、 步骤 (5). 待测样品的种质来源鉴定 ： 将待测样品的三种扩增引物扩增得到的扩增产物的酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳， 引 物对 SEQ No.1/SEQ No.4 的扩增产物经Bgl I 酶切后， 在黄河种群中出现长度为 1450bp 的 一条带， 而其他种群中出现618bp和832bp的两条带 ； 引物对SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产 物经Hpa II 酶切后， 在黄河种群和台湾种群中出现长度为 715bp 的一条带， 在日本品系新 品种和太湖种群中出现330bp和385bp的两条带 ； SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物经Cla I 酶切后， 在日本品系新品种中出现。
24、长度为980的一条带， 在其他种群中出现长度为481bp和 499bp 的两条带。将电泳结果与标准电泳图谱进行比对， 得出结果。 0020 所述的对照DNA模板为已知的太湖种群、 台湾种群、 黄河种群和日本品系这4种已 知的中华鳖 DNA。 0021 与现有中华鳖的种质鉴定方法相比， 本发明具有以下优点 ： （1） 本发明是基于 PCR-RFLP 基础上对中华鳖的种质进行鉴定， 对 PCR 反应的模板要求 不高， 反应稳定性和重复性好 ； （2） 本发明操作步骤主要包括 PCR 扩增、 酶切和电泳检测， 操作简便， 结果直观、 准确、 灵敏、 可靠 ； （3） 本发明对中华鳖进行种质鉴定只需将。
25、酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 并与标 准种质图谱进行对比， 无需测序， 大大节省了检测时间和检测成本。 附图说明 0022 图 1 为已知种质来源的四种中华鳖种群的标准 PCR-RFLP 图谱， 其中泳道 1 3 为 太湖种群， 泳道 4 6 为台湾种群， 泳道 7 9 为日本品系新品种， 泳道 10 12 为黄河种 群， 泳道1315为未经酶切处理的三种扩增产物谱带， 其中每个群体的三条泳道自左至右 依次为SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物的酶 切电泳结果 ； 图 2 为 SEQ No.1 / SEQ。
26、 No.4 的扩增产物经Bgl I 酶切后的电泳结果， 其中 M ： DNA Maker ； 泳道 1 5 ： 太湖种群的 5 个个体 ； 泳道 6 10 ： 台湾种群的 5 个个体 ； 泳道 11 15 ： 日本品系新品种的 5 个个体 ； 泳道 16 20 ： 黄河种群的 5 个个体 ； 图3为SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物经Cla I酶切后的电泳结果， 其中M ： DNA Maker ； 泳道 1 5 ： 太湖种群的 5 个个体 ； 泳道 6 10 ： 台湾种群的 5 个个体 ； 泳道 11 15 ： 日本 品系新品种的 5 个个体 ； 泳道 16 20 ： 黄河种群的 5。
27、 个个体 ； 图 4 为 SEQ No.2/SEQ No.5 的扩增产物经Hpa II 酶切后的电泳结果， 其中 M ： DNA Maker ； 泳道 1 5 ： 太湖种群的 5 个个体 ； 泳道 6 10 ： 台湾种群的 5 个个体 ； 泳道 11 说 明 书 CN 103276097 A 6 4/7 页 7 15 ： 日本品系新品种的 5 个个体 ； 泳道 16 20 ： 黄河种群的 5 个个体。 具体实施方式 0023 下面结合附图对本发明做进一步的分析。 0024 若无特殊说明， 下面实施例所用的 PCR 相关试剂均来自天根 （TianGen） 公司 ； 所用 限制性内切酶相关试剂均来。
28、自 New England Biolab （NEB） ； 琼脂糖、 SYBR Green 核酸染料 均来自上海生工。 0025 如图1所示， 泳道13为太湖种群， 泳道46为台湾种群， 泳道79为日本品 系新品种， 泳道1012为黄河种群， 泳道1315为未经酶切处理的三种扩增产物谱带， 其 中每个群体的三条泳道自左至右依次为 SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5 和 SEQ No.3/SEQ No.6 的扩增产物的酶切电泳结果， 正确的标准图谱应与图 1 中的条带大小一致。 0026 实施例 1 ： 四种不同种群中华鳖标准 PCR-RFLP 图谱的构建。
29、 ： （1） 总 DNA 的提取 ： 取待测样中华鳖组织样品， 参考天根总 DNA 提取试剂盒体取总 DNA （也可用其他试剂盒提取） ， 将提取的 DNA 稀释至 50 150ng/ul， 保存于 -20 ； （2） PCR扩增 ： 以提取的总DNA为模板， 分别用3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5 和 SEQ No.3/SEQ No.6 进行 PCR 扩增， 同时也对对照模板 DNA 进行 PCR 扩 增， 所用的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物、 1l 对应的下游引物、 1。
30、l 模板和余量的 ddH2O 组成。 0027 所用的PCR扩增反应条件为 ： 95预变性3min， 95变性30s， 5557退火30s， 72延伸 1min， 反应进行 35 个循环， 最后 72延伸 10min ； （3） 酶切反应 ： 对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增产物进行Bgl I 酶切， 所用的 酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 A， 对扩增引物 SEQ No.2/SEQ No.5 的扩增产物进行Hpa II 酶切， 所用的酶切缓冲液为10酶切缓冲液B， 对扩增引物SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物 进行Cla I 酶切， 所用的酶切缓冲液为 1。
31、0 酶切缓冲液 C ； 所用的酶切反应体系为 25l 由 15l 步骤 (2) 对照 DNA 模板扩增得到的扩增产物、 2.5l 10 酶切缓冲液、 0.25l BSA、 5U 限制性内切酶和余量的 ddH2O 组成。酶切反应体 系在 37孵育 4 小时以上 ； （4） 标准电泳图谱的建立 ： 将对照 DNA 模板的 PCR 扩增产物的酶切产物进行 1.5 琼 脂糖凝胶电泳检测， 泳道排列顺序如图 1 所示， 其中泳道 1 3 为太湖品系， 泳道 4 6 为 台湾品系， 泳道 7 9 为日本品系， 泳道 10 12 为黄河品系， 泳道 13 15 为三种扩增产 物未经酶切处理的条带， 其中每个。
32、群体的三条泳道自左至右依次为 SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物的酶切电泳结果， 正确的标准图谱应 与图 1 中的条带大小一致。 0028 实施例 2 ： 中华鳖黄河种群的种质鉴定 ： （1） 总 DNA 的提取 ： 取待测中华鳖组织， 按照实施实例 1 中的方法提取总 DNA ； PCR 扩增 ： 以提取的总 DNA 为模板， 用引物对 SEQ No.1 / SEQ No.4 进行 PCR 扩增 ； 所用的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物 SE。
33、Q No.1、 1l 对应的下游引物 SEQ No.4、 1l 模板和余量的 ddH2O 组成， PCR 扩增反应条件与实 说 明 书 CN 103276097 A 7 5/7 页 8 施实例 1 中相同 ； （2） 酶切反应 ： 用限制性内切酶BglI 对步骤 （2） 得到扩增产物进行酶切 ； 所用的酶切反应体系为 25l 由 15l 步骤 (2) 得到扩增产物、 2.5l 10 酶切缓冲液 A、 0.25l BSA、 5U 限制性内切酶BglI 和余量的 ddH2O 组成。酶切反应体系在 37孵育 4 小 时以上 ； （3） 待测样品的种质来源鉴定 ： 如图 2 所示， M ： DNA M。
34、aker ； 泳道 1 5 ： 太湖种群 ； 泳道 6 10 ： 台湾种群 ； 泳道 11 15 ： 日本品系新品种 ； 泳道 16 20 ： 黄河种群。将步骤 （3） 得到的酶切产物进行 1.5 琼脂糖凝胶电泳检测， 若电泳条带为 1400bp 左右的一条带， 则 为黄河种群， 若出现 600bp 和 800bp 左右的两条带， 则不是黄河种群 ； （4） 反应的稳定性与重复性 ： 如图 2 所示， 每个群体的 5 个个体均表现出一致的结果， 说明此反应重复性和稳定性良好。 0029 实施例 3 ： 日本品系新品种的种质鉴定 ： （1） 总 DNA 的提取 ： 总 DNA 的提取方法与实施实。
35、例 1 中相同 ； （2） PCR 扩增 ： 以提取的总 DNA 为模板， 用引物对 SEQ No.3 / SEQ No.6 进行 PCR 扩增 ； 所用的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物 SEQ No.3、 1l 对应的下游引物 SEQ No.6、 1l 模板和余量的 ddH2O 组成， PCR 扩增反应条件与实 施实例 1 中相同 ； （3） 酶切反应 ： 用限制性内切酶ClaI 对步骤 （2） 得到扩增产物进行酶切， 所用的酶切反应体系为 25l 由 15l 步骤 (2) 得到扩增产物、 2.5l 10 酶切缓冲液 C、 0.。
36、25l BSA、 5U 限制性内切酶ClaI 和余量的 ddH2O 组成。酶切反应体系在 37孵育 4 小 时以上 ； （4） 待测样品的种质来源鉴定 ： 如图 3 所示， M ： DNA Maker ； 泳道 1 5 ： 太湖种群 ； 泳道 6 10 ： 台湾种群 ； 泳道 11 15 ： 日本品系新品种 ； 泳道 16 20 ： 黄河种群。将步骤 （3） 得到的酶切产物进行 1.5 琼脂糖凝胶电泳检测， 若电泳条带为 1000bp 左右的一条带， 则 为日本品系新品种， 若出现 500bp 左右的一条带， 则不是日本品系新品种。 0030 （5） 反应的稳定性重复性 ： 如图3所示， 每个。
37、群体的5个个体均表现出一致的结果， 说明此反应重复性和稳定性良好。 0031 实施例 4 ： 台湾种群的种质鉴定 ： （1） 总 DNA 的提取 ： 总 DNA 的提取方法与实施实例 1 中相同 ； （2） PCR 扩增 ： 以提取的总 DNA 为模板， 分别对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4 和 SEQ No.2 / SEQ No.5 进行 PCR 扩增， 对 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增 ： 所用的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物 SEQ No.1、 1l 对应的下游引物 SEQ No.4、 1。
38、l 模板和余量的 ddH2O 组成， PCR 扩增反应条件与实施实例 1 中相同 ； 对 SEQ No.2 / SEQ No.5 的扩增 ： 所用的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游引物 SEQ No.2、 1l 对应的下游引物 SEQ No.5、 1l 模板和余量的 ddH2O 组成， PCR 扩增反应条件与实施实例 1 中相同 ； （3） 酶切反应 ： 用限制性内切酶 Bgl I 对 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增产物进行酶切， 酶切反应体系和条件与实施例 2 中的步骤 （3） 相同。用限制性内切酶Hpa II 对 S。
39、EQ No.2 说 明 书 CN 103276097 A 8 6/7 页 9 / SEQ No.5 的扩增产物进行酶切， 所用的酶切反应体系为 25l 由 15l SEQ No.2 / SEQ No.5 扩增产物、 2.5l 10 酶切缓冲液 B、 0.25l BSA、 5U 限制性内切酶Hpa II 和余量的 ddH2O 组成。酶切反应体系在 37孵育 4 小时以上 ； （4） 待测样品的种质来源鉴定 ： 将步骤 （3） 得到的酶切产物进行 1.5 琼脂糖凝胶电 泳检测， 若 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增产物经Bgl I 酶切后出现 600bp 和 800bp 左右的 两条。
40、带 （如图 2 所示） ， 且 SEQ No.2 / SEQ No.5 的扩增产物经Hpa II 酶切后仍为 700bp 左 右的一条带 （如图 4 所示， M ： DNA Maker ； 泳道 1 5 ： 太湖种群 ； 泳道 6-10 ： 台湾种群 ； 泳道 11-15 ： 日本品系新品种 ； 泳道 16 20 ： 黄河种群） ， 则为台湾种群， 否则为其他种群。 0032 （5） 反应的稳定性重复性 ： 如图 2、 图 4 所示， 每个群体的 5 个个体均表现出一致的 结果， 说明此反应重复性和稳定性良好。 0033 实施例 5 ： 任意一种中华鳖种群的种质鉴定 ： （1） 总 DNA 的。
41、提取 ： 取待测中华鳖组织， 按照实施例 1 中的方法提取总 DNA ； （2） PCR扩增 ： 以提取的总DNA为模板， 分别用3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5 和 SEQ No.3/SEQ No.6 进行 PCR 扩增， 同时也对对照 DNA 模板进行 PCR 扩 增 ； 所用的 PCR 扩增反应体系为 50ul 由 25l 的 2Taq PCR 预混液、 1l 上游、 1l 对应 的下游引物、 1l 模板和余量的 ddH2O 组成。 0034 所用的PCR扩增反应条件为 ： 95预变性3min， 95变性30s， 5557退火30s。
42、， 72延伸 1min， 反应进行 35 个循环， 最后 72延伸 10min ； （3） 酶切反应 ： 对扩增引物 SEQ No.1 / SEQ No.4 的扩增产物进行Bgl I 酶切 （对应的 酶切缓冲液为10酶切缓冲液A） ， 对扩增引物SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物进行Hpa II 酶切 （对应的酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 B） ， 对扩增引物 SEQ No.3/SEQ No.6 的扩增产 物进行Cla I 酶切 （对应的酶切缓冲液为 10 酶切缓冲液 C ； 所用的酶切反应体系为 25l 由 15l 步骤 (2) 某一扩增引物扩增得到的扩增产物、 2.5l 10 。
43、酶切缓冲液、 0.25l BSA、 5U 限制性内切酶和余量的 ddH2O 组成。酶切反应体 系在 37孵育 4 小时以上 ； （4） 种质来源的鉴定 ： 将三种酶切产物分别进行 1.5 琼脂糖凝胶电泳， 将电泳结果与 实施例 1 中标准 PCR-RFLP 图谱 （图 1） 中比对， 若吻合则可认定为同一种质来源。 0035 上述实施例所用的对照 DNA 模板为已知的太湖种群、 台湾种群、 黄河种群和日本 品系这 4 种已知的中华鳖 DNA。 0036 上述实施例所用的2Taq PCR 预混液为0.1U/l Taq酶、 500uM dNTP、 2PCR缓 冲液的混合液 ； 10 酶切缓冲液 A。
44、 为 1M 、 500mM 、 100mM 、 10mM 的混合液， pH 值为 7.9 ； 10 酶切缓冲液 B 为 100mM 、 100mM 、 10mM 的混合液， pH 值为 7.0 ； 10 酶切缓冲液 C 为 500mM 、 200mM 、 100mM 、 10mM 的混合液。 0037 上述实施例所提及的3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、 SEQ No.2/SEQ No.5和 SEQ No.3/SEQ No.6 即为 6 条引物， 具体如表 1 ： 表 1 6 条引物序列 说 明 书 CN 103276097 A 9 7/7 页 10 引物名称 引物序列 （5。
45、 -3 ）浓度 SEQNo.1 GAACCCCTATCACGAAAACG10pM SEQNo.2 TACAATATTACTCACAGACCGAAAC10pM SEQNo.3 ATAGGACAACCACGATTTCAGC10pM SEQNo.4 GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG10pM SEQNo.5 TGGGTAGTCAGAATAGCGTCGT10pM SEQNo.6 TATTAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC10pM 上述实施例并非是对于本发明的限制， 本发明并非仅限于上述实施例， 只要符合本发 明要求， 均属于本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103276097 A 。
46、10 1/2 页 11 SEQUENCE LISTING 浙江省水产技术推广总站 中华鳖四个种群种质鉴定 PCR 检测法、 引物组和试剂盒 1 6 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工合成 1 gaacccctat cacgaaaacg 20 2 25 DNA 人工合成 2 tacaatatta ctcacagacc gaaac 25 3 22 DNA 人工合成 3 ataggacaac cacgatttca gc 22 序 列 表 CN 103276097 A 11 2/2 页 12 4 22 DNA 人工合成 4 gctattttta cggcggtttt tg 22 5 22 DNA 人工合成 5 tgggtagtca gaatagcgtc gt 22 6 24 DNA 人工合成 6 tattagtgta gcttctggtc cctc 24 序 列 表 CN 103276097 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103276097 A 13 2/2 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 103276097 A 14 。