特异性识别BRAF突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用.pdf

本发明公开了特异性识别B-Raf突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用，属于生物科学和药物载体领域。利用本发明的方法制备出的三种单克隆抗体分别可以特异性识别三种B-Raf N581S，B-Raf V600E和B-RafV600K突变蛋白。这三种单克隆抗体可以用于检测动物或者人体组织中的B-Raf蛋白是否含有N581S、V600E和V800K突变，能为临床上皮肤癌等多种癌症的诊断和治疗提供依据。

权利要求书
1.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体,其特征在于，不能识别B‑Raf野生型蛋白的单克隆抗体，或者抗原结合蛋白，该单克隆抗体特异性识别的B‑Raf突变蛋白包括：第581位的天冬酰胺（Asparagine，N）突变为丝氨酸（Serine，S）的突变蛋白（B‑Raf N581S）；第600位的缬氨酸（Valine，V）突变为谷氨酸（Glutamic Acid，E）的突变蛋白（B‑Raf V600E）；或者第600位的缬氨酸（Valine，V）突变为赖氨酸（Lysine，K）的突变蛋白（B‑Raf V600K）。

2.   根据权利要求1所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列SEQ ID NO:3的B‑Raf蛋白。

3.   根据权利要求1所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列SEQ ID NO:1的B‑Raf蛋白。

4.   根据权利要求1所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，特异性结合于含有多肽序列SEQ ID NO:2的B‑Raf蛋白。

5.   根据权利要求1所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括抗原结合部位，由一条重链和一条轻链组成；重链和轻链的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列分别是由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏号为CCTCC C2012112、CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC/C201285以及CCTCC C2012122的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列决定。

6.   根据权利要求5所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括抗原结合部位，所述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体重链和轻链的组成分别包含重链和轻链的可变区域。

7.   根据权利要求5所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括抗原结合部位，包含有所述的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列。

8.   根据权利要求1所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，包括抗原结合部位，是一种人源化或者嵌合型抗体。

9.   根据权利要求2至6及8任一项所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体是一种IgG。

10.   根据权利要求1所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）的保藏号为CCTCCC2012112、CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285以及CCTCCC2012122的三株杂交瘤细胞。

11.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，该单克隆抗体或者抗原结合部位的药物，以及可以药用的载体。

12.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种诊断B‑Raf突变的诊断试剂盒，其组成含有权利要求1至7所述的任意一种单克隆抗体或者抗原结合部位。

13.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种诊断肿瘤的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用权利要求1至7所述的任意一种单克隆抗体或者抗原结合部位接触需要检测的生物样本；
（2）检测单克隆抗体或者抗原结合部位是否与样本发生结合，而结合指示样本存在癌症或者发展成癌症的风险。

14.   根据权利要求13所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述诊断方法中，常见的癌症类型包括：直肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。

15.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种治疗癌症病人的方法，其特征在于：
（1）检测来自于病人的生物学样品中是否含有B‑Raf N581S，V600E或者V600K突变，并且
（2）如果存在上述突变，对该病人给予B‑Raf蛋白抑制剂的治疗。

16.   根据权利要求15所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述治疗方法中，B‑Raf蛋白抑制剂包括：反义RNA（antisense RNA），小干涉RNA（siRNA），微小RNA（miRNA）药物，抗B‑Raf单克隆抗体药物，帕尼单抗（panitumumab），威罗菲尼（vemurafenib），索拉非尼（Sorafenib），西妥昔单抗（Cetuximab），Raf‑265，PLX‑4032，GDC‑0879。

17.   根据权利要求15所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述治疗癌症病人的方法，给予病人含有权利要求11的组成成分的药物。

18.   根据权利要求15或17所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述治疗癌症病人的方法中，常见的癌症类型包括：直肠癌，乳头状甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。

19.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1至8的单克隆抗体或者抗原结合部位用于癌症治疗药物的生产过程，常见的癌症种类包括：黑色素癌，直肠癌，甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血组织癌。

20.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种纯化的核酸分子，包含能够编码权利要求1至8所述单克隆抗体的重链或者其一个抗原结合部位，或者能够编码轻链或者其一个抗原结合部位，或者能够同时编码二者的核酸序列。

21.   根据权利要求20所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种载体分子，含有可以联系到该核酸分子的表达调控序列。

22.   根据权利要求20的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种宿主细胞，含有该核酸分子。

23.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，包含权利要求1至7的一种细胞株，其含有所述的单克隆抗体或者其抗原结合部位。

24.   特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，一种生产单克隆抗体或者其抗原结合部位的方法，所生产的抗体或者抗原结合部位特异性结合人类突变的B‑Raf蛋白，而不结合人类野生型的B‑Raf蛋白。其步骤包括：
（1）根据权利要求22，在适当的条件下培养该宿主细胞，或者根据权利要求23，在释放的条件下培养该细胞株；
（2）提纯所述的抗体部分。

说明书特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用 
技术领域
本发明属于生物科学和诊断试剂领域，特别涉及特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其作为诊断和治疗试剂的应用。 
背景技术
B‑Raf蛋白(也称为v‑raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)是Raf/Mil丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一。该蛋白在调控细胞增殖的Ras/Raf/MEK/ERK/MAP级联信号通路中期重要作用。B‑Raf蛋白的突变在多种人类癌症，例如黑色素癌、甲状腺乳头状癌、直肠癌、卵巢癌中都存在（Garnett and Marais,Cancer Cell，6:313‑319(2004)）。这些突变导致B‑Raf蛋白的持续激活，进而促进细胞的增殖转化和癌细胞生长。V600E突变蛋白（第600位的缬氨酸（Valine，V）突变为谷氨酸（Glutamic Acid，E）的突变蛋白）在黑色素癌和甲状腺乳头状癌中存在十分普遍（Capper et al.,Acta Neuropathol，122(1):11‑19(2011)）。其他的B‑Raf突变包括N581S和V600K等。 
针对V600E突变蛋白的抑制剂正在研发中（Chapman et al.,N Eng J Med,364(26):2507‑2516(2011)）。在这种抑制剂的使用过程中，需要一种能够特异性结合突变的B‑Raf蛋白但是不结合野生型B‑Raf蛋白的抗体。这种抗体可以被用来快速检测少量的取自病人的样品，用于诊断癌症。能够特异性结合B‑Raf突变蛋白的抗体也是治疗癌症所迫切需要的。 
发明简介 
本发明的目的是为解决上述问题而提供了分别特异性地识别B‑Raf N581S，B‑Raf V600E和B‑Raf V600K突变体蛋白的三种单克隆抗体、制 备方法及其应用。利用本发明的方法制备出的单克隆抗体能够分别特异性地识别B‑Raf N581S，B‑Raf V600E和B‑Raf V600K突变体蛋白，而不识别野生型B‑Raf蛋白。 
在一些操作实例中，所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位，其特征在于，由一条重链和一条轻链组成；重链和轻链的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列分别是由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122以及CCTCC C2012112的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列决定。在进一步的操作实例中，所述的特异性识别B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位，其特征在于，由分别包含所述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链的可变区域的氨基酸序列的一条重链和一条轻链组成。在更进一步的操作实例中，抗体或者抗原结合部位包含上述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。 
本发明的单克隆抗体可以是一种人源化的或者嵌合型的抗体。在某些操作实例中，这种单克隆抗体是IgG。 
在一方面，本发明包括保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122以及CCTCC C2012112的杂交瘤细胞。CCTCC C201283的分类命名为：杂交瘤细胞株M43#‑1，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C201284的分类命名为：杂交瘤细胞株M43#‑2，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C201285的分类命名为：杂交瘤细胞株M43‑3，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C201283的分类命名为：杂交瘤细胞株M43#‑1，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C2012122的分类命名为：杂交瘤细胞株M60‑28，保藏日期为：2012年8月24日；CCTCC C2012112的分类命名为：杂交瘤细胞株M73‑48，保藏日期为：2012年8月24日. 
本发明包括一种含有所述单克隆抗体或者抗原结合部位的药物或者可用于药物的载体。本发明还包括一种含有本发明中提到的单克隆抗体或者其抗原结合部位诊断试剂盒。 
在一些应用实例中，本发明能够提供一种癌症诊断的方法（例如，黑色素癌、甲状腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌），其主要步骤包括：用本发明所述的单克隆抗体接触来自于检测目标的生物学样本；检测抗体或者其部分与样本是否结合；如 果抗体与样本存在结合则表明被检测对象是癌症，或者存在发展成癌症的风险。 
在另外的应用实例中，本发明提供一种治疗肿瘤病人的方法，包括：检测V600E、N581S或者V600K突变形式的B‑Raf蛋白是否存在于来自于病人的样本中；如果其中一个突变存在，则使用一种B‑Raf抑制剂（例如GDC‑0879）进行治疗。本发明还提供一种治疗癌症病人（例如，黑色素癌、甲状腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌病人）的方法。该治疗方法包括给予病人一种组成成分中含有本发明的单克隆抗体或者其抗原结合部分的药物。本发明进一步提供一种使用本发明所述单克隆抗体或者其抗原结合部位作为药剂治疗黑色素癌、甲状腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌。 
本发明包括一种纯化的核酸分子，其组成为能够编码本发明中的特异性结合突变B‑Raf蛋白的的单克隆抗体的重链或者轻链或者抗原结合部分的核酸序列。进一步本发明包括含有该核酸序列的载体；该载体优化为含有包括可以联系到该核酸分子的表达调控序列。在一种应用实例中，本发明提供一种含有该核酸分子的宿主细胞。在另一个应用实例中，本发明提供一种能够产生所述的单克隆抗体或者抗原结合部位的细胞株。本发明还包括一种生产特异性结合突变型而不结合野生型B‑Raf蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位的方法。其步骤包括：在适当的条件下培养宿主细胞或者本发明中提到的细胞株；纯化所述的抗体。 
本发明基于单克隆抗体特异性结合突变型的B‑Raf蛋白的发现。我们发现这些抗体能够非常好地优先结合突变的B‑Raf蛋白（例如带有N581S、V600E或者V600K突变的B‑Raf蛋白）。这些抗体能够有效地诊断或者治疗癌症等疾病。这些抗体特别能够有效地检测生物样品中微量的B‑Raf蛋白。 
B‑Raf 
本专利所描述的B‑Raf是指鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1（v‑raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,B‑RAF）的基因或者蛋白(Sithanandam et al.,Oncogene，5(12):1775‑1780(1990))。该基因或者蛋白也被称为B‑Raf，BRAF，RAFB1，p94，NS7或者B‑Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p94）。野生型的B‑Raf蛋白序列包括SEQID NO:4，野生型B‑Raf蛋白的编码mRNA序列包括SEQ ID NO:5。 
B‑Raf是ral/mil家族的的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。B‑Raf蛋白参与调控RAS/RAF/MEK/ERK/MAP级联信号通路。 
B‑Raf蛋白的突变型式包括的一个或者多个氨基酸的插入、删除、替换等。本专利所描述的B‑Raf N581S突变指的是第581位的天冬氨酸（N）被丝氨酸（S）替换的突变；B‑Raf V600E指的是第600位的缬氨酸（V）被谷氨酸（E）替换的突变；B‑Raf V600K指的是第600位的缬氨酸（V）被赖氨酸（K）替换的突变。 
抗体与抗原结合部位 
本发明包括特异性结合突变型B‑Raf蛋白但是不结合野生型B‑Raf蛋白的单克隆抗体。“抗体”或者“免疫求蛋白Ig”指的是由重链（H，大约50‑70kDa）和轻链（L，大约25kDa）通过二硫键链接成的四聚体。轻链可以是λ轻链或者κ轻链。重链可以分为μ、δ、γ、α、ε，不同重链和轻链的组合共同决定抗体的类型分别是IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE（Fundamental Immunology Ch.7，Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989)）。 
每条重链（有时称为H链，或者HC）都含有一个重链可变区（也叫VH）和一个重链恒定区（也叫CH）。重链恒定区由三个结构与组成，分别 为CH1、CH2和CH3。每条轻链（有时也成为L链，或者LC）也有一个轻链可变区（也叫VL）和轻链恒定区（CL）。轻链恒定区只含有一个结构与CL，在轻链和重链内部，可变区和恒定区通过一个大约12个氨基酸左右的“J”形状的结构链接起来。在重链内部还有一个3个氨基酸左右的“D”形区域。重链可变区和轻链可变区可以进一步被分为超可变区，也叫互补决定区（CDR）以及穿插中间的略微保守的框架区域（FR）。这些区域以此从N端往C端排列为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个结构区域的氨基酸序列排序是根据Kabat（Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1987and 1991)）和Chothia&Lesk（Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901‑917(1987);Chothia et al.,Nature 342:878‑883(1989))的研究结果分类的。 
本发明的内容之一是特异性结合突变型B‑Raf蛋白的的单克隆抗体的抗原结合部位。“抗原结合部位”是指抗体上使其具有特异性识别并结合抗原（例如B‑Raf蛋白上一段含有特定突变的多肽片段）的功能的一段抗体片段。目前认为，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的部分片段来实现。抗体的“抗原结合部位”的特征在于包含：（1）一个Fab片段，一个包含VL、VH、CL、CH1结构域的单价片段；（2）一个F(ab')2片段，一个含有通过铰链区的的二硫键连接起来的Fab片段的二价片段；（3）一个包含VH和CH1结构域的Fd片段；（4）抗体单臂包含一个VL、VH结构域的Fv片段；（5）一个由VH结构域组成的dAb片段（Ward et al.,(1989)Nature 341:544‑546）；（6）一个独立的互补决定区（CDR）。更进一步地，尽管FV片段的两个结构域VH和VL是由不同的独立基因编码的，但是可以用基因重组的方式通过合成一个链接区域将它们连接起来，形成由单链蛋白内部的VH和VL配对成单价分子，也称为单链FV（scFV）（Bird et al.Science 242:423‑426(1988)and Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879‑5883(1988)）。这种单链抗体也包括在“抗原结合部位” 的范围内。抗体的一部分，比如Fab和F(ab')2片段，可以从全长的抗体通过常规的技术，比如木瓜酶（papain）或者胃蛋白酶(Pepsin)酶消化的方法获得。它们也可以通过下面描述的标准的DNA重组技术获得。 
抗B‑Raf抗体及其抗原结合部位 
本发明的抗体可以用来自于人类B‑Raf突变蛋白的抗原免疫非人类的动物（例如，小鼠、兔子、大鼠或者仓鼠）来制备。这些抗体也可以通过噬菌体展示技术或者其它的已知的抗体制备技术获得。抗原可以是纯化的多聚多肽或者多肽，也可以是在细胞内表达的多聚多肽或者多肽。 
特定疾病相关的突变的B‑Raf蛋白包括B‑Raf V600E，B‑Raf N581S，B‑Raf V600K。本发明中特异性结合B‑Raf V600E蛋白的抗体可以通过多肽KIGDFGLATEKSRWSGS(SEQ IDNO:1)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201283,CCTCC C201284和CCTCC C201285。本发明中特异性结合B‑Raf V600K蛋白的抗体可以通过多肽KIGDFGLATKKSRWSGS(SEQ ID NO:2)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C2012122。本发明中特异性结合B‑Raf N581S蛋白的抗体可以通过多肽SIIHRDLKSNSIFLHED(SEQ ID NO:3)免疫小鼠来获得。本发明中的通过该多肽免疫获得的杂交瘤细胞已经保藏在符合布达佩斯协议的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C2012112。 
本发明进一步包含一种单克隆抗体或者其抗原结合部位，它们包括由保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列。在一些操作实例中，本发明中的单克隆抗体或许只包含由保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链氨基酸序列或者轻链氨基酸序列。 
在某些操作实例中，本发明的抗B‑Raf抗体或者抗原结合部位包含一条或者多条由保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链或者轻链或者CDR的氨基酸序列。在某些操作实例中，抗体或者抗原结合部位包括由保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链的所有CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列。 
在某些操作实例中，本发明的抗B‑Raf抗体或者抗原结合部位包含由保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链或者轻链可变区的氨基酸序列。在特定的操作实例中，抗体或者抗原结合部位同时包含由保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCCC2012122、CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链或者轻链可变区的氨基酸序列。 
B‑Raf的结合特异性 
本发明的抗体或者抗原结合部位能够分别特异性地结合突变型的B‑Raf V600E、B‑Raf V600K、B‑Raf N581S蛋白，但是不结合野生型的B‑Raf蛋白（完全不结合或者在某种程度上不结合）。换言之，该抗体或者抗原结合部位能够区分突变型和野生型的人类B‑Raf蛋白。该结合的特异性可以用已知的常用检测手段进行确认，例如免疫印迹实验（Western blot），酶联免疫吸附实验（ELISA），流式细胞分选，免疫共沉淀，免疫荧光，免疫组织化学染色，表面离子共振（例如BIACORETM）或者放射免疫实验等方法。 
在一些操作实例中，该抗体能够特异性地优先结合突变型的B‑Raf蛋白，对于突变型B‑Raf蛋白的结合能力至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍强于其对野生型B‑Raf蛋白的结合能力。在某些操作实例中，本发明中的抗体或者抗原结合部位特异性结合突变型B‑Raf蛋白的解离平衡常数KD至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍强于对野生型B‑Raf蛋白的结合的解离平衡常数（KD）。解离平衡常数（KD）可以通过表面离子共振或者流式细胞计数测得。 
本发明的抗体或者抗原结合部位或许只能结合一种B‑Raf突变蛋白而不能结合其他的B‑Raf突变蛋白（例如B‑Raf V600E、B‑Raf V600K、B‑Raf N581S中的一种）。举例来说，该抗体特异性地结合B‑Raf V600K蛋白的能力或许至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍强于其对其它任何一种突变B‑Raf蛋白的结合能力。 
在一些操作实例中，该抗体或许只能结合B‑Raf V600K蛋白而不结合其他突变型的B‑Raf蛋白（例如B‑Raf V600E、B‑Raf N581S蛋白）。举例来说，该抗体特异性地结合B‑Raf V600K蛋白的能力或许至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍强于其对其它任何一种突变B‑Raf蛋白（例如B‑Raf V600E、B‑Raf N581S蛋白）的结合能力。 
在另一些操作实例中，该抗体或许只能结合B‑Raf N581S蛋白而不结合其他突变型的B‑Raf蛋白（例如B‑Raf V600E、B‑Raf V600K蛋白）。举例来说，该抗体特异性地结合B‑Raf N581S蛋白的能力或许至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍强于其对其它任何一种突变B‑Raf蛋白（例如B‑Raf V600E、B‑Raf V600K蛋白）的结合能力。 
在一些操作实例中，本发明中的抗体或者抗原结合部位能够特异性结合含有SEQ ID NO:1，2，或者3的B‑Raf多肽。在一些操作实例中，本发明的抗体或者抗原结合部位特异性结合保藏号为CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的抗原表位或者与其重合的抗原表位。 
生产抗体的重组方法 
本发明包括编码能够特异性结合人类突变型的B‑Raf蛋白但是不能结合野生型B‑Raf蛋白的单克隆抗体及其抗原结合部位的核酸序列。人类突变的B‑Raf蛋白包括：V600E，V600K以及N581S。在一些操作实例当中，该核酸分子只编码单克隆抗体或者抗原结合部位的重链或者轻链。在另外一些操作实例当中，该核酸分子同时编码单克隆抗体及其抗原结合部位的重链和轻链。在一些操作实例中，该核酸分子编码保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链、轻链、重链可变区或者轻链可变区。核算可以是纯化的核酸分子。 
编码本发明抗体的核酸分子可以从任何能够产生该抗体的来源中获得。例如，核酸可以从保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的杂交瘤细胞中获得。分离纯化编码抗体的核酸的方法是一种已知的常见的技术。具体方法可以参见书籍：[美]J.莎姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，第三版，2002年。 
在一些操作实例中，编码本发明中的单克隆抗体的重链的核酸序列可以是由编码本发明抗体的VH结构域的核酸序列与一条编码任意其它来源抗体的重链恒定区的组成的同框编码序列。类似地，一条编码本发明的抗B‑Raf蛋白的轻链的核酸分子也可以是由编码本发明抗体的VL结构域的核 酸序列与一条编码任意其它来源的抗体的轻链恒定区的组成的同框编码序列。 
在进一步的操作实例中，编码重链可变区（VH）和/或者轻链可变区（VL）的核酸分子被转化为全长的抗体编码基因。在一些操作实例中，编码VH或者VL结构域的核酸序列被分别通过插入到已经含有重链恒定区（CH）或者轻链恒定区（CL）的表达载体中去的方法构建为一个全长抗体基因。这样构建的全长抗体基因的CH的片段与CL的片段在载体内部相连接，并且/或者编码VH的片段与编码VL的片段在载体内部相连接。在另外的操作实例中，编码VH以及/或者VL结构域的核酸序列分别通过核酸重组技术被连接到一个编码CH的片段和/或者编码CL的片段上面。编码人类免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域的基因是已知的。具体参见著作Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,NIH Publ.No.91‑3242,1991。编码全长重链和/或者轻链的核酸分子可以在被引入和纯化B‑Raf抗体的细胞株中表达。 
可以使用核酸分子实现重组表达大量的B‑Raf抗体。也可以用核酸分子来生产嵌合抗体，双特异性结合抗体，单链抗体，免疫粘附剂，双头抗体，突变抗体以及抗体衍生物。如果该核酸分子来自于非人类、非转基因动物，该核酸分子也可能被用来实现抗体的人源化。 
本发明还包括插入有编码抗体重链、轻链或者同时编码本发明的B‑Raf抗体或者其抗原结合部位的核酸分子。该载体可能适合于在原核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中表达本发明中的抗体或者其抗原结合部位。 
常见的哺乳动物细胞包括很多永生细胞系都可以用来作为表达宿主。这些细胞系包括但不限于：中国仓鼠卵巢细胞（CHO），NS0细胞，SP2细胞，HEK293T细胞，293Freestyle（Invitrogen公司），NIH3T3细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾细胞（BHK），非洲绿猴肾细胞，人类肝癌细胞（如 HepG2），以及A549细胞。其它可以用于表达的细胞有昆虫细胞，包括sf9和sf21细胞。植物宿主细胞包括：烟草，拟南芥，浮萍，玉米，小麦，番茄，水稻来源的细胞。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和放线菌。酵母宿主包括裂殖酵母，酿酒酵母，毕赤酵母。 
利用不同的细胞系在不同的培养条件下，或者利用转基因动物表达的抗体能够有不同的糖基化模式。但是不论其糖基化模式是怎样的，所有由所述的核酸或者含有所述核酸的序列编码的抗体都是本发明的内容。 
嵌合与人源化抗体 
这里所说的嵌合抗体，其特征在于有来自于两种或者更多种不同的抗体的结构域组成的抗体。例如，嵌合抗体的可变区结构域可能是来自于保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，但是其恒定区可能是来自于人类抗体。这种嵌合抗体在作为人类的治疗药物时具有较少的免疫原性。 
在一些操作实例中，本发明抗体的人源化抗体是一种将本发明中的来源于老鼠的抗体的CDR结构域插入到人类受体抗体中去。因此，嵌合抗体的FR和恒定区域来自于人类。这种含有人类FR区域的人源化B‑Raf抗体在人类身上比只是恒定区来自于人类的嵌合抗体具有更小的免疫原性。在一些操作实例中，人源化抗体的CDR序列可以是来自于保藏号为CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者CCTCCC2012112的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。抗体人源化的方法是一种已知的成熟技术。 
修饰与标签抗体 
本发明还包括以上所描述的抗B‑Raf单克隆抗体或其抗原结合部位被至少一种额外分子或集团修饰而成的抗体。该修饰可以是用于纯化或者 检测该抗体的，以及/或者增强其治疗效果。例如，抗体或者抗原结合部位可以连接到一种检测试剂、标签、细胞毒性试剂、药物分子以及/或者蛋白或多肽，以便接到该抗体或者其抗原结合部位与其它一种分子（例如亲和素核心区域，或者多聚组氨酸标签）的结合。常见的检测标签包括但不限于：放射性同位素（例如125I,131I,35S or 3H），荧光复合物（例如荧光素，二氯三嗪氨荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，5‑二甲氨基‑1‑萘磺酰氯苯，荧光素PE，稀土发光物，伞形酮，丹磺酰氯），以及酶（例如辣根过氧化物酶，O‑半乳糖苷酶，β‑半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，乙酰胆碱酯酶）。在进一步的操作实例中，本发明所述抗体或者其部分可以被标记生物素，或者已经证明可以被另一个报告分子（例如亮氨酸拉链配对区域，二抗结合位点，金属集合结构域，表位标签）识别的多肽表位。在更进一步的操作实例中，任意一种抗体或者其部分可以利用聚乙烯醇（PEG），甲基或乙基或者糖基经行修饰。 
抗B‑Raf抗体或者其抗原结合部位的诊断用途 
本发明的一个方面是使用所述的抗B‑Raf抗体或者其抗原结合部位作为一种癌症诊断试剂。癌症指的是任意一种恶性肿瘤，包括任何阶段和级别的癌症。可能用本发明的单克隆抗体诊断的癌症具体例子包括但是不限于：黑色素癌，甲状腺癌（例如甲状腺乳头状癌），胰腺癌，食道癌，结肠癌，直肠癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌（例如非小细胞肺癌），脑癌，肝癌，胃癌或者造血组织癌（例如毛细胞白血病）。 
诊断包括检测癌症的发展程度，确认癌症的存在，或者癌症的分型或分类。在一些操作实例中，本发明可以提供一种诊断目标中癌症的方法，其步骤包括：用本发明所述的抗B‑Raf单克隆抗体接触来自于检测目标的生物学样本；检测抗体或者其部分与样本是否结合；如果抗体与样本存在结合则表明被检测主体是癌症，或者存在发展成癌症的风险。检测的样本 可以是血液，血清，淋巴，组织（例如穿刺或者甲醛和石蜡固定的包被切片）。 
抗体结合到样本上与否可以用常见的的已知技术检测，包括但是不限于：ELISA，RIA，流式细胞，免疫细胞化学，免疫组织化学，免疫荧光，免疫印迹，或者免疫共沉淀。抗B‑Raf抗体或者其部分也可以用一种可以检测的标记物直接标记。如果抗体没有被标记，则可以使用一种能够结合B‑Raf抗体并能够被检测到的二抗或者其它分子。根据已有的常识，特定的二抗能够特异性地结合特定的种类和亚型的一抗。例如，如果抗B‑Raf抗体是一种小鼠IgG，则二抗必须是一种标记的抗小鼠IgG的抗体。其它能够结合抗体的分子包括但是不限于Protein A和Protein G。他们都有多种商业化的形式。例如来自Pierce公司的Protein A和Protein G。适合用来标记抗体或者二抗的分子包括但是不限于：酶，辅基，荧光材料，发光材料，磁性材料以及放射性材料（见上文描述）。在一些操作实例中，本发明的抗体或者其部分可以提供在一种包含检测抗体结合试剂的试剂盒中。 
抗B‑Raf抗体或者其部分还可以用来检查癌症病人的发展进程，然后决定采取哪一种治疗治疗方案。例如在治疗方案的伴随检测中。医务人员可能根据B‑Raf突变的检测结果来决定对特定病人最优的治疗方案。治疗方案可以是手术，放射性治疗，药物治疗（包括化学治疗与靶向治疗），或者以上多种治疗方式的结合。举例来说，本发明包括一种治疗癌症病人的方法，其特征在于包括：检查来自病人的生物样本是否带有V600E、V600K或者N581S突变；如果存在某种突变则对病人给予B‑Raf抑制剂治疗。B‑Raf抑制剂可能是一种siRNA，反义RNA，微小RNA药物，抗B‑Raf抗体或者小分子化合物。例如，B‑Raf抑制剂可以是威罗菲尼片 索拉非尼（BAY43‑9006, ），帕尼单抗，GDC‑0879，PLX‑4720，GSK2118436/SB590885，AZ628，RAF265(CHIR‑265) 或者XL281。在给予病人抗B‑Raf药物的靶向治疗之前检测是否存在B‑Raf突变对于治疗十分有意义。 
抗B‑Raf抗体及其抗原结合部位的治疗应用 
本发明同样提供一种抗体及其抗原结合部位作为治疗性药物的应用包括用本发明的抗体或者其部分作为治疗人类的应用，以及使用抗体或者其部分作为制造用于治疗人类癌症药物的应用。这些人类癌症包括黑色素癌，甲状腺癌，胰腺癌，食道癌，结肠癌，直肠癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，脑癌，肝癌，胃癌或者造血组织癌。详细的癌症种类亦可参阅上文的描述。 
在一些操作实例中，医务人员给予能够对特定疾病达到有效剂量的本发明的抗体或者部分，一般是一种嵌合的或者人源化的抗体或者部分，从而实现减缓或者治疗该疾病，防止癌症转移或者进一步发展。抗体的给药方式可以是例如：注射或者浸注。抗体或者部分的剂量可以由医务人员决定，大致范围为0.1到100毫克/公斤体重，更优地为0.5到50毫克/公斤体重，更优地为1到20毫克/公斤体重，更优地为1到10毫克/公斤体重。治疗的效果可以通过监测例如肿瘤体积缩小的程度来说明。 
本发明的治疗性药物的成分除了所述的单克隆抗体或者其部分以外，可能包括一种可接受的药剂载体。可接受的药剂载体其特征在于，可以是一种溶剂，分散剂，包被剂，抗菌剂和抗真菌剂，渗透平衡剂和吸附延缓剂，其特征是具有生理兼容性。在很多情况下，优先的载体包括渗透平衡剂，例如糖类，多聚醇如甘露醇，山梨醇，氯化钠组分。其它可以接受的药剂材料包括湿润剂或者少量的辅剂，例如湿润剂，乳化剂，保护剂或缓冲液，它们能够增加抗体的保质期或者效果。 
在一些操作实例中，本发明的抗B‑Raf抗体或者其部分被与其它一种和/或者多种治疗药物，诊断药物，或者预防剂混合在一起。治疗药物包 括但不限于具有不同细微特异性差异的结合不同靶标的抗B‑Raf抗体，以及B‑Raf抑制剂，例如抑制剂可以是威罗菲尼片 索拉非尼（BAY43‑9006, ），帕尼单抗，GDC‑0879(Hoeflich et al.,Cancer Res，69(7):3042‑3051(2009))，PLX‑4720(Tsai et al.PNAS，105:3041–3046(2004))，GSK2118436/SB590885(Kefford et al.,J Clin Oncol 2010;28:(suppl;abstr 8503))，AZ628，RAF265(CHIR‑265)(Mordant et al.,Mol Cancer Ther 2010;9:358‑368(2010)，Su et al.,Clin Cancer Res，18(8):2184‑2198(2012))或者XL281(Schwartz et al.,J.Clin.Oncol.,27(Suppl):3513.39(2009))。 
本发明的药剂组成可能含有一种“治疗有效剂量”或者“预防有效量”的本发明的抗体或者抗原结合部位。“治疗有效剂量”是指在一定的疗程和剂量下，要达到有治疗效果的有效药物量。抗体及其抗原结合部分的治疗有效剂量可能根据多种因素，例如疾病进程，年龄，性别，体重，以及抗体或者抗体部分能够在个体内所引起的反应能力而有所不同。治疗有效剂量也包含了该抗体或者抗原结合部位的有利作用强于任何毒性或者不利作用的意思。“预防有效量”是指在一定的疗程和剂量下，要达到有预防效果的有效药物量。通常由于预防药物都是在疾病发生之前或者疾病早期使用，因此预防有效量可能会小于治疗有效量。 
除非特别声明，这里所用的所有的技术或者科学属于都与一般熟知本发明领域的人员的常识相一致。可效仿的方法和材料在下面将进行详细描述，尽管与这里描述的相似或者同样的方法和材料也可以用来检验本发明。所有的参考文献都详细列出。尽管引用了大量的文献，但是这些引用并不表明承认任何文献是该领域的常识。本专利描述过程中使用的“包含”“包括”应当被理解为表明包含所述的完整对象或者群体对象，而不是排除任何其他的对象或者群体对象。材料、方法和实例仅是为了说明本发明的技术方案，并非限制。 
以下实例是为了描述本发明的方法与材料。对描述的条件或参数适当的修改或者同等替换通常符合本领域技术人员的明显常识，因此依然属于本发明的精神和范围。 
附图说明
图1显示保藏号为CCTCC C2012112的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf N581S蛋白，却不能结合野生型的B‑Raf蛋白的免疫印染实验图谱。泳道1含有大肠杆菌表达的野生型B‑Raf蛋白。泳道2含有大肠杆菌表达的突变型B‑Raf N581S蛋白。泳道3含有HEK293T细胞表达的野生型B‑Raf蛋白。泳道4含有HEK293T细胞表达的突变型B‑Raf N581S蛋白。 
图2显示保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf V600E蛋白，却不能结合野生型的B‑Raf蛋白的免疫印染实验图谱。泳道1含有大肠杆菌表达的野生型B‑Raf蛋白。泳道2含有大肠杆菌表达的突变型B‑Raf V600E蛋白。泳道3含有HEK293T细胞表达的野生型B‑Raf蛋白。泳道4含有HEK293T细胞表达的突变型B‑Raf V600E蛋白。 
图3显示保藏号为CCTCC C2012122的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf V600K蛋白，却不能结合野生型的B‑Raf蛋白的免疫印染实验图谱。泳道1含有大肠杆菌表达的野生型B‑Raf蛋白。泳道2含有大肠杆菌表达的突变型B‑Raf V600K蛋白。泳道3含有HEK293T细胞表达的野生型B‑Raf蛋白。泳道4含有HEK293T细胞表达的突变型B‑Raf V600K蛋白。 
图4显示保藏号为CCTCC C2012112的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf N581S蛋白，却不能结合野生型B‑Raf蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP）信号分别指示野生型B‑Raf（上面）和突变型B‑Raf N581S蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与B‑Raf蛋白的结合，并且只在表达B‑Raf N581S蛋白的细胞（下面）中出现。 
图5显示保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf V600E蛋白，却不能结合野生型B‑Raf蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP）信号分别指示野生型B‑Raf（上面）和突变型B‑Raf V600E蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与B‑Raf蛋白的结合，并且只在表达B‑Raf V600E蛋白的细胞（下面）中出现。 
图6显示保藏号为CCTCC C2012122的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf V600K蛋白，却不能结合野生型B‑Raf蛋白的免疫荧光实验图谱。绿色荧光蛋白（GFP）信号分别指示野生型B‑Raf（上面）和突变型B‑Raf V600K蛋白（下面）的表达。红色荧光信号能够指示该抗体与B‑Raf蛋白的结合，并且只在表达B‑Raf V600K蛋白的细胞（下面）中出现。 
图7保藏号为CCTCC C2012112的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf N581S蛋白，却不能结合野生型B‑Raf蛋白的免疫组织化学实验图谱。棕色信号指示抗体结合到癌细胞中的B‑Raf N581S突变蛋白上。蓝色信号指示细胞核。 
图8保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf V600E蛋白，却不能结合野生型B‑Raf蛋白的免疫组织化学实验图谱。棕色信号指示抗体结合到癌细胞中的B‑Raf V600E突变蛋白上。蓝色信号指示细胞核。 
图9保藏号为CCTCC C2012122的细胞株产生的抗体特异性结合B‑Raf V600K蛋白，却不能结合野生型B‑Raf蛋白的免疫组织化学实验图谱。棕色信号指示抗体结合到癌细胞中的B‑Raf V600K突变蛋白上。蓝色信号指示细胞核。 
具体实施方式
实施例1 
特异性结合B‑Raf突变蛋白的单克隆抗体的生产 
含有B‑Raf突变蛋白氨基酸序列的多肽通过合成获得。详细的多肽序列在下表中列出，相对野生型蛋白的突变氨基酸加下划线标示： 
表1突变的B‑Raf多肽 
 B‑Raf突变   多肽序列（突变氨基酸加下划线）   N581S    SIIHRDLKSNSIFLHED(SEQ ID NO:3)  V600E    KIGDFGLATEKSRWSGS(SEQ ID NO:1)  V600K    KIGDFGLATKKSRWSGS(SEQ ID NO:2)
每条合成的多肽都被偶联到琥珀酰化钥孔傶血兰蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）上，用来免疫小鼠，并利用弗氏佐剂混合增强免疫效果。将用以上多肽免疫的抗B‑Raf N581S、V600E、V600K小鼠的脾脏细胞分别与小鼠骨髓瘤SP2/O细胞通过聚乙烯醇（PEG）介导融合。用ELISA实验筛选阳性克隆。阳性克隆细胞注射到相同品系的小鼠腹腔，产生腹水。从腹水中纯化抗体。 
通过用含有突变的B‑Raf蛋白的多肽免疫小鼠产生的杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC，湖北省武汉市武汉大学，430072）.杂交瘤细胞的名称和保藏编号在下表中列出。 
表2抗B‑Raf杂交瘤细胞株以及保藏编号 
  抗体及其特异性   保藏编号   Anti‑B‑RafN581S   CCTCC C2012112  Anti‑B‑Raf V600E  CCTCC C201283   Anti‑B‑Raf V600E  CCTCC C201284   Anti‑B‑Raf V600E  CCTCC C201285   Anti‑B‑Raf V600K  CCTCC C2012122
实施例2 
免疫印迹实验分析单克隆抗体特异性结合大肠杆菌和动物细胞表达的突变蛋白 
在大肠杆菌中中表达B‑Raf蛋白时，将编码B‑Raf野生型以及N581S、V600E、V600K突变型蛋白的cDNA序列克隆到带有6个组氨酸标签的细菌表达载体pET28a上。构建好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并将转化的细菌涂布到含有卡那霉素的LB培养基平板上，在37℃培养。从平板上挑选单克隆菌落，放入含有500毫升含有卡那霉素的LB培养基的锥形瓶中。将锥形瓶放在37℃的摇床中培养到OD600接近1.0。然后往锥形瓶中加入0.2mM的IPTG在37℃诱导培养3个小时。离心收集培养的细菌，然后加入裂解液（20mM Tris，100mM NaCl，1%TritonTM X‑100，以及蛋白酶抑制剂）。裂解的细菌液在12000g的速度下离心30分钟，收集上清。将上清加入到一个镍柱上，按照镍柱生产商的说明纯化得到纯的B‑Raf蛋白。然后将0.1μg每种纯化的B‑Raf蛋白分别与等体积的2×SDS上样缓冲液混合，并在95℃加热10分钟。 
在用哺乳动物细胞表达时，将编码B‑Raf野生型以及N581S、V600E、V600K突变型蛋白的cDNA序列克隆到哺乳动物表达载体pCNDA3.0中，并且与一个编码绿色荧光蛋白（GFP）的序列融合形成一个开放阅读框。构建好的质粒转化到DH5α大肠杆菌中，以扩增并抽提质粒。在转染前一天，将HEK293T细胞以30%的密度铺到24孔细胞培养板中，放在37℃的5% CO2培养箱中培养。然后将含有0.5μg表达每种B‑Raf蛋白的质粒用标准的磷酸钙转染的方法转染到HEK293T细胞中。转染的细胞继续培养24小时。然后将转染的细胞收集，每孔细胞加入20μl的细胞裂解液，在冰上放置10分钟。然后将细胞在12000转的速度下离心10分钟，收集上清。分别取10μl每种细胞裂解液的上清，与等体积的2×SDS上样缓冲液混合，并在95℃加热10分钟。 
将10μl每种准备好的B‑Raf蛋白样品加入到10%的SDS‑PAGE蛋白 胶上。在90伏电压下电泳90分钟。然后将胶上分离的蛋白转移到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封闭PVDF膜。然后将转印有B‑Raf蛋白的PVDF膜放到含有实施例1中纯化的抗体的TBS缓冲液中在4℃孵育16小时。然后去掉抗体，用含有0.1%吐温 ‑20的TBS缓冲液漂洗三次PVDF膜，每次漂洗5分钟。然后将膜放入含有HRP‑标记的抗小鼠的二抗中孵育30分钟。去掉二抗，再次用含有0.1%吐温 ‑20的TBS缓冲液漂洗三次PVDF膜，每次漂洗5分钟。然后将膜放入到含有ECL底物的溶液中浸润，并在暗室中用胶片感光。洗片，显影，定影。 
图1，图2和图3显示，在免疫印迹实验中，实施例1中生产的B‑Raf N581S，抗B‑Raf V600E以及抗B‑Raf V600K单克隆抗体能够分别特异性地结合B‑Raf N581S，B‑Raf V600E以及B‑Raf V600K突变蛋白，但是并不结合野生型的B‑Raf蛋白，并且不论该蛋白是在大肠杆菌中表达的，还是在哺乳动物细胞中表达的。 
实施例3 
免疫荧光实验分析这些单克隆抗体特异性结合哺乳动物细胞内表达的B‑Raf蛋白 
能够表达带有GFP标签的野生型以及N581S、V600E、V600K突变型B‑Raf蛋白的pCDNA3.0质粒按照实施例2的方法构建。在转染前，将无菌处理的载玻片放到24孔细胞培养板中，并将HEK293T细胞以30%的密度铺到这些孔内，放在37℃的5% CO2培养箱中培养。然后将含有0.5μg表达每种B‑Raf蛋白的质粒用标准的磷酸钙转染的方法转染到HEK293T细胞中。转染的细胞继续培养36小时。然后将细胞用3.7%的多聚甲醛固定10分钟。以及含有1%TritonTM X‑100的PBS缓冲液处理细胞10分钟，以增加其通透性。然后用含有5%谈牛血清的的PBS封闭处理10分钟。然后将这些处理的细胞分别放在含有实施例1生产的抗B‑Raf单克隆抗体 的缓冲液中在4℃孵育16小时。然后去掉抗体，将细胞用PBS缓冲液漂洗三次，每次漂洗5分钟。然后加入标记有荧光发光物的抗小鼠的二抗中孵育30分钟。同时在二抗溶液中加入DAPI染料以染色细胞核。去掉二抗，再次用PBS缓冲液漂洗三次，每次漂洗5分钟。然后将附着有细胞的载玻片取出来，固定到载玻片上并且用指甲油封闭。在荧光显微镜下观察细胞并拍照。 
图4，图5以及图6显示，在免疫荧光实验中，实施例1中生产的B‑Raf N581S，抗B‑Raf V600E以及抗B‑Raf V600K单克隆抗体能够分别特异性地结合在哺乳动物细胞中表达的B‑Raf N581S，B‑Raf V600E以及B‑Raf V600K突变蛋白，但是并不结合野生型的B‑Raf蛋白。 
实施例4 
免疫组织化学实验分析抗B‑Raf抗抗体特异性结合肿瘤组织中的突变B‑Raf蛋白 
从已经被诊断为黑色素癌的病人身上获得的肿瘤组织被制成甲醛固定的石蜡切片。这些癌症病例都是经过DNA测序的方法确认的含有特定的B‑Raf突变的。将切片在60℃干燥1小时，然后在二甲苯中浸泡2次，每次10分钟。然后将切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡5分钟。用蒸馏水漂洗切片三次，，并在30%的双氧水（H2O2）中浸泡10分钟。再次用蒸馏水漂洗切片三次，并在柠檬酸缓冲液中煮沸90秒。用PBS漂洗三次之后将切片放入小鼠血清中封闭30分钟。去掉血清，将切片分别放在含有实施例1生产的抗B‑Raf单克隆抗体的缓冲液中在4℃孵育16小时。然后去掉抗体，将细胞用含有0.1%吐温 ‑20的TBS缓冲液漂洗三次，每次漂洗5分钟。然后往切片上滴加HRP标记的山羊抗小鼠第二抗体，并在室温孵育30分钟。然后去掉抗体，将细胞用含有0.1%吐温 ‑20的TBS缓冲液漂洗三次，每次漂洗5分钟。往切片上滴加DAB显色底物。60秒之后用水冲掉大半底物，终止显色反应。然后将切片放 入苏木紫中在室温浸泡30秒。然后将苏木紫去掉，将切片依次放入75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇中浸泡，每种乙醇浸泡2分钟。再将切片放入二甲苯中浸泡10分钟。最后用中性树脂封闭切片。将切片放在可见光显微镜下观察并拍照。 
图7，图8以及图9显示，在免疫组织化学染色实验中，实施例1中生产的B‑Raf N581S，抗B‑Raf V600E以及抗B‑Raf V600K单克隆抗体能 
够分别特异性地结合制作成甲醛固定的石蜡切片的人体肿瘤组织中的B‑Raf N581S，B‑Raf V600E以及B‑Raf V600K突变蛋白，但是并不结合野生型的B‑Raf蛋白。 
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。