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1、(10)申请公布号 CN 104324707 A (43)申请公布日 2015.02.04 C N 1 0 4 3 2 4 7 0 7 A (21)申请号 201410471342.1 (22)申请日 2014.09.16 B01J 20/288(2006.01) B01J 20/283(2006.01) B01J 20/30(2006.01) (71)申请人华东理工大学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路130号 (72)发明人褚长虎 殷伟 柴惠惠 程玲平 郭瑞强 刘仁华 (74)专利代理机构上海翼胜专利商标事务所 (普通合伙) 31218 代理人翟羽 曾人泉 (54) 发明名称 氨基二。
2、酸亲水色谱固定相及其制备方法 (57) 摘要 本发明氨基二酸亲水色谱固定相，其结构为： ；其制备方 法包括：硅胶表面引入末端炔基：在有机溶 剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺；加入活化的微 球型硅胶；反应、过滤、洗涤，得到固体物；真 空干燥得到末端炔基硅胶；用“链接化学”键合 氨基二酸亲水色谱固定相：制备硅胶上炔基； 加入修饰有叠氮基团的氨基二酸及催化剂； 反应、过滤、洗涤，得到固体物；真空干燥得到 氨基二酸亲水色谱固定相。本发明采用“点击化 学”作为键合反应方法，可在温和条件下实现高选 择性和高转化率的固载，制备过程简单，每个中间 体结构明确；制备的氨基二酸亲水色谱固定相作 为极性固定相在亲水作用液。
3、相色谱模式下能对强 极性化合物进行高效分离。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104324707 A CN 104324707 A 1/2页 2 1.一种氨基二酸亲水色谱固定相，其特征在于，其结构为： 。 2.一种如权利要求1所述的氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法，使用“点击化学”为 键合方法键合氨基二酸分子，包括以下步骤： （1）硅胶表面引入末端炔基 在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为1 5:1.25，每克硅胶。
4、所需有机溶剂的量为530mL，于60150条件下反应636小时； 加入活化的微球型硅胶，每克微球型硅胶所需的硅烷偶联剂为110mmol； 在80120条件下继续反应1248小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用二氯 甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体物； 将步骤（1）得到的固体物置于真空干燥箱中在4080条件下干燥612小 时，得到末端炔基硅胶； 其特征在于： （2）用“链接化学”键合氨基二酸亲水色谱固定相 将步骤（1）得到的末端炔基硅胶加入体积比为2101的水与甲醇的混合溶 剂中，每克炔基硅胶所需水与甲醇混合溶剂的量为2050mL，得到硅胶上炔基； 加入修饰有叠氮基团的氨基二酸及催化剂：修饰有叠氮基。
5、团的氨基二酸加入的摩 尔剂量为步骤（2）得到的硅胶上炔基的摩尔剂量的115倍；所述催化剂为二价铜与抗 坏血酸钠的混合物或者一价铜盐，所述催化剂的摩尔剂量分别为所述硅胶上炔基的摩尔剂 量：二价铜110%与抗坏血酸钠240%混合，或者为一价铜盐1%-10%； 在1080条件下反应72120小时，然后用砂芯漏斗过滤，依次用水、重量浓度 为220%的EDTA二钠水溶液、水、甲醇和丙酮洗涤，得到固体物； 将步骤（2）得到的固体物置于真空干燥箱中在4080条件下干燥612小 时，得到目标产物氨基二酸亲水色谱固定相； 所述步骤（2）的反应式为： ， 式中，R的结构是： 。 权 利 要 求 书CN 10432。
6、4707 A 2/2页 3 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）采用的有机溶剂为 N,N-二甲基甲酰胺。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）采用的硅烷偶联剂的结构 为： ， 其反应式为： 。 5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所使用的微球型硅胶为粒 径和孔径均匀的全多孔硅胶球状体，其粒径为540m，孔径为60300。 6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）加入的修饰有叠氮基团的 氨基二酸的结构为： ； 叠氮氨基二酸的合成步骤为： 。 权 利 要 求 书CN 104324707 A 1/7页 4 氨基二酸亲水色谱固。
7、定相及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及液相色谱固定相技术，具体的说，是一种使用“点击化学”（Click chemistry）作为键合方法键合的氨基二酸亲水色谱固定相及其制备方法。 技术背景 0002 亲水作用色谱（HILIC）是近年来发展起来的用于分离强极性组分的色谱技术，是 一种以极性固定相（如硅胶或硅胶表面的结构修饰）以及含高浓度极性有机溶剂和低浓度 水溶液为流动相的色谱模式。亲水作用色谱解决了传统反相色谱疏水性固定相（如C18、C8 等）对强极性化合物（如核苷、头孢、培南等）保留很弱，甚至无保留的问题。亲水作用色谱 用于分离极性化合物（如氨基酸、肽和糖等）已有文献报道。亲水作用。
8、色谱的固定相依然是 使用正相固定相，主要是直接使用硅胶、氨基、酰胺基、二醇基、糖类等作为固定相，但是，不 同类型的固定相存在着不同的保留机制和分离性能，其中，有些类型的固定相存在一些较 大的缺点，例如：硅胶柱容易发生不可逆吸附现象；氨基柱会与糖类生成Schiff碱；从而影 响分离。目前，专门为亲水作用色谱开发的固定相刚刚起步，能商品化的亲水作用色谱固定 相种类较少，因而需要开发其他类型的固定相来满足亲水作用色谱的发展要求。 0003 “点击化学”（Click chemistry），也有译为“链接化学”、“动态组合化学”或“速 配接合组合式化学”，是由化学家巴里夏普莱斯（K.B.Sharples。
9、s）等人提出的一个合成概 念，其核心是：用少量简单可靠和高选择性的化学转变来获得更广泛的分子多样性。“点击 化学”开创了快速、有效、甚至是100%可靠的、高选择性地制造各类新化合物的合成化学新 领域，其中，最为广泛应用的反应是Huisgen 1,3-diploar cycloaddition反应，它在色谱 固定相的合成上发挥了非常重要的作用，其反应式为： 。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种氨基二酸亲水色谱固定相，采 用氨基二酸作为极性功能基团，其性质十分稳定，其表面结构不会因为pH的变化而发生变 化，也不容易与溶质分子发生反应；作为极性固定相在亲水作用液相色谱。
10、模式下能够实现 对强极性化合物的高效分离。本发明第二个目的是，提供所述亲水色谱固定相的制备方法， 采用“点击化学”作为键合反应方法，可在温和条件下实现高选择性和高转化率的固载；制 备过程简单，每个中间体结构明确，能有效制备所述亲水色谱固定相。 0005 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。 0006 一种氨基二酸亲水色谱固定相，其特征是，其结构为： 说 明 书CN 104324707 A 2/7页 5 。 0007 一种氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法，使用“点击化学”为键合方法键合氨 基二酸分子，包括以下步骤： （1）硅胶表面引入末端炔基 在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂。
11、与丙炔胺的摩尔比为1 5:1.25，每克硅胶所需有机溶剂的量为530mL，于60150条件下反应636小 时； 加入活化的微球型硅胶，每克微球型硅胶所需的硅烷偶联剂为110mmol； 在80120条件下继续反应1248小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用二氯甲 烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体物； 将步骤（1）得到的固体物置于真空干燥箱中在4080条件下干燥612小 时，得到末端炔基硅胶； 其特征是： （2）用“链接化学”键合氨基二酸亲水色谱固定相 将步骤（1）得到的末端炔基硅胶加入体积比为2101的水与甲醇的混合溶 剂中，每克炔基硅胶所需水与甲醇混合溶剂的量为2050mL，得到硅胶上炔基； 加入修。
12、饰有叠氮基团的氨基二酸及催化剂：修饰有叠氮基团的氨基二酸（叠氮氨基 二酸）加入的摩尔剂量为步骤（2）得到的硅胶上炔基的摩尔剂量的115倍；所述的催化 剂为二价铜与抗坏血酸钠的混合物或者一价铜盐，所述催化剂的摩尔剂量分别为所述硅胶 上炔基的摩尔剂量：二价铜110%与抗坏血酸钠240%混合，或者为一价铜盐1%-10%； 在1080条件下反应72120小时，然后用砂芯漏斗过滤，依次用水、重量浓度 为220%的EDTA二钠水溶液、水、甲醇和丙酮洗涤，得到固体物； 将步骤（2）得到的固体物置于真空干燥箱中在4080条件下干燥612小 时，得到目标产物氨基二酸亲水色谱固定相； 所述步骤（2）的反应式为： 。
13、， 式中，R的结构是： 。 0008 可选的，步骤（1）采用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。 说 明 书CN 104324707 A 3/7页 6 0009 进一步，步骤（1）采用的硅烷偶联剂的结构为： ， 其反应式为： 。 0010 可选的，步骤（1）所使用的微球型硅胶为粒径和孔径均匀的全多孔硅胶球状体， 其粒径为540m，孔径为60300。 0011 进一步，步骤（2）加入的修饰有叠氮基团的氨基二酸（叠氮氨基二酸）的结构 为： ； 所述叠氮氨基二酸的合成步骤为： 0012 本发明的积极效果是： （1）本发明的氨基二酸亲水色谱固定相采用氨基二酸作为极性功能基团，其性质十分 稳定，其表面结构。
14、不会因为pH的变化而发生变化，也不容易与溶质分子发生反应；本发明 的氨基二酸亲水色谱固定相作为极性固定相在亲水作用液相色谱模式下能对强极性化合 物进行高效分离。 0013 （2）本发明的氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法，采用“点击化学”作为键合反 应方法，可在温和条件下实现高选择性和高转化率的固载；其制备过程简单，每个中间体结 构明确，能有效制备所述亲水色谱固定相。 。 说 明 书CN 104324707 A 4/7页 7 0014 （3）本发明对开发亲水色谱固定相具有积极作用，对亲水色谱固定相的商品化过 程具有很重要的意义。在分离一些头孢和培南等抗生素方面具有广阔的应用前景。 附图说明 00。
15、15 图1为本发明氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法的流程框图。 0016 图2为实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装柱用于核苷分离的色谱图。 0017 图3为实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装柱用于小分子酸分离的色谱 图。 0018 图4为实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装柱用于小分子碱分离的色谱 图。 0019 图5为实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装柱用于头孢分离的色谱图。 0020 图6为实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装柱用于培南分离的色谱图。 具体实施方式 0021 以下结合附图给出本发明的具体实施方式。提供3个实施例。但是需要指出，本 发明的实施不限于以下的实施方。
16、式。 0022 实施例1 一种氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法，使用“点击化学”为键合方法键合氨基二酸 分子，包括以下步骤（参见图1）： （1）硅胶表面引入末端炔基 在500ml三口烧瓶中加入无水N,N-二甲基甲酰胺100ml， 3-异氰酸丙基三乙氧基 硅烷35mmol（约8.66m1），丙炔胺42mmol（约2.88mL），85下反应12小时。 0023 加入粒径为540m、孔径为60300的、粒径和孔径均匀的全多孔硅胶球 状体（注：系购买的定型产品）10g。 0024 在110下继续反应31小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用二氯甲烷300mL、 甲醇500mL和丙酮250mL洗涤，得到固体。
17、物。 0025 将步骤（1）得到的固体物置于真空干燥箱中在60条件下干燥7小时，得到 末端炔基硅胶。 0026 （2）利用“链接化学”制备氨基二酸亲水色谱固定相 将步骤（1）得到的末端炔基硅胶加入体积比为51的水与甲醇的混合溶剂中， 每克末端炔基硅胶所需水与甲醇混合溶剂的量为40mL，得到硅胶上炔基。 0027 加入修饰有叠氮基团的氨基二酸及催化剂二价铜与抗坏血酸钠混合物，或者一 价铜盐催化剂。 0028 加入的叠氮氨基二酸的制备方法为： 于250mL单口瓶中加入亚氨基二乙酸5g、甲醇100mL，冰水浴下逐滴加入氯化亚砜 （2.2equiv），滴完后室温下搅拌3小时，旋蒸除去溶剂和氯化亚砜，得。
18、到7.4g亚氨基二乙酸 二甲酯盐酸盐2，收率为100%。 0029 于250mL单口瓶中加入亚氨基二乙酸二甲酯盐酸盐5g、对硝基氯苄（1equiv） 4.4g、碳酸钾（2.5equiv）8.8g、DMSO 90mL，50下搅拌8小时；将反应液冷却，加入水50mL， 说 明 书CN 104324707 A 5/7页 8 EA萃取（30mL3），有机相合并，水洗涤（30mL2），旋蒸过柱（PE:EA=8:1）得到5.4g淡黄 色固体3，收率为72%。 0030 于100mL单口瓶中加入对硝基氨基二酸甲酯5g、甲醇50mL和Raney Ni 0.5g， 在氢气氛围下，室温下搅拌10小时，TLC检测反。
19、应完全，抽滤、旋蒸，得到4.2g油状化合物 物4，收率为93%。 0031 于250mL单孔瓶中加入8.4g油状化合物物4、五水硫酸铜（0.01equiv）0.08g、 碳酸钾（3equiv）13.1g和甲醇90mL，搅拌冰浴降温，冰水浴下分批加入叠氮磺酰咪唑盐酸 盐（1.5equiv）9.9g，加完后室温下搅拌10小时，TLC检测反应，抽滤旋蒸过柱（PE:EA=6:1） 得到6.5g棕色油状化合物5，收率71%。 0032 于250mL单口瓶中加入6.5g棕色油状化合物5、氢氧化钠（4.2equiv）3.7g和 甲醇50mL，室温下搅拌5小时，得到叠氮氨基二酸6。TLC检测反应完全，旋蒸少量。
20、反应液进 行检测，其余直接用冰醋酸酸化至pH67。 0033 所述叠氮氨基二酸加入的摩尔剂量为步骤（2）得到的硅胶上炔基的摩尔剂量的 2倍。 0034 取抗坏血酸钠0.44g用5mL水溶解，取五水硫酸铜0.28g也用5mL水溶解；将五水 硫酸铜溶液滴加至抗坏血酸钠溶液中，再将混合溶液滴加至上述叠氮氨基二酸体系中，缓 慢搅拌下加入3.4g步骤（2）得到的硅胶上炔基。 0035 在40条件下搅拌反应72小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用甲醇300mL、 10% EDTA溶液500mL、50的水300mL、甲醇200mL、THF 200mL、乙腈200mL和二氯甲烷 200mL洗涤，得到固体物。 0。
21、036 将步骤（2）得到的固体物置于真空干燥箱中在50条件下干燥10小时，得 到目标产物氨基二酸亲水色谱固定相，其结构为： 。 0037 对实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装柱进行色谱评价 将实施例1制备的氨基二酸亲水色谱固定相装填于4.6mm150mm的不锈钢HPLC色谱 柱中，将制得的色谱柱在亲水色谱模式下用于测试强极性化合物的保留和分离混合样品。 0038 （1）用于核苷的分离 将乙腈水作为流动相，乙腈与水的体积比为8020，流速1mLmin，柱温为35， 检测波长为254nm，其色谱图参见图2（图中：1为磺胺嘧啶、2为尿嘧啶、3为尿苷、4为腺苷、 5为肌苷、6为腺嘌呤、7为鸟苷）。。
22、 0039 分离结果显示：在用本发明氨基二酸亲水色谱固定相制得的色谱柱上，反相色谱 柱死时间流出的强极性化合物尿嘧啶得到了很好的保留，并且，其他核苷也得到了很好的 基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。 0040 （2）用于小分子酸的分离 将乙腈水作为流动相，乙腈与水的体积比为955，流速1mLmin，柱温为35，检 测波长为254nm，其色谱图参见图3（图中：1为山梨酸、2为对氨基苯甲酸、3为对羟基苯甲 说 明 书CN 104324707 A 6/7页 9 酸、4为3,4-二羟基苯甲酸）。 0041 分离结果显示：在用本发明氨基二酸亲水色谱固定相制得的色谱柱上，几个小分 。
23、子酸得到了很好的基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。 0042 （3）用于小分子碱的分离 将乙腈水作为流动相，乙腈与水的体积比为955，流速1mLmin，柱温为35， 检测波长为254nm，其色谱图参见图4（图中：1为咖啡因、2为可可碱、3为茶碱、4二羟丙茶 碱、5为槲皮素）。 0043 分离结果显示：在用本发明氨基二酸亲水色谱固定相制得的色谱柱上，几个小分 子碱得到了很好的基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。 0044 （4）用于头孢的分离 将乙腈10mM甲酸铵作为流动相，乙腈与甲酸铵的体积比为8020，流速1mLmin， 柱温为35，检测波长为2。
24、54nm，其色谱图参见图5（图中：1为头孢孟多酯钠、2为头孢替唑 钠、3为头孢地嗪钠、4为头孢地尔硫卓、5为盐酸头孢替安、6为头孢他啶钠、7为盐酸头孢吡 肟、8为头孢拉定）。 0045 分离结果显示：在用本发明氨基二酸亲水色谱固定相制得的色谱柱上，几个头孢 得到了较好的分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。 0046 （5）用于培南的分离 将乙腈10mM甲酸铵（pH4.5）作为流动相，乙腈与甲酸铵的体积比为7525，流速 1mLmin，柱温为35，检测波长为254nm，其色谱图参见图6（图中：1为比阿培南、2为美 罗培南、3为多尼培南）。 0047 分离结果显示：在用本发明氨基。
25、二酸亲水色谱固定相制得的色谱柱上，几个培南 得到了很好的基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。 0048 （6）评价结果 经过对核苷、小分子酸、小分子碱、头孢和培南的分离，采用本发明氨基二酸亲水色谱 固定相制得的色谱柱表现出了典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。 0049 实施例2 一种氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法，使用“点击化学”为键合方法键合氨基二酸 分子，包括以下步骤： （1）硅胶表面引入末端炔基 在500ml三口烧瓶中加入无水N,N-二甲基甲酰胺100ml、3-异氰酸丙基三乙氧基硅 烷35mmol（约8.66m1）、丙炔胺70mmol（约3.63mL），6。
26、0下反应36小时。 0050 （同实施例1）。 0051 在80下继续反应48小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用二氯甲烷300mL、甲 醇500mL和丙酮250mL洗涤，得到固体物。 0052 将步骤（1）得到的固体物置于真空干燥箱中在40条件下干燥12小时，得到 末端炔基硅胶。 0053 （2）利用“链接化学”制备氨基二酸亲水色谱固定相 将步骤（1）得到的末端炔基硅胶加入体积比为8:1的水与甲醇的混合溶剂中，每 克末端炔基硅胶所需水与甲醇混合溶剂的量为40mL，得到末端炔基硅胶。 说 明 书CN 104324707 A 7/7页 10 0054 加入修饰有叠氮基团的氨基二酸及催化剂二价铜与抗。
27、坏血酸钠。 0055 叠氮氨基二酸加入的摩尔剂量为步骤（2）得到的硅胶上炔基的摩尔剂量的1 倍。 0056 取抗坏血酸钠（0.1equiv）0.44g用5mL水溶解，取五水硫酸铜0.28g也用5mL水 溶解；将五水硫酸铜溶液滴加至抗坏血酸钠溶液中，再将混合溶液滴加至上述叠氮氨基二 酸，缓慢搅拌下加入6.8g步骤（2）得到的硅胶上炔基。 0057 在10条件下搅拌反应120小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用甲醇300mL、 2% EDTA溶液500mL、50的水300mL、甲醇200mL、THF200mL、乙腈200mL和二氯甲烷200mL 洗涤，得到固体物。 0058 将步骤（2）得到的固体物。
28、置于真空干燥箱中在40条件下干燥6小时，得到 目标产物氨基二酸亲水色谱固定相。 0059 实施例3 一种氨基二酸亲水色谱固定相的制备方法，使用“点击化学”为键合方法键合氨基二酸 分子，包括以下步骤： （1）硅胶表面引入末端炔基 在500ml三口烧瓶中加入无水N,N-二甲基甲酰胺100ml、3-异氰酸丙基三乙氧基硅 烷35mmol（约8.66m1）、丙炔胺42mmol（约2.88mL），150下反应6小时。 0060 （同实施例1）。 0061 在120下继续反应12小时，然后用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷300mL、甲 醇500mL和丙酮250mL洗涤，得到固体物。 0062 将步骤（1）得到。
29、的固体物置于真空干燥箱中在80条件下干燥6小时，得到 末端炔基硅胶。 0063 （2）利用“链接化学”制备氨基二酸亲水色谱固定相 将步骤（1）得到的末端炔基硅胶加入体积比为10:1的水与甲醇的混合溶剂中， 每克末端炔基硅胶所需水与甲醇混合溶剂的量为50mL，得到末端炔基硅胶。 0064 加入修饰有叠氮基团的氨基二酸及催化剂二价铜与抗坏血酸钠。 0065 叠氮氨基二酸加入的摩尔剂量为步骤（2）得到的硅胶上炔基的摩尔剂量的15 倍。 0066 取抗坏血酸钠（0.1equiv）0.44g用5mL水溶解，取五水硫酸铜0.28g也用5mL水 溶解；将五水硫酸铜溶液滴加至抗坏血酸钠溶液中，再将混合溶液滴加。
30、至上述叠氮氨基二 酸体系中，缓慢搅拌下加入0.5g步骤（2）得到的硅胶上炔基。 0067 在80条件下搅拌反应120小时，然后用砂芯漏斗过滤，再依次用甲醇300mL、 20% EDTA溶液500mL、50的水300mL、甲醇200mL、THF200mL、乙腈200mL和二氯甲烷200mL 洗涤，得到固体物。 0068 将步骤（2）得到的固体物置于真空干燥箱中在80条件下干燥12小时，得 到目标产物氨基二酸亲水色谱固定相。 说 明 书CN 104324707 A 10 1/4页 11 图1 说 明 书 附 图CN 104324707 A 11 2/4页 12 图2 图3 说 明 书 附 图CN 104324707 A 12 3/4页 13 图4 图5 说 明 书 附 图CN 104324707 A 13 4/4页 14 图6 说 明 书 附 图CN 104324707 A 14 。