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1、(10)申请公布号 CN 103173450 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173450 A *CN103173450A* (21)申请号 201310072758.1 (22)申请日 2013.03.07 C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 新乡医学院第一附属医院 地址 453199 河南省新乡市卫辉市健康路 88 号 (72)发明人 赵宝生 刘尚国 钟根深 秦秀广 王天云 李汉臣 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 (54) 发明名称 与食管癌术后早期复发及。
2、预后相关的 miRNA 标志物及其应用 (57) 摘要 本发明公开了与食管癌术后早期复发及预后 相关的 miRNA 标志物及其应用， 其中， miRNA 标志 物为 has-miR-198。该 miRNA 标志物在制备食管 癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的 应用。一种与食管癌术后早期复发及预后相关 的 miRNA 标志物的引物在制备食管癌术后早期复 发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用。一种与 食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物 的引物的食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试 剂盒。本发明方法简单、 操作方便， 筛选得到的 has-miR-198 可辅助判断食管癌患者的预后或死。
3、 亡风险， 推动了食管癌诊治方面的发展。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103173450 A CN 103173450 A *CN103173450A* 1/1 页 2 1.与食管癌术后早期复发及预后相关的miRNA标志物， 其特征在于， 所述miRNA标志物 为 has-miR-198。 2. 根据权利要求 1 所述的一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物， 其 特征在于， 。
4、所述 miRNA 标志物的引物如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示。 3.一种如权利要求1所述的与食管癌术后早期复发及预后相关的miRNA标志物在制备 食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用。 4.根据权利要求3所述的与食管癌术后早期复发及预后相关的miRNA标志物在制备食 管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利 要求 2 所述的引物、 聚合酶链反应试剂、 U6snRNA 内参引物及荧光染料 SYBR-Green1。 5.一种如权利要求1所述的与食管癌术后早期复发及预后相关的miRNA标志物。
5、的引物 在制备食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用。 6.一种含权利要求1所述的与食管癌术后早期复发及预后相关的miRNA标志物的引物 的食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒。 权 利 要 求 书 CN 103173450 A 2 1/10 页 3 与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物及其应 用 技术领域 0001 本发明涉及与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物， 同时还涉及该标 志物的应用， 属于基因工程及肿瘤学领域。 背景技术 0002 食管癌 (Esophageal carcinoma， EC) 是常见的消化道恶性肿瘤， 占消化系统各部 位肿。
6、瘤死亡的第二位， 全世界每年死于此病达 30 万人， 其中中国每年平均死亡约 15 万人， 是世界上食管癌发病率最高的国家。尽管近年来在食管癌的化疗、 放疗以及同期放化疗等 方面取得了较大进展， 但至今外科手术仍是食管癌最主要的治疗手段。 但治疗效果不理想， 5 年生存率仅为 30% 左右， 死亡的主要原因为术后复发和转移， 尤其是食管癌患者术后早期 淋巴结转移。目前国内外报道其术后早期复发和转移率 （术后 1 年内） 可达约 20-50% 不等， 这对患者及外科医师的信心均是沉重打击， 部分患者甚至对外科手术疗效产生疑问。食管 癌患者的自然病程或者称生存期约为 6-12 月， 术后 1 年内。
7、出现早期复发和转移， 意味着手 术的失败， 或者说对这些患者采取放化疗更有益。 0003 影响食管癌预后的因素很多， 目前判断食管癌预后的主要方法还是传统的 Tumor Nodemetastasis(TNM) 分期方法。食管癌的临床诊治过程中， 经典的 TNM 病理分期系统对 于不同病理分期预后判断起着重要作用， 但对于临床工作中遇到的病理分期相同而预后差 异明显的情况无法解释， 而且缺乏对术后出现早期复发的判断作用。 目前， 临床工作者正在 进一步完善 TNM 分期系统以评估预后。与此同时， 基础医务工作者也从肿瘤异质性方面不 同来考虑， 寻找新的判断预后的分子指标， 作为 TNM 病理分期。
8、系统的有益补充。食管癌的发 生、 发展过程中涉及多个癌基因、 抑癌基因的突变， 产生各种酶学的改变， 表现为多基因、 多 因素、 多步骤的协同作用。对于食管癌诊断和预后有关的分子生物学标志物的研究已成为 研究重点。 0004 目前食管癌肿瘤分子标记物的研究和报告较多， 除传统意义的肿瘤标记物癌胚抗 原 （CEA)、 鳞状上皮细胞癌相关抗原 （SCC） 、 细胞角化素蛋白片段 19（CYFRA2ll） 、 p53 蛋 白抗体 （p53-Ab） 等以外， 目前研究中热点分子标记物 EGFR（表皮生长因子受体） 、 CycIinDl （细胞周期蛋白 Dl） 、 COX-2（环氧化酶 2） 、 PCN。
9、A（增殖细胞核抗原） 、 VEGF（血管内皮细胞生 长因子） 等都对食管癌预后判断有一定的临床意义， 但以上分子标记物主要集中于对不同 肿瘤病理分期的研究， 以及对淋巴结转移、 肿瘤浸润深度等单个因素的影响， 缺乏对相同病 理分期、 同一术者、 相同术式、 相同术后治疗方案而预后不同分子标记物的研究， 缺乏对食 管癌术后出现早期复发和转移的研究， 缺少特异性和灵敏性高的分子标记物来预测食管癌 的发生、 发展和预后， 而且食管癌变和发展过程是多基因改变的结果， 其分子生物学变化并 不完全相同， 联合分子标记物检测有助于提高判断预后的敏感性。 0005 microRNAs（miRNAs） 是一类长。
10、度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控 RNA， 通 过序列特异性翻译抑制或 mRNA 裂解来调控基因表达， 参与细胞发育、 增殖、 分化、 凋亡等一 说 明 书 CN 103173450 A 3 2/10 页 4 系列重要生物学进程。近期的研究发现， miRNA 具有癌基因和抑癌基因的作用， 在肿瘤的发 生和发展中起着重要的作用。如能筛选出食管癌术后早期复发及预后特异或异常表达的 miRNA 作为生物标志物， 并研制相应的疾病进展监测、 辅助诊断试剂盒， 对我们食管癌的诊 治现状必将是一次有力的推动， 尤其对一些患者避免不必要的外科手术有着重要的意义。 此外， 这些异常表达的 miRNA 对于。
11、食管癌细胞迁移、 转移能力的影响等， 还有助于发现具有 潜在治疗价值的新型小分子药物。 发明内容 0006 本发明的目的是提供与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物。 0007 为了实现以上目的， 本发明所采用的技术方案是提供与食管癌术后早期复发及预 后相关的 miRNA 标志物， 所述 miRNA 标志物为 has-miR-198。 0008 所述 miRNA 标志物的引物如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示。 0009 本发明的目的还在于提供一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志 物在制备食管癌术后早期复发及预。
12、后辅助诊断试剂盒方面的应用。 0010 本发明所采用的技术方案还在于提供一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物在制备食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用。 0011 所述试剂盒包括 has-miR-198 的引物、 聚合酶链反应试剂、 U6snRNA 内参引物及荧 光染料 SYBR-Green1。 0012 本发明的目的还在于提供一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志 物的引物在制备食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用。 0013 本发明所采用的技术方案还在于提供一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物的引物在制备食管癌。
13、术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒方面的应用。 0014 本发明的目的还在于提供一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志 物的引物的食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒。 0015 本发明所采用的技术方案还在于提供一种与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物的引物的食管癌术后早期复发及预后辅助诊断试剂盒。 0016 利用本试剂盒中提供的试剂， 结合常用的 RNA 提取试剂和通用的 miRNA 逆转录试 剂， 可以特异地检测组织中 has-miR-198 的表达量， 有效地用于临床食管癌的辅助诊断。 0017 本发明 has-miR-198 的筛选方法， 包括以下步骤 。
14、： 0018 1、 选择相同病理分期、 同一术者、 相同术式、 相同术后治疗方案却有着截然不同预 后结果的典型样本， 同时选取病理分期相同距离肿瘤组织边缘 8cm 以外的正常食管粘膜作 为对照品 ； 0019 2、 提取样本和对照品的 RNA ； 0020 3、 对总 RNA 通过逆转录得到 cDNA ； 0021 4、 cDNA 进行预扩增 ； 0022 5、 将预扩增产物进行实时荧光 RT-PCR 扩增， 筛选表达存在明显差异的 miRNA， 进 行 miRNA 的表达统计分析， 筛选得到与食管癌术后早期复发及预后相关的 miRNA 标志物。 0023 本发明选取食管癌术后复发时间及预后差。
15、异较大的肿瘤样本及其正常食管组织 作为对照， 通过提取RNA， 逆转录、 实时荧光定量RT-PCR筛选表达存在明显差异的miRNA， 进 说 明 书 CN 103173450 A 4 3/10 页 5 行miRNA的表达统计分析， 筛选得到has-miR-198。 本发明方法简单、 操作方便， 筛选得到的 has-miR-198 可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险， 推动了食管癌诊治方面的发展。 0024 采用本发明制备的 miRNA 试剂盒， 不仅稳定， 检测方便， 且定量准确， 大大提高疾 病诊断的敏感性和特异性， 将此试剂盒投入实践， 可以帮助诊断和更有效的个体化治疗。 附图说明 00。
16、25 图 1 为 has-miR-198 在病理分期相同而预后差异食管癌患者表达 RT-PCR 扩增曲 线 ； 0026 图 2 为 has-miR-198 表达量与食管癌预后的危险度评分方法分析图。 具体实施方式 0027 实施例 0028 1、 样本的选择 0029 选取新乡医学院第一附属医院 2006-2007 年收治的病理分期相同， 预后生存明显 差异的2例石蜡标本， 这2例标本均为原发病灶的首次手术切除肿瘤样本制作的石蜡标本。 同时分别选取距离此 2 例石蜡样本肿瘤组织边缘 8cm 以外的正常食管粘膜作为对照。2 例 病例， 术前经全身物理体格检查及影像学诊断无远处转移， 术前未接受。
17、放射治疗或化学治 疗等， 均采用食管癌切除 + 胸腹二野淋巴结清扫术， 颈部手工吻合， 术后化疗 2 次， 术后病 理学检查提示食管中段高分化鳞癌， 溃疡型， 侵及外膜， 无淋巴结转移， 根据国际抗癌联盟 （UICC） 2002年第六版分期标准， 2例均为T3N0M0， 临床分期为a期， 但预后存在明显差异， 一例术后 5 年仍健在， 一例术后 4 个月颈部淋巴结转移， 1 年死亡。 0030 2、 提取 RNA 0031 1） 采用 Trizol 一步法提取石蜡包埋组织微切割肿瘤细胞中的总 RNA， 操作按照 RNA 提取试剂盒 (Invitrogen， USA) 说明进行。 0032 2）。
18、回收总 RNA， 操作按照 Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit TRIZOL REAGENT（Ambion， USA） 的说明书进行。 0033 3） 采用分管光度计分别测定波长 230， 260， 280nm 处的光吸收度值， 确定总 RNA 的 纯度和浓度。 0034 4） 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 样品中 28s 和 18s 的比例， 鉴定其纯度和 完整性。 0035 3、 Megaplex 逆转录 0036 a） Megaplex 逆转录体系如表 1 所示。 0037 表 1Megaplex 逆转录体系 0038 组分加。
19、入量 逆转录引物 (10)0.8L dNTPs with dTTP(100mM)0.2L 说 明 书 CN 103173450 A 5 4/10 页 6 MultiScribeTM逆转录酶 (50U/L)1.5L 10 逆转录缓冲液0.8L MgCl2(25mM)0.9L RNA 酶抑制剂 (20U/L)0.1L 无核酸酶水0.2L 总体积4.5L 0039 将逆转录体系颠倒 6 次混匀， 稍离心 ； 再加入 3L 总 RNA 到反应管中， 颠倒 6 次混 匀离心， 冰上放置 5min。 0040 b） 逆转录反应条件如表 2 所示。 0041 表 2 逆转录反应条件 0042 0043 反应。
20、完成后， 将逆转录产物置于冰上备用。 0044 4、 预扩增 0045 1） PCR 反应体系如表 3 所示。 0046 表 3PCR 反应体系 0047 0048 将反应体系颠倒 6 次， 稍离心， 冰上放置 5min。 0049 2） PCR 反应条件如表 4 所示。 0050 表 4PCR 反应条件 说 明 书 CN 103173450 A 6 5/10 页 7 0051 0052 在表 4 的反应管中加入 0.1TE（pH8.0） 75L， 颠倒 6 次混匀， 20保存。 0053 5、 实时荧光定量 RT-PCR 0054 1） 漩涡混匀通用 PCR 预混 PCR 反应液。 0055。
21、 2） PCR 反应体系如表 5 所示。 0056 表 5PCR 反应体系 0057 0058 将表 5 的反应体系颠倒 6 次混匀， 离心。 0059 3） 在 Taqman MicroRNA Array 的每个孔中加 100L PCR 反应混合液， 1200rpm 离 心 2 次， 每次 1min。 0060 4） PCR 扩增程序如表 6 所示。 0061 表 6PCR 扩增程序 0062 0063 6、 实时荧光定量 RT-PCR 结果分析 0064 以 U6snRNA 管家基因作为内参， 采用相对定量法， 计算基因的表达量。 0065 基因的表达量 F=2 ct 说 明 书 CN 1。
22、03173450 A 7 6/10 页 8 0066 F 值越大表达量越高。其中， ct=（待测样品的目的基因的 ct 的平均值待 测样本的管家基因的 ct 的平均值）（对照样品的目的基因的 ct 的平均值对照样本的 管家基因的 ct 的平均值） 。 0067 对在三个样品中均检测到 miRNA 表达， 且 ct 值在 10-28 之间的 miRNA 标志物进行 分析。结果发现， has-miR-198 的基因表达量在 2 例样本中的基因表达量存在明显差异。与 食管癌术后1年死亡、 预后较差的样本相比， has-miR-198在食管癌术后5年健在、 预后较好 的标本中表达量为 1.322335。
23、994， 在预后较差的样本中表达量 6.540881502， 下调 4.946495 倍。 0068 实验例 1、 has-miR-198 在分期相同而预后差异食管癌患者表达差异的验证 0069 1、 样本的选择 0070 选取新乡医学院第一附属医院 2006-2009 年收治的病理分期相同， 预后生存明显 差异的 46 例石蜡标本， 均为原发病灶的首次手术切除肿瘤样本制作的石蜡标本 ； 术前经全 身物理体格检查机影像学诊断无远处转移， 术前未接受放射治疗或化学治疗等。其中 18 例 为术后 5 年健在、 预后较好的食管癌标本， 28 例为术后 1 年内早期复发、 预后较差的食管癌 标本， 患。
24、者资料见表7。 同时选取病理分期相同距离肿瘤组织边缘8cm以外的正常食管粘膜 作为对照。 0071 表 746 例食管癌患者临床资料 0072 说 明 书 CN 103173450 A 8 7/10 页 9 0073 2、 提取 RNA 0074 提取方法同实施例 1 中的提取方法。 0075 3、 Megaplex 逆转录 0076 逆转录引物根据 miRBaSe 数据库中获得 has-miR-198 成熟序列 （MIMAT0000228） ： 5 -GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC-3设计， 如下 ： 0077 逆转录引物 1 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGT。
25、CGGCAATTCAGTTGAGGAACCT-3（SEQ ID NO:1） 0078 逆转录引物 2 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAACCTA-3（SEQ ID NO:2） 说 明 书 CN 103173450 A 9 8/10 页 10 0079 逆转录引物 3 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAACCTAT-3 （SEQ ID NO:3） 0080 U6snRNA 反向引物 ： 5 -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 0081 逆转录反应体系 （20L） ： 5prime。
26、r buffer4L， 逆转录酶 1L， 逆转录引物 1 （10M） 0.5L， U6snRNA 反向引物 （10M） 0.5L， RNA1g， 加无 RNA 酶水补至 20L 体 系。 0082 逆转录反应条件 ： 42温育 15min， 85灭活逆转录酶 5s， 4保存。 0083 逆转录引物 2、 3 同逆转录 1 进行逆转录反应。 0084 4、 实时荧光定量 RT-PCR 0085 根 据 miRBaSe 数 据 库 中 获 得 has-miR-198 成 熟 序 列 （MIMAT0000228） ： 5 -GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC-3设计实时荧光定量 RT-PC。
27、R 的引物， 如下 ： 0086 正向引物 1 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGGGTCCAGAGGGGAGAT-3（SEQ ID NO:4） 0087 正向引物 2 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGGGTCCAGAGGGGAGATA-3（SEQ ID NO:5） 0088 通用反向引物 ： 5 -TGGTGTCGTGGAGTCG-3（SEQ ID NO:6） 0089 荧光定量 RT-PCR 的反应体系 （20L） ： 2SYBR Green PCR Master Mix10L， 模 板 cDNA1L， 正向引物和反向引物 （10M） 各 0.5L， 双蒸水定容至 20L。实时荧。
28、光定量 检测时， 正向引物 1、 2 分别与通用反向引物进行 PCR 扩增。模板 cDNA 为逆转录引物 1、 2、 3 逆转录产生。 0090 反应条件为 ： 95变性 1min， 95 30s， 65 1min， 40 个循环， 循环结束后从 55 开始每 10s 上升 0.5， 取荧光值绘制溶解曲线， 确定扩增产物的特异性。 0091 RT-PCR 扩增曲线见图 1。 0092 5、 has-miR-198 表达量统计分析 0093 以 U6snRNA 管家基因作为内参， 采用相对定量法， 计算基因的表达量。 0094 基因的表达量 F=2 ct 0095 F 值越大表达量越高。其中， 。
29、ct=（待测样品的目的基因的 ct 的平均值待 测样本的管家基因的 ct 的平均值）（对照样品的目的基因的 ct 的平均值对照样本的 管家基因的 ct 的平均值） 。 0096 结果显示， 与食管癌术后早期复发、 预后较差的样本相比， has-miR-198 在食管癌 术后5年健在、 预后较好的标本下调， 分析结果显示在预后较好的样本中has-miR-198表达 量为 1.5951.718， 在预后较差的样本中表达量 6.5846.109， 下调 4.1278 倍， 差异具有 统计学意义 （P0.05） ， 如表 8 所示。 0097 表 8has-miR-198 在相同 TNM 分期食管癌标。
30、本表达量分析结果 0098 0099 实验例 2、 has-miR-198 表达量与食管癌术后早期复发及预后的危险度评分方法 分析 说 明 书 CN 103173450 A 10 9/10 页 11 0100 采用 Kaplan-Meier 对 has-miR-198 表达量与生存时间进行关联性分析， 如图 2 所 示。分析结果显示 has-miR-198 表达量与生存时间具有显著相关性 （p=0.003） 。 0101 对食管癌病人预后情况、 性别、 年龄、 TNM 分期、 术后 T、 N0-N1 期、 肿瘤大小、 分化 程度和 has-miR-198 表达量进行 Cox 单因素相关危险性分。
31、析， 结果如表 9 所示。结果显示 病人预后情况 （P=0.000） 、 术后 T（p=0.023） 、 肿瘤大小 （p=0.020） 和 has-miR-198 表达量 (p=0.007) 与病人的生存时间有显著相关性。 0102 表 9has-miR-198 表达量与食管癌术后早期复发及预后的危险度评分方法单因素 分析 0103 0104 将上述相关的危险因素纳入 Cox 多因素模型进行分析， 结果如表 10 所示。结果显 示只有病人预后 （p=0.014） 、 肿瘤大小 （p=0.049） 和 has-miR-198 表达量 （p=0.012） 与其生 存时间均有显著相关性， 其相关危险。
32、度分别为 7.268、 1.246 和 3.524。 0105 表 10has-miR-198 表达量与食管癌术后早期复发及预后的危险度评分方法多因 素分析 0106 0107 应用实施例、 miRNA 试剂盒 说 明 书 CN 103173450 A 11 10/10 页 12 0108 miRNA 试剂盒包括 has-miR-198 引物 （如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示） 、 聚合酶链反应试剂 （包括热启动 Taq DNA 聚合酶 (2.5U/L) 及其反应缓冲液、 dNTP(10mM)） 、 U6snRNA 内参引物和荧光染料 S。
33、YBR-Green1。利用本发明的试剂盒， 结合常用 的 RNA 提取试剂和通用的 miRNA 逆转录试剂， 可以特异地检测组织中 has-miR-198 的表达 量， 有效地用于临床食管癌的辅助诊断。 0109 miRNA 试剂盒的效果检测 ： 0110 选取新乡医学院第一附属医院 2008-2011 年 20 例预后较好的食管癌病人及 18 例 预后较差的食管癌病人， 对其石蜡标本进行了miRNA提取， 利用本发明miRNA试剂盒对样本 进行分析， 结果显示本发明 miRNA 试剂盒能够特异、 有效地扩增出 has-miR-198 序列， 对其 表达量进行统计分析， 结果显示预后较好的标本。
34、中 has-miR-198 表达量为 1.6232.615， 预后较差的样本中 has-miR-198 表达量为 6.2082.321， has-miR-198 的表达量下调 3.82 倍 （P0.05） 。检测的 20 例预后较好的食管癌病人 has-miR-198 表达量有 20 例均比预后较 差的表达量明显下降， 敏感性为 100.0%。 说 明 书 CN 103173450 A 12 1/2 页 13 0001 序 列 表 CN 103173450 A 13 2/2 页 14 0002 序 列 表 CN 103173450 A 14 1/1 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173450 A 15 。