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1、(10)申请公布号 CN 103146766 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146766 A *CN103146766A* (21)申请号 201310069917.2 (22)申请日 2013.03.06 C12P 7/18(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/29(2006.01) (71)申请人 徐州凯米克新材料有限公司 地址 221008 江苏省徐州市泉山区解放南路 中国矿业大学国家大学科技园内科技 创新园 (72)发明人 蔡佩君 赵云 拾冲 谭静。
2、萍 李荣 李成军 赵明光 (54) 发明名称 甘油发酵法制备 1,3- 丙二醇 (57) 摘要 一种生物法发酵法制备1,3-丙二醇(PDO)的 生产工艺， 属于生物化工技术领域。 本发明将伊纽 小单孢菌中sisI的3,4-双脱羟基酶基因通 过基因重组和 DNA 重排等技术得到 2 - 脱羟基 酶基因 (sisII)。通过克隆得到 sisII， 随后将其 构建到 pET30a 表达载体， 并在 E.coli BL21 实现 异源表达， 构建甘油脱水合成 1,3- 丙二醇的工程 菌 BL21-sis， 同时采用超分子自组装模板法固定 化， 然后在含有甘油的培养基中发酵合成 1,3- 丙 二醇， 通。
3、过过滤发酵液、 有机溶剂萃取等获得产品 1,3- 丙二醇。该制备 1,3- 丙二醇的方法， 具有生 产周期短， 所需设备简单， 环境友好， 操作简单易 控， 原料廉价等优点， 易于实现工业化生产， 具有 重大的实用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103146766 A CN 103146766 A *CN103146766A* 1/1 页 2 1. 本发明涉及 1， 3- 丙二醇的合成， 是将伊纽小单孢菌中 sisI 的 3， 4 - 双脱羟基 。
4、酶基因通过基因重组和 DNA 重排等技术得到 2 - 脱羟基酶基因 (sisII)。通过克隆得到 sisII， 随后将其构建到 pET30a 表达载体， 并在 E.coli BL21 实现异源表达， 构建甘油脱水 合成 1， 3- 丙二醇 (PDO) 的工程菌 BL21-sis， 同时采用超分子自组装模板法固定化， 然后在 含有甘油的培养基中发酵合成 1， 3- 丙二醇， 通过过滤发酵液、 有机溶剂萃取等获得产品 1， 3- 丙二醇。 2.按照权利要求1所述， 其特征在于甘油脱脱羟基合成1， 3-丙二醇的工业工程菌的构 建是由伊纽小单孢菌中sisI突变得到sisII， 使用基因重组和DNA重排。
5、技术， 将脱氢酶基因 整合进大肠杆菌 BL21。 3.按照权利要求1所述， 其特征在于采用超分子自组装模板对甘油脱氢合成1， 3-丙二 醇的工业工程菌固定化， 并在酸性水溶液中结构稳定。 4. 按照权利要求 1 所述， 其特征在于将经固定化的甘油脱氢合成 1， 3- 丙二醇的工 业工程菌， 在含有甘油的培养基中发酵合成 1， 3- 丙二醇， 发酵的工艺技术条件为温度为 25-37、 200r/min 振荡培养时间 21-26h。 5. 按照权利要求 1 所述， 其特征在于发酵液先经过滤分离催化酶重复使用， 利用乙酸 丁酯萃取获得产品 1， 3- 丙二醇。 权 利 要 求 书 CN 103146。
6、766 A 2 1/4 页 3 甘油发酵法制备 1， 3- 丙二醇 技术领域 0001 本发明属于生物化工技术领域， 一种甘油发酵法制备 1， 3- 丙二醇的方法。 背景技术 0002 1， 3- 丙二醇是有广阔应用前景的化工原料， 主要用做聚醋和聚氨酯的单体以及溶 剂、 抗冻剂或保护剂等。 此外， 1， 3-丙二醇还可用作增塑剂、 洗涤剂、 防腐剂、 乳化剂的合成， 也可作为产品中的组分如化妆品、 打印机墨水、 清洁剂、 稳定剂和燃料电池燃料等的添加剂 来提高产品的性能。 作为医药和有机合成的中间体， 1， 3-丙二醇可用于食品、 化妆品和制药 等行业。1， 3- 丙二醇作为中间体还生产多醇。
7、聚酯及作为碳链延伸剂， 还可用于制备其它不 饱和聚酯， 如聚萘二甲酸丙二醇酯 (PTN) 和共聚聚酯以及制备新型聚氨酯树脂等。 0003 1， 3- 丙二醇的生产方法有化学法和生物法， 中国专利 CN101134713A， CN1431183A 等均是采用化学法， 但是化学合成法副产物多， 产品提纯分离困难， 生产成本高。 相比之下， 生物转化法生产 1， 3- 丙二醇以其利用再生资源、 对环境污染小等特点越来越受到重视。 0004 目前生物合成法生产 1， 3- 丙二醇存在产物浓度低， 生产周期长和甘油转化率低 等问题， 因此， 采用廉价易得的原料， 在温和条件下制备1， 3-丙二醇， 对于。
8、提升1， 3-丙二醇 和下游产物的制备以及扩大应用都有特别重要的意义。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种合成由甘油发酵合成 1， 3- 丙二醇的方法， 实现 1， 3- 丙二醇的条件温和、 成本低廉制备。 0006 本发明是这样实现的 ： 将伊纽小单孢菌中 sisI 的 3 ， 4 - 双脱羟基酶基因通过基 因重组和 DNA 重排等技术得到 2 - 脱羟基酶基因 (sisII)。通过克隆得到 sisII， 随后将 其构建到 pET30a 表达载体， 并在 E.coli BL21 实现异源表达， 构建甘油脱水合成 1， 3- 丙二 醇 (PDO) 的工程菌 BL21-sis， 同时采。
9、用超分子自组装模板法固定化， 然后在含有甘油的培 养基中发酵合成 1， 3- 丙二醇， 通过过滤发酵液、 有机溶剂萃取等获得产品 1， 3- 丙二醇。具 体技术方案如下 ： 0007 1) 将伊纽小单孢菌中 sisI 的 3 ， 4 - 双脱羟基酶基因通过基因重组和 DNA 重排 等技术得到 2 - 脱羟基酶基因 (sisII)， 通过 PCR 方法加上生物砖标准化酶切位点 EcoRI， hindIII 并与生物砖骨架 Pet30a 连接， 进行同义突变， 完成生物砖元件 Pet-sis 的构建 ； 0008 2) 将构建好的 Pet-sis， 转化到大肠杆菌 BL21 中， 甘油保种 ； 0。
10、009 3) 进行发酵培养前先在种子培养基中培养， 用无菌注射器将种子液第 1 次接种于 装有种子培养基的血清瓶中再培养， 将扩培的种子液第 2 次接种于装有发酵培养基的发酵 罐中发酵后， 得产物 1， 3- 丙二醇。 0010 在步骤 1) 中， PCR 仪、 凝胶成像仪和蛋白电泳仪购自美国 BIO-RAD 公司。 0011 在步骤 2) 中， 所述的伊纽小单孢菌购自买 Takara 公司， 所述大肠杆菌 BL21 购买 Takara 公司。 说 明 书 CN 103146766 A 3 2/4 页 4 0012 在步骤 3) 中， 所述种子培养基可采用 LB 培养基 ； 所述培养的条件可为。
11、 37、 150r/min摇床培养 ； 所述第1次接种的接种量可为5； 所述再培养的条件可为37、 150r/ min摇床培养 ； 所述第2次接种的接种量可为10； 所述发酵的过程中可向发酵罐中通氮气 来维持体系的厌氧条件， 并控制 pH 为 6.8 ； 所述发酵的过程中可加入补料混合溶液， 所述补 料混合溶液由甘油组成 ； 所述分析发酵液中甘油和 1， 3- 丙二醇浓度的方法可采用美国安 捷伦高效液相色谱 Agilent1100 分析发酵液中甘油和 1， 3- 丙二醇浓度。 0013 在步骤 3) 中， 在发酵过程中， 可每间隔 1 3h 取样， 测定发酵液的菌体 OD 值， 分 析发酵液中。
12、甘油和 1， 3- 丙二醇的浓度。 0014 本发明的优点在于将伊纽小单孢菌中sisI的3 ， 4 -双脱羟基酶基因通过基因重 组和 DNA 重排等技术得到 2 - 脱羟基酶基因 (sisII)。通过克隆得到 sisII， 将其构建到 pET30a 表达载体， 并在 E.coli BL21 实现异源表达， 构建甘油脱水合成 1， 3- 丙二醇的工程 菌 BL21-sis， 同时采用超分子自组装模板法固定化， 然后在含有甘油的培养基中发酵合成 1， 3- 丙二醇。这种方法的益处在于大大突破了甘油生物法生产 1， 3- 丙二醇甘油转化率低 的瓶颈， 提高了底物转化率， 缩短了发酵时间， 从而降低了。
13、生产成本， 为微生物利用甘油发 酵法生产 1， 3- 丙二醇的工业化奠定了基础。 具体实施方式 0015 通过以下实施例进一步详细说明本发明， 但应注意本发明的范围并不受这些实施 例的限制。 0016 实施例 1 0017 1) 生物砖元件 Pet-sis 的构建 0018 提取伊纽小单孢菌基因组， 根据 NCBI 公布的依纽小单孢菌生物合成基因簇 (FJ160413) 基因序列设计合成 PCR 所需的引物。 0019 上游引物 sisI1 为 ： CCC AAGCTT TCACACCGAGATCTGC(HindIII) ； 0020 下游引物 sisI2 为 ： CCG GAATTC ATG。
14、GAACCAGGACTTG(EcoR I)。 0021 向 200L eppedoff 管中， 加入 200pmol 的 dNTPs， 上下游引物各 20mol， 模板 DNA 约 1ng， 5UFast Pfu DNA 聚合酶， 10L5Fast Pfu 酶 Buffer， 然后加无菌蒸馏水至总 体积 50L。利用 Biometra TProfessional PCR 仪反应参数是 94预变性 5min 后， 94 变性 45s， 66.8退火 45s， 72延伸 90s， 30 个循环， 然后 72延伸 5min， 得到 PCR 产物。 0022 提取质粒 Pet30a， 经 HindII。
15、I/EcoR I 双酶切， 连接前端载体片段和目的基因插入 片段， 得到质粒 Pet-sis 转化到 DH5 中， 涂布在含有氨苄青霉素的 LB 培养基平板上， 37 培养 24h， 挑单菌落， 37 LB 液体培养基 200r/min 震荡培养 14h。 0023 2) 工程菌的构建。 0024 提取质粒 Pet-sis， 转化到 BL21 中， 涂布在含有氨苄青霉素的 LB 培养基平板上， 37培养 24， 挑单菌落， 37 LB 液体培养基 200r/min 震荡培养 14h 得到工程菌 BL21-sis。 0025 3) 发酵培养 0026 (1) 发酵方式 ： 10L 机械搅拌发酵罐。
16、， 通氮气分批发酵 0027 (2) 培养基 ： 0028 种子培养基 (g/L) ： 可溶性淀粉 8， 葡萄糖 2， 酵母粉 8， 硫酸镁 0.2 . 碳酸 说 明 书 CN 103146766 A 4 3/4 页 5 钙 0.2， 氯化钴 2gL-1， 甘氨酸 0.2， (NH4)2SO45g， 调 pH7.0， 0.1Mpa 灭菌 20min。 0029 发酵培养基 (g/L) ： 发酵培养基为添加 15.0甘油的 LB 培养基 ； 再添加微量元素 10mL/L。 0030 微量元素溶液 (/L) ： ZnCl2， 0.06g ； MnCl24H2O， 0.2g ； H3BO3， 0.0。
17、8g ； CoCl26H2O， 0.1g ； CuCl22H2O， 0.01g ； NiCl26H2O， 0.020g ； Na2MoO42H2O， 0.040g。 0031 (3) 发酵过程 ： 0032 发酵培养 ： 将扩培的种子液以 9的接种量接种于装有 2L 发酵培养基的 5L 发酵 罐中， 搅拌转速 140rpm， 在发酵过程中向发酵罐中通氮气来维持发酵体系的厌氧条件。 0033 pH 控制 ： 用浓度为 2mol/LNaOH 溶液自动调节为 6.8。 0034 补料控制 ： 根据分批发酵中甘油消耗与碱液消耗的比例关系， 以甘油 ( 折合 后 ) NaOH 74 9 的比例 ( 质量。
18、比 ) 配制混合溶液， 补料时用该混合溶液代替单纯的 NaOH 溶液， 在调节 pH 的同时进行甘油流加， 补料结束后换回单纯的 NaOH 溶液， 继续消耗完 发酵液中残余的甘油。 0035 取样分析 ： 每间隔2h取样， 测定发酵液的菌体OD值， 分析发酵液中甘油和1， 3-丙 二醇浓度。 0036 4) 发酵结果 ： 0037 从 6h 补料开始， 发酵液中的甘油浓度一直维持在 17g/L 左右， 1， 3- 丙二醇的浓 度快速增加， 11h 左右菌体生长进入稳定期， 15h 时发酵结束， 继续补料， 发酵液中仍然含有 17.1g/L 的残余甘油。发酵结束时 1， 3- 丙二醇浓度为 33。
19、.7g/L， 转化率为 0.56g/g， 生产强 度为 2.25g/L。 0038 5) 发酵产物的分离 ： 0039 发酵收获后， 离心分离和回收催化酶， 发酵母液使用乙酸丁酯萃取， 将萃取所得的 有机浓缩后， 得到 1， 3- 丙二醇 36.33g( 收率 80.7 )。 0040 实施例 2 0041 各培养基的组成和培养条件同上。 0042 1) 发酵过程 ： 0043 发酵培养 ： 将扩培的种子液以 9的接种量接种于装有 2L 发酵培养基的 5L 发酵 罐中， 搅拌转速 140rpm， 在发酵过程中向发酵罐中通氮气来维持发酵体系的厌氧条件。 0044 pH 控制 ： 用浓度为 2mo。
20、l/LNaOH 溶液自动调节为 6.4。 0045 补料控制 ： 根据分批发酵中甘油消耗与碱液消耗的比例关系， 以甘油 ( 折合 后 ) NaOH 8 1 的比例 ( 质量比 ) 配制混合溶液， 补料时用该混合溶液代替单纯的 NaOH 溶液， 在调节 pH 的同时进行甘油流加， 补料结束后换回单纯的 NaOH 溶液， 继续消耗完 发酵液中残余的甘油。 0046 取样分析 ： 每间隔2h取样， 测定发酵液的菌体OD值， 分析发酵液中甘油和1， 3-丙 二醇浓度。 0047 2) 发酵结果 ： 0048 从 8h 补料开始， 发酵液中的甘油浓度一直维持在 19g/L 左右， 1， 3- 丙二醇的浓 度快速增加， 13h 左右菌体生长进入稳定期， 18h 时发酵结束， 继续补料， 发酵液中仍然含有 19.1g/L 的残余甘油。发酵结束时 1， 3- 丙二醇浓度为 35.7g/L， 转化率为 0.58g/g， 生产强 说 明 书 CN 103146766 A 5 4/4 页 6 度为 2.35g/g/L。 0049 3) 发酵产物的分离 ： 0050 发酵收获后， 离心分离和回收催化酶， 发酵母液使用乙酸丁酯萃取， 将萃取所得的 有机浓缩后， 得到 1， 3- 丙二醇 36.33g( 收率 84.7 )。 说 明 书 CN 103146766 A 6 。