结合CSF1R的抗体.pdf

提供了结合CSF1R的抗体。还提供了能够形成结合CSF1R的抗体的抗体重链和轻链。提供了编码针对CSF1R的抗体的多核苷酸。还提供了编码抗体重链和轻链的多核苷酸。提供了使用针对CSF1R的抗体的治疗方法。这些方法包括但不限于治疗类风湿性关节炎、骨质缺失和多发性硬化症的方法。

权利要求书
1.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述重链包含与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％同一性的序列，并且其中所述抗体与集落刺激因子1受体(CSF1R)结合。

2.   如权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含与选自SEQ IDNO：9、11、13和39至45的序列具有至少95％同一性的序列。

3.   如权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含与选自SEQ IDNO：9、11、13和39至45的序列具有至少97％同一性的序列。

4.   如权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含与选自SEQ IDNO：9、11、13和39至45的序列具有至少99％同一性的序列。

5.   如权利要求1所述的抗体，其中所述重链包含选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列。

6.   如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％同一性的序列。

7.   如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少95％同一性的序列。

8.   如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少97％同一性的序列。

9.   如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少99％同一性的序列。

10.   如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列。

11.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％同一性的序列，并且其中所述抗体与集落刺激因子1受体(CSF1R)结合。

12.   如权利要求11所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少95％同一性的序列。

13.   如权利要求11所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少97％同一性的序列。

14.   如权利要求11所述的抗体，其中所述轻链包含与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少99％同一性的序列。

15.   如权利要求11所述的抗体，其中所述轻链包含选自SEQ IDNO：10、12、14和46至52的序列。

16.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述重链包含：(i)包含选自SEQ ID NO：15、21和27的序列的重链(HC)CDR1；(ii)包含选自SEQ ID NO：16、22和28的序列的HC CDR2；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：17、23和29的序列的HC CDR3，其中所述抗体与CSF1R结合。

17.   如权利要求16所述的抗体，其中所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：15、16和17；(b)SEQ ID NO：21、22和23；以及(c)SEQ ID NO：27、28和29。

18.   如权利要求16或权利要求17所述的抗体，其中所述轻链包含：(i)包含选自SEQ ID NO：18、24和30的序列的轻链(LC)CDR1；(ii)包含选自SEQ ID NO：19、25和31的序列的LC CDR2；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：20、26和32的序列的LC CDR3。

19.   如权利要求18所述的抗体，其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：18、19和20；(b)SEQ ID NO：24、25和26；以及(c)SEQ ID NO：30、31和32。

20.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述轻链包含：(i)包含选自SEQ ID NO：18、24和30的序列的轻链(LC)CDR1；(ii)包含选自SEQ ID NO：19、25和31的序列的LC CDR2；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：20、26和32的序列的LC CDR3；并且其中所述抗体与CSF1R结合。

21.   如权利要求20所述的抗体，其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：18、19和20；(b)SEQ ID NO：24、25和26；以及(c)SEQ ID NO：30、31和32。

22.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)包含与SEQ ID NO：9具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：10具有至少95％同一性的序列的轻链；
(b)包含与SEQ ID NO：11具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：12具有至少95％同一性的序列的轻链；
(c)包含与SEQ ID NO：13具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：14具有至少95％同一性的序列的轻链；
(d)包含与SEQ ID NO：39具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少95％同一性的序列的轻链；
(e)包含与SEQ ID NO：40具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少95％同一性的序列的轻链；
(f)包含与SEQ ID NO：41具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少95％同一性的序列的轻链；
(g)包含与SEQ ID NO：39具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少95％同一性的序列的轻链；
(h)包含与SEQ ID NO：40具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少95％同一性的序列的轻链；
(i)包含与SEQ ID NO：41具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少95％同一性的序列的轻链；以及
(j)包含与SEQ ID NO：42具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少95％同一性的序列的轻链；
(k)包含与SEQ ID NO：42具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少95％同一性的序列的轻链；
(l)包含与SEQ ID NO：42具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少95％同一性的序列的轻链；
(m)包含与SEQ ID NO：43具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少95％同一性的序列的轻链；
(n)包含与SEQ ID NO：43具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少95％同一性的序列的轻链；
(o)包含与SEQ ID NO：43具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少95％同一性的序列的轻链；
(p)包含与SEQ ID NO：44具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少95％同一性的序列的轻链；
(q)包含与SEQ ID NO：44具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少95％同一性的序列的轻链；
(r)包含与SEQ ID NO：45具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少95％同一性的序列的轻链；或
(s)包含与SEQ ID NO：45具有至少95％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少95％同一性的序列的轻链。

23.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)包含与SEQ ID NO：9具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：10具有至少97％同一性的序列的轻链；
(b)包含与SEQ ID NO：11具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：12具有至少97％同一性的序列的轻链；
(c)包含与SEQ ID NO：13具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：14具有至少97％同一性的序列的轻链；
(d)包含与SEQ ID NO：39具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少97％同一性的序列的轻链；
(e)包含与SEQ ID NO：40具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少97％同一性的序列的轻链；
(f)包含与SEQ ID NO：41具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少97％同一性的序列的轻链；
(g)包含与SEQ ID NO：39具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少97％同一性的序列的轻链；
(h)包含与SEQ ID NO：40具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少97％同一性的序列的轻链；
(i)包含与SEQ ID NO：41具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少97％同一性的序列的轻链；以及
(j)包含与SEQ ID NO：42具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少97％同一性的序列的轻链；
(k)包含与SEQ ID NO：42具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少97％同一性的序列的轻链；
(l)包含与SEQ ID NO：42具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少97％同一性的序列的轻链；
(m)包含与SEQ ID NO：43具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少97％同一性的序列的轻链；
(n)包含与SEQ ID NO：43具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少97％同一性的序列的轻链；
(o)包含与SEQ ID NO：43具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少97％同一性的序列的轻链；
(p)包含与SEQ ID NO：44具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少97％同一性的序列的轻链；
(q)包含与SEQ ID NO：44具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少97％同一性的序列的轻链；
(r)包含与SEQ ID NO：45具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少97％同一性的序列的轻链；或
(s)包含与SEQ ID NO：45具有至少97％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少97％同一性的序列的轻链。

24.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)包含与SEQ ID NO：9具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：10具有至少99％同一性的序列的轻链；
(b)包含与SEQ ID NO：11具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：12具有至少99％同一性的序列的轻链；
(c)包含与SEQ ID NO：13具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：14具有至少99％同一性的序列的轻链；
(d)包含与SEQ ID NO：39具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少99％同一性的序列的轻链；
(e)包含与SEQ ID NO：40具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少99％同一性的序列的轻链；
(f)包含与SEQ ID NO：41具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少99％同一性的序列的轻链；
(g)包含与SEQ ID NO：39具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少99％同一性的序列的轻链；
(h)包含与SEQ ID NO：40具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少99％同一性的序列的轻链；
(i)包含与SEQ ID NO：41具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少99％同一性的序列的轻链；
(j)包含与SEQ ID NO：42具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少99％同一性的序列的轻链；
(k)包含与SEQ ID NO：42具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少99％同一性的序列的轻链；
(l)包含与SEQ ID NO：42具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少99％同一性的序列的轻链；
(m)包含与SEQ ID NO：43具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少99％同一性的序列的轻链；
(n)包含与SEQ ID NO：43具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少99％同一性的序列的轻链；
(o)包含与SEQ ID NO：43具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少99％同一性的序列的轻链；
(p)包含与SEQ ID NO：44具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少99％同一性的序列的轻链；
(q)包含与SEQ ID NO：44具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少99％同一性的序列的轻链；
(r)包含与SEQ ID NO：45具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少99％同一性的序列的轻链；或
(s)包含与SEQ ID NO：45具有至少99％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少99％同一性的序列的轻链。

25.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO：9的序列的重链和包含SEQ ID NO：10的序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO：11的序列的重链和包含SEQ ID NO：12的序列的轻链；
(c)包含SEQ ID NO：13的序列的重链和包含SEQ ID NO：14的序列的轻链；
(d)包含SEQ ID NO：39的序列的重链和包含SEQ ID NO：46的序列的轻链；
(e)包含SEQ ID NO：40的序列的重链和包含SEQ ID NO：46的序列的轻链；
(f)包含SEQ ID NO：41的序列的重链和包含SEQ ID NO：46的序列的轻链；
(g)包含SEQ ID NO：39的序列的重链和包含SEQ ID NO：47的序列的轻链；
(h)包含SEQ ID NO：40的序列的重链和包含SEQ ID NO：47的序列的轻链；
(i)包含SEQ ID NO：41的序列的重链和包含SEQ ID NO：47的序列的轻链；以及
(j)包含SEQ ID NO：42的序列的重链和包含SEQ ID NO：48的序列的轻链；
(k)包含SEQ ID NO：42的序列的重链和包含SEQ ID NO：49的序列的轻链；
(l)包含SEQ ID NO：42的序列的重链和包含SEQ ID NO：50的序列的轻链；
(m)包含SEQ ID NO：43的序列的重链和包含SEQ ID NO：48的序列的轻链；
(n)包含SEQ ID NO：43的序列的重链和包含SEQ ID NO：49的序列的轻链；
(o)包含SEQ ID NO：43的序列的重链和包含SEQ ID NO：50的序列的轻链；
(p)包含SEQ ID NO：44的序列的重链和包含SEQ ID NO：51的序列的轻链；
(q)包含SEQ ID NO：44的序列的重链和包含SEQ ID NO：52的序列的轻链；
(r)包含SEQ ID NO：45的序列的重链和包含SEQ ID NO：51的序列的轻链；或
(s)包含SEQ ID NO：45的序列的重链和包含SEQ ID NO：52的序列的轻链。

26.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)包含具有SEQ ID NO：15的序列的重链(HC)CDR1、具有SEQID NO：16的序列的HC CDR2和具有SEQ ID NO：17的序列的HCCDR3的重链，以及包含具有SEQ ID NO：18的序列的轻链(LC)CDR1、具有SEQ ID NO：19的序列的LC CDR2和具有SEQ IDNO：20的序列的LC CDR3的轻链；
(b)包含具有SEQ ID NO：21的序列的重链(HC)CDR1、具有SEQID NO：22的序列的HC CDR2和具有SEQ ID NO：23的序列的HCCDR3的重链，以及包含具有SEQ ID NO：24的序列的轻链(LC)CDR1、具有SEQ ID NO：25的序列的LC CDR2和具有SEQ IDNO：26的序列的LC CDR3的轻链；或
(c)包含具有SEQ ID NO：27的序列的重链(HC)CDR1、具有SEQID NO：28的序列的HC CDR2和具有SEQ ID NO：29的序列的HCCDR3的重链，以及包含具有SEQ ID NO：30的序列的轻链(LC)CDR1、具有SEQ ID NO：31的序列的LC CDR2和具有SEQ IDNO：32的序列的LC CDR3的轻链。

27.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO：53的序列的重链和包含SEQ ID NO：60的序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO：53的序列的重链和包含SEQ ID NO：61的序列的轻链；或
(c)包含SEQ ID NO：58的序列的重链和包含SEQ ID NO：65的序列的轻链。

28.   一种分离的抗体，包含重链和轻链，其中所述抗体包含：
(a)由SEQ ID NO：53的序列组成的重链和由SEQ ID NO：60的序列组成的轻链；
(b)由SEQ ID NO：53的序列组成的重链和由SEQ ID NO：61的序列组成的轻链；或
(c)由SEQ ID NO：58的序列组成的重链和由SEQ ID NO：65的序列组成的轻链。

29.   如权利要求1至28中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人CSF1R结合。

30.   如权利要求1至29中任一项所述的抗体，其中所述抗体与食蟹猴CSF1R结合。

31.   如权利要求1至30中任一项所述的抗体，其中所述抗体阻断配体与CSF1R结合。

32.   如权利要求1至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体阻断CSF1与CSF1R结合。

33.   如权利要求1至32中任一项所述的抗体，其中所述抗体阻断IL34与CSF1R结合。

34.   如权利要求1至33中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制配体诱导的CSF1R磷酸化。

35.   如权利要求1至34中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制CSF1诱导的CSF1R磷酸化。

36.   如权利要求1至35中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制IL34诱导的CSF1R磷酸化。

37.   如权利要求1至36中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。

38.   如权利要求1至36中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

39.   如权利要求1至38中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自Fab、Fv、scFv、Fab’和(Fab’)2。

40.   如权利要求1至38中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自IgA、IgG和IgD。

41.   如权利要求40所述的抗体，其中所述抗体是IgG。

42.   如权利要求41所述的抗体，其中所述抗体是IgG4。

43.   如权利要求42所述的抗体，其中所述抗体在至少一个IgG4重链恒定区中包含S241P突变。

44.   如权利要求1至43中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于1nM的亲和力(KD)与人CSF1R结合。

45.   如权利要求1至44中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制CSF1或IL34存在下的单核细胞增殖和/或存活反应。

46.   一种药物组合物，包含如权利要求1至45中任一项所述的抗体。

47.   一种分离的核酸，包含编码与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列。

48.   如权利要求47所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少95％同一性。

49.   如权利要求47所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少97％同一性。

50.   如权利要求47所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少99％同一性。

51.   如权利要求47所述的核酸，其中所述氨基酸序列选自SEQID NO：9、11、13和39至45。

52.   如权利要求45至51中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列。

53.   如权利要求52所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少95％同一性。

54.   如权利要求52所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少97％同一性。

55.   如权利要求52所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少99％同一性。

56.   如权利要求52所述的核酸，其中所述氨基酸序列选自SEQID NO：10、12、14和46至52。

57.   一种分离的核酸，包含编码与选自10、12、14和46至52的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列。

58.   如权利要求57所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自10、12、14和46至52的序列具有至少95％同一性。

59.   如权利要求57所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自10、12、14和46至52的序列具有至少97％同一性。

60.   如权利要求57所述的核酸，其中所述氨基酸序列与选自10、12、14和46至52的序列具有至少99％同一性。

61.   如权利要求57所述的核酸，其中所述氨基酸序列选自10、12、14和46至52。

62.   一种组合物，包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸选自如权利要求47至51所述的核酸，并且其中所述第二核酸选自如权利要求57至61所述的核酸。

63.   一种分离的核酸，包含编码重链的多核苷酸序列，其中所述重链包含：(i)包含选自SEQ ID NO：15、21和27的序列的重链(HC)CDR1；(ii)包含选自SEQ ID NO：16、22和28的序列的HC CDR2；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：17、23和29的序列的HC CDR3。

64.   如权利要求63所述的核酸，其中所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：15、16和17；(b)SEQ ID NO：21、22和23；以及(c)SEQ ID NO：27、28和29。

65.   如权利要求63或权利要求64所述的核酸，其中所述核酸还包含编码轻链的多核苷酸序列，其中所述轻链包含：(i)包含选自SEQID NO：18、24和30的序列的轻链(LC)CDR1；(ii)包含选自SEQ ID NO：19、25和31的序列的LC CDR2；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：20、26和32的序列的LC CDR3。

66.   如权利要求65所述的核酸，其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：18、19和20；(b)SEQ ID NO：24、25和26；以及(c)SEQ ID NO：30、31和32。

67.   一种分离的核酸，包含编码轻链的多核苷酸序列，其中所述轻链包含：(i)包含选自SEQ ID NO：18、24和30的序列的轻链(LC)CDR1；(ii)包含选自SEQ ID NO：19、25和31的序列的LC CDR2；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：20、26和32的序列的LC CDR3。

68.   如权利要求67所述的核酸，其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：18、19和20；(b)SEQ ID NO：24、25和26；以及(c)SEQ ID NO：30、31和32。

69.   一种组合物，包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸选自如权利要求63和64所述的核酸，并且其中所述第二核酸选自如权利要求67和68所述的核酸。

70.   一种分离的核酸，包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列分别编码如权利要求22至28中任一项所述的抗体的重链和轻链。

71.   一种组合物，包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸包含第一多核苷酸序列并且所述第二核酸包含第二多核苷酸序列，其中所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列分别编码如权利要求22至28中任一项所述的抗体的重链和轻链。

72.   一种宿主细胞，包含如权利要求47至61、63至68和70中任一项所述的核酸。

73.   一种宿主细胞，包含如权利要求60或权利要求69或权利要求71所述的组合物。

74.   如权利要求72或73所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。

75.   如权利要求74所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。

76.   如权利要求75所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自CHO细胞、293细胞、NSO细胞和PER.C6细胞。

77.   如权利要求76所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是293‑6E细胞或DG44细胞。

78.   一种治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括对患者施用如权利要求46所述的药物组合物。

79.   一种治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括对患者施用如权利要求46所述的药物组合物。

80.   一种治疗溶骨性骨质缺失的方法，所述方法包括对患者施用如权利要求46所述的药物组合物。

81.   如权利要求80所述的方法，其中所述溶骨性骨质缺失选自骨质疏松、转移诱导的溶骨性骨质缺失和类风湿性关节炎诱导的骨质缺失。

82.   一种治疗癌症的方法，所述方法包括对患者施用如权利要求46所述的药物组合物。

83.   如权利要求82所述的方法，其中所述癌症选自乳癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、胃癌和肺腺癌。

说明书结合CSF1R的抗体
本申请要求2010年5月4日提交的美国临时申请No.61/331,177的权益，所述美国临时申请在此以引用的方式全部并入本文以用于任何目的。
技术领域
提供了结合CSF1R的抗体。还提供了能够形成结合CSF1R的抗体的抗体重链和轻链。此外，提供了包含一个或多个特定的互补决定区(CDR)的抗体、重链和轻链。提供了编码针对CSF1R的抗体的多核苷酸。还提供了编码抗体重链或轻链的多核苷酸。提供了使用针对CSF1R的抗体的治疗方法。这些方法包括但不限于治疗类风湿性关节炎、骨质缺失和多发性硬化症的方法。
背景
集落刺激因子1受体(本文中称为CSF1R；本领域还称为FMS、FIM2、C‑FMS和CD115)是一种带有N端胞外结构域(ECD)和具有酪氨酸激酶活性的C端胞内结构域的单程跨膜受体。CSF1或白细胞介素34配体(本文中称为IL34；Lin等，Science 320：807‑11(2008))与CSF1R的配体结合导致受体二聚化、CSF1R蛋白酪氨酸激酶活性上调、CSF1R酪氨酸残基磷酸化和下游信号传导事件。CSF1和IL34两者都刺激单核细胞存活、增殖以及分化成巨噬细胞。
已经发现许多肿瘤细胞分泌CSF1，CSF1通过CSF1R活化单核细胞/巨噬细胞。已经证明肿瘤内的CSF1水平与肿瘤内的肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)水平有关。已经发现高水平的TAM与较差的患者预后有关。此外，已经发现，例如在小鼠的人乳癌异种移植物中，CSF1促进肿瘤生长和发展成转移。参见，例如Paulus等，Cancer Res.66：4349‑56(2006)。此外，CSF1R似乎在骨转移(bone metastasis)的溶骨性骨破坏(osteolytic bone destruction)中作为抑制该破坏的受体酪氨酸激酶活性小分子抑制剂发挥作用。参见，例如Ohno等，Mol.CancerTher.5：2634‑43(2006)。
还发现CSF1和其受体涉及各种炎症性和自体免疫性疾病。参见，例如Hamilton，Nat.Rev.8：533‑44(2008)。例如，已经发现来自患有类风湿性关节炎的关节的滑膜内皮细胞产生CSF1，表明CSF1和其受体在该疾病中具有作用。用抗体阻断CSF1R活性在关节炎小鼠模型中产生积极的临床效果，包含骨和软骨的破坏减少以及巨噬细胞数减少。参见，例如Kitaura等，J.Clin.Invest.115：3418‑3427(2005)。
成熟分化的骨髓系细胞如巨噬细胞、小神经胶质细胞和破骨细胞促进各种疾病(如类风湿性关节炎、多发性硬化症和骨质缺失疾病)的病理学。分化的骨髓系细胞来源于周边血液单核细胞中间体。CSF1R刺激促进单核细胞从骨髓前体的发育，促进单核细胞增殖和存活以及促进周边血液单核细胞分化成分化的骨髓系细胞如巨噬细胞、小神经胶质细胞和破骨细胞。因此，CSF1R刺激促进分化的骨髓系细胞的增殖、存活、活化和成熟，且在病理学环境中，CSF1R刺激促进分化的骨髓系细胞介导疾病病理学的能力。
CSF1R信号传导的其它拮抗剂因此将可用于治疗各种CSF1R相关性疾病，如癌症、炎症性病状和自体免疫性疾病。
概述
本发明人发明了一组针对人CSF1R胞外结构域(CSF1R ECD)的新抗体(包括人源化抗体)。Fab噬菌体展示库由经过人CSF1R ECD‑Fc融合蛋白免疫的小鼠脾脏制的。通过淘选该库分离出表达与CSF‑1RECD‑Fc结合的Fab的1056个噬菌体克隆。当1056个Fab被表达为纯化的蛋白质时，发现668个与CSF1R ECD结合。在所述668个结合Fab中，只有121个Fab阻断CSF1和/或IL34与CSF1R的结合。这些Fab中只有33个同时阻断CSF1和IL34与CSF1R的结合。通过测序，所述33个Fab代表19组独特的序列。选择对人CSF1R ECD具有低于纳摩尔浓度亲和力的11个Fab来制备嵌合抗体用于进一步研究。基于人和食蟹猴CSF1R结合亲和力、对CSF1和IL34与CSF1R结合的阻断以及对配体诱导的CSF1R磷酸化的抑制，选择三个嵌合抗体用于人源化，并且基于这三个嵌合抗体制备了十六个人源化抗体。
十六个人源化抗体中的十四个对人CSF1R ECD保持低于纳摩尔浓度的结合亲和力。参见，例如表5。这些人源化抗体同时阻断配体CSF1和IL34与人CSF1R的结合，并且许多还同时阻断CSF1和IL34与食蟹猴CSF1R的结合。参见，例如表4。
对于治疗性药物开发，与人和食蟹猴抗原两者的结合具有相似的亲和力的抗体是有利的。选择所述三个嵌合抗体选用于人源化部分是因为它们对人和食蟹猴CSF1R ECD具有相似的结合亲和力。然而，人源化之后，嵌合抗体之一(0302)的大部分人源化型式失去了对食蟹猴CSF1R ECD的显著结合亲和力，不过它们保持对人CSF1R ECD的强结合亲和力。参见，例如表3。0301和0311的人源化型式对人和食蟹猴CSF1R ECD都保持相似的强结合，其中对两个物种的结合亲和力差异小于约2倍。
基于CSF1R结合亲和力、配体抑制和免疫原性潜力，选择三个人源化抗体用于其它研究。所述三个人源化抗体是来源于人源化之后未显著丧失食蟹猴CSF1R结合亲和力的两个嵌合抗体。这三个人源化抗体抑制人CSF1R的配体诱导的磷酸化，并且还阻断原代人单核细胞中的配体诱导的增殖和存活反应。参见，例如表6和7，以及图10和11。因此，这些抗体可用于治疗涉及例如原代人单核细胞中的配体诱导的增殖和存活反应的疾病。
用抗CSF1R抗体阻断CSF1R诱导的反应应该抑制分化的骨髓系细胞的增殖、存活、活化、成熟，并且减弱其介导疾病病理学的能力。此外，用抗CSF1R抗体阻断CSF1R诱导的反应应该抑制周边血液单核细胞中间体分化成分化的骨髓系细胞，降低介导病理学的分化的骨髓系细胞的数目。
因此，本文中描述的人源化抗CSF1R抗体可用于通过抑制分化的骨髓系细胞介导疾病病理学的能力来治疗具有显著症状的慢性疾病。所述人源化抗体还可用于通过在疾病的缓解阶段期间抑制从周边血液单核细胞分化而来的新病理学介导性骨髓系细胞的发育，由此降低病理学介导性细胞的数目和其新的形成，从而治疗性质上为复发和缓解型的慢性疾病。
在一些实施方案中，提供包含重链和轻链的分离的抗体，其中所述抗体与CSF1R结合。在一些实施方案中，所述重链和/或轻链具有以下结构。
在一些实施方案中，重链包含与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，重链包含与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且轻链包含与选自SEQID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：15、16和17；(b)SEQ ID NO：21、22和23；以及(c)SEQ ID NO：27、28和29。在一些实施方案中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：18、19和20；(b)SEQ ID NO：24、25和26；以及(c)SEQID NO：30、31和32。
在一些实施方案中，重链包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：15、16和17；(b)SEQ ID NO：21、22和23；以及(c)SEQ ID NO：27、28和29；并且轻链包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含选自以下序列的一组序列：(a)SEQ ID NO：18、19和20；(b)SEQ ID NO：24、25和26；以及(c)SEQ ID NO：30、31和32。
在一些实施方案中，提供分离的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述抗体包含：(a)包含与SEQ ID NO：9具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ IDNO：10具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(b)包含与SEQ ID NO：11具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：12具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(c)包含与SEQ IDNO：13具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：14具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(d)包含与SEQ ID NO：39具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQID NO：46具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(e)包含与SEQ ID NO：40具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(f)包含与SEQ ID NO：41具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：46具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(g)包含与SEQ ID NO：39具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(h)包含与SEQ ID NO：40具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(i)包含与SEQ ID NO：41具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：47具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；以及(j)包含与SEQ IDNO：42具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(k)包含与SEQ ID NO：42具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQID NO：49具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(1)包含与SEQ ID NO：42具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(m)包含与SEQ ID NO：43具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：48具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(n)包含与SEQ ID NO：43具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：49具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(o)包含与SEQ ID NO：43具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：50具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(p)包含与SEQ ID NO：44具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(q)包含与SEQ ID NO：44具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；(r)包含与SEQ ID NO：45具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：51具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链；或(s)包含与SEQ ID NO：45具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的重链和包含与SEQ ID NO：52具有至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链。
在一些实施方案中，提供分离的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述抗体包含：(a)包含具有SEQ ID NO：15的序列的重链(HC)CDR1、具有SEQ ID NO：16的序列的HC CDR2和具有SEQ IDNO：17的序列的HC CDR3的重链，以及包含具有SEQ ID NO：18的序列的轻链(LC)CDR1、具有SEQ ID NO：19的序列的LC CDR2和具有SEQ ID NO：20的序列的LC CDR3的轻链；(b)包含具有SEQ IDNO：21的序列的重链(HC)CDR1、具有SEQ ID NO：22的序列的HCCDR2和具有SEQ ID NO：23的序列的HC CDR3的重链，以及包含具有SEQ ID NO：24的序列的轻链(LC)CDR1、具有SEQ ID NO：25的序列的LC CDR2和具有SEQ ID NO：26的序列的LC CDR3的轻链；或(c)包含具有SEQ ID NO：27的序列的重链(HC)CDR1、具有SEQID NO：28的序列的HC CDR2和具有SEQ ID NO：29的序列的HCCDR3的重链，以及包含具有SEQ ID NO：30的序列的轻链(LC)CDR1、具有SEQ ID NO：31的序列的LC CDR2和具有SEQ IDNO：32的序列的LC CDR3的轻链。
在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：53的序列的重链和包含SEQ ID NO：60的序列的轻链；(b)包含SEQ ID NO：53的序列的重链和包含SEQ ID NO：61的序列的轻链；或(c)包含SEQ ID NO：58的序列的重链和包含SEQ IDNO：65的序列的轻链。在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中所述抗体包含：(a)由SEQ ID NO：53的序列组成的重链和由SEQID NO：60的序列组成的轻链；(b)由SEQ ID NO：53的序列组成的重链和由SEQ ID NO：61的序列组成的轻链；或(c)由SEQ ID NO：58的序列组成的重链和由SEQ ID NO：65的序列组成的轻链。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体选自Fab、Fv、scFv、Fab’和(Fab’)2。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体选自IgA、IgG和IgD。在一些实施方案中，抗体是IgG。在一些实施方案中，抗体是IgG4。在一些实施方案中，抗体是在至少一个IgG4重链恒定区中包含S241P突变的IgG4。
在一些实施方案中，抗体与人CSF1R结合和/或与食蟹猴CSF1R结合。在一些实施方案中，抗体阻断配体与CSF1R的结合。在一些实施方案中，抗体阻断CSF1和/或IL34与CSF1R的结合。在一些实施方案中，抗体抑制配体诱导的CSF1R磷酸化。在一些实施方案中，抗体抑制CSF1和/或IL34诱导的CSF1R磷酸化。在一些实施方案中，抗体与人CSF1R结合的亲和力(KD)小于1nM。在一些实施方案中，抗体抑制在CSF1或IL34存在下的单核细胞增殖和/或存活反应。
在一些实施方案中，提供包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。
在一些实施方案中，提供分离的核酸，其中所述分离的核酸包含编码上述重链的多核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸编码上述轻链。在一些实施方案中，分离的核酸编码上述重链和上述轻链。在一些实施方案中，提供组合物，其中所述组合物包含含有编码上述重链的多核苷酸序列的第一核酸，以及含有编码上述轻链的多核苷酸序列的第二核酸。在一些实施方案中，提供包含上述核酸或组合物的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自CHO细胞、293细胞、NSO细胞和PER.C6细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是293‑6E细胞或DG44细胞。
在一些实施方案中，提供治疗疾病的方法，所述方法包括对患者施用包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。在一些实施方案中，提供治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括对患者施用包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。在一些实施方案中，提供治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括对患者施用包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。在一些实施方案中，提供治疗溶骨性骨质缺失(osteolytic bone loss)的方法，所述方法包括对患者施用包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。在一些实施方案中，所述溶骨性骨质缺失选自骨质疏松、转移诱导的溶骨性骨质缺失和类风湿性关节炎诱导的骨质缺失。在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对患者施用包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。在一些实施方案中，所述癌症选自乳癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、胃癌和肺腺癌。
在一些实施方案中，提供治疗炎症性病状的方法，所述方法包括对患者施用包含结合CSF1R的抗体的药物组合物。
在一些实施方案中，提供结合CSF1R的抗体和包含结合CSF1R的抗体的组合物，用于在人或动物的治疗方法中使用。在一些实施方案中，提供结合CSF1R的抗体和包含结合CSF1R的抗体的组合物，用于在人或动物的类风湿性关节炎治疗方法中使用。在一些实施方案中，提供结合CSF1R的抗体和包含结合CSF1R的抗体的组合物，用于在人或动物的多发性硬化症治疗方法中使用。在一些实施方案中，提供结合CSF1R的抗体和包含结合CSF1R的抗体的组合物，用于在人或动物的癌症治疗方法中使用。在一些实施方案中，提供结合CSF1R的抗体和包含结合CSF1R的抗体的组合物，用于在人或动物的炎症性病状治疗方法中使用。
附图简述

图1展示如实施例4中所讨论的人源化抗体Ab1至Ab16各自的人源化重链可变区的比对。加方框的残基是人受体序列中变回相应小鼠残基的氨基酸。
图2展示如实施例4中所讨论的人源化抗体Ab1至Ab16各自的人源化轻链可变区的比对。加方框的氨基酸是人受体序列中变回相应小鼠残基的残基。
图3展示如实施例5中所描述的某些人源化抗体与人CSF1RECD结合的结合曲线。附3A展示亲本嵌合抗体(cAb)0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的结合曲线。图3B展示亲本cAb0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的结合曲线。图3C展示亲本cAb0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的结合曲线。
图4展示如实施例5中所描述的某些人源化抗体与食蟹猴CSF1RECD结合的结合曲线。图4A展示亲本cAb 0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的结合曲线。图4B展示亲本cAb0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的结合曲线。图4C展示亲本cAb 0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的结合曲线。
图5展示如实施例5中所描述的某些人源化抗体与小鼠CSF1RECD结合的结合曲线。图5A展示亲本cAb 0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的结合曲线。图5B展示亲本cAb0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的结合曲线。图5C展示亲本cAb0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的结合曲线。
图6展示如实施例6中所描述的某些人源化抗体对CSF1诱导的CSF1R磷酸化的抑制。图6A展示亲本cAb 0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的阻断曲线。图6B展示亲本cAb 0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的阻断曲线。图6C展示亲本cAb 0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的阻断曲线。
图7展示如实施例7中所描述的某些人源化抗体对IL34诱导的CSF1R磷酸化的抑制。图7A展示亲本cAb 0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的阻断曲线。图7B展示亲本cAb 0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的阻断曲线。图7C展示亲本cAb 0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的阻断曲线。
图8展示如实施例7中所描述的某些人源化抗体对人CSF1与食蟹猴CSF1R ECD结合的阻断。图8A展示亲本cAb 0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的阻断曲线。图8B展示亲本cAb0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的阻断曲线。图8C展示亲本cAb0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的阻断曲线。
图9展示如实施例7中所描述的某些人源化抗体对人IL34与食蟹猴CSF1R ECD结合的阻断。图9A展示亲本cAb 0301和人源化抗体(huAb)0301.1、0301.2、0302.3、0301.4、0301.5和0301.6(分别是h0301‑L0H0、h0301‑L0H1、h0301‑L0H2、h0301‑L1H0、h0301‑L1H1和h0301‑L1H2)的阻断曲线。图9B展示亲本cAb 0302和人源化抗体(huAb)0302.1、0302.2、0302.3、0302.4、0302.5和0302.6(分别是h0302‑L0H1、h0302‑L1H1、h0302‑L2H1、h0302‑L0H2、h0302‑L1H2和h0302‑L2H2)的阻断曲线。图9C展示亲本cAb 0311和人源化抗体(huAb)0311.1、0311.2、0311.3和0311.4(分别是h0311‑L0H1、h0311‑L1H1、h0311‑L0H2和h0311‑L1H2)的阻断曲线。
图10展示如实施例9中所描述的人源化抗体0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1对表达人CSF1R的CHO细胞中CSF1‑(A)和IL34‑(B)诱导的CSF1R磷酸化的阻断。
图11展示如实施例10中所描述的人源化抗体0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1对CSF1‑(A)和IL34‑(B)诱导的单核细胞增殖/存活反应的阻断。
图12A‑C展示如实施例11中所描述，使用来自三个不同供体的单核细胞时，人源化抗体0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1不刺激原代单核细胞增殖或存活。
详细描述
提供了包括施用针对CSF1R的新颖抗体的治疗疾病的方法。所有所述抗体都对人CSF1R ECD的结合亲和力小于2nM，并且除两个之外的所有人源化抗体对人CSF1R ECD都具有低于纳摩尔浓度的结合亲和力。此外，所述新抗体同时阻断CSF1和IL34与人CSF1R的结合，并且抑制人CSF1R的配体诱导的磷酸化。许多新抗体还阻断CSF1和IL34与食蟹猴CSF1R的结合，这有利于体内实验从而有助于抗CSF1R抗体治疗剂的开发。因此，所述新抗体非常适于在治疗上用于人疾病，包括但不限于癌症、自体免疫性疾病和炎症性病状。
本文中使用的章节标题只是用于组织上的目的，而不应解释为限制所描述的标的物。
定义
除非另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语将具有一般技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。
结合重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)、酶反应和纯化技术使用的示例性技术在本领域是已知的。许多这些技术和程序例如描述于Sambrook等Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989))等中。此外，用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送以及患者治疗的示例性技术也是本领域已知的。
在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意谓“和/或”。在多个从属权利要求的上下文中，“或”的使用只是选择性地回引一个以上前述独立或从属权利要求。此外，除非另外明确说明，否则如“元件”或“组分”等术语同时涵盖包含一个单元的元件和组分以及包含一个以上亚单元的元件和组分。
除非另外指出，否则按照本公开使用的以下术语应理解为具有以下含义：
术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。这些核苷酸的聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指构成核酸分子或多核苷酸的线性核苷酸序列。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。这些氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。所述定义同时涵盖全长蛋白质和其片段。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰如缺失、添加和取代(在性质上通常是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质保持希望的活性即可。这些修饰可以是有意的(如通过定点诱变)，或者可以是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增导致的差错)。
术语“CSF1R”在本文中是指全长CSF1R，其包括N端ECD、跨膜结构域和胞内酪氨酸激酶结构域，有或没有N端前导序列。在一些实施方案中，所述CSF1R是具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的人CSF1R。
本文中使用的术语“CSF1R胞外结构域”(“CSF1R ECD”)是指缺乏胞内和跨膜结构域的CSF1R多肽。CSF1R ECD包括能够结合CSF1R和/或IL34的全长CSF1R ECD和CSF1R ECD片段。人全长CSF1R ECD在本文中定义为包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至512(即包括前导序列)或氨基酸20至512(即缺乏前导序列)的二者之一。在一些实施方案中，人CSF1R ECD片段包含SEQ ID NO：2的氨基酸20至506(参见SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，人CSF1R片段结束于氨基酸507、508、509、510或511。在一些实施方案中，cynoCSF1R ECD包含SEQ ID NO：7的序列(具有前导序列)或SEQ IDNO：7的氨基酸20至506(无前导序列)。
本文中使用的术语“抗体”是指包含重链的至少互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3以及轻链的至少CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够与抗原结合。术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(如小鼠、人、食蟹猴等)的抗体。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含至少一个含有重链可变区和重链恒定区的至少一部分的重链，以及至少一个含有轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分的轻链。在一些实施方案中，抗体包含两个重链，其中各重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分，以及两个轻链，其中各轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。本文中使用的单链Fv(scFv)或包含例如含有所有6个CDR(三个重链CDR和三个轻链CDR)的单个多肽链的任何其它抗体被认为具有重链和轻链。在这些实施方案的一些中，重链是包含三个重链CDR的抗体区域并且轻链是包含三个轻链CDR的抗体区域。
本文中使用的术语“重链可变区”是指包含重链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。在一些实施方案中，重链CDR1对应于Kabat残基26至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；并且重链CDR3对应于Kabat残基95至102。参见，例如Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，Md.)；以及图1。在一些实施方案中，重链CDR1对应于Kabat残基31至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；并且重链CDR3对应于Kabat残基95至102。参见上文。
本文中使用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的区域。非限制性示例重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例重链恒定区还包括ε和μ。各重恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，并且包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，并且包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步再分成亚类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。
在一些实施方案中，重链恒定区包含为抗体带来希望的特性的一个或多个突变(或取代)、添加或缺失。非限制性示例突变是IgG4绞链区(在恒定结构域CH1和CH2之间)中的S241P突变，它将IgG4基元CPSCP改变为CPPCP，CPPCP与IgG1中的对应基元相似。在一些实施方案中，该突变产生更稳定的IgG4抗体。参见，例如Angal等，Mol.Immunol.30：105‑108(1993)；Bloom等，Prot.Sci.6：407‑415(1997)；Schuurman等，Mol.Immunol.38：1‑8(2001)。
本文中使用的术语“重链”是指至少包含重链可变区(有或没有前导序列)的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。本文中使用的术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区(有或没有前导序列)的多肽。
本文中使用的术语“轻链可变区”是指包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1和/或FR4。在一些实施方案中，轻链CDR1对应于Kabat残基24至34；轻链CDR2对应于Kabat残基50至56；并且轻链CDR3对应于Kabat残基89至97。参见，例如Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，Md.)；以及图1。
本文中使用的术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域(CL)的区域。非限制性示例轻链恒定区包括λ和κ。
本文中使用的术语“轻链”是指至少包含轻链可变区(有或没有前导序列)的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。本文中使用的术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区(有或没有前导序列)的多肽。
本文中使用的“嵌合抗体”是指包含至少一个来自第一物种(如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(如人、食蟹猴等)的恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区都是来自第一物种并且嵌合抗体的所有恒定区都是来自第二物种。
本文中使用的“人源化抗体”是指其中非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸已经置换为来自人可变区的相应氨基酸的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体是Fab、scFv、(Fab’)2等。
本文中使用的“CDR移植抗体”是指其中第一(非人)物种的互补决定区(CDR)已经被移植到第二(人)物种的框架区(FR)上的人源化抗体。
本文中使用的“人抗体”是指在人体中产生的抗体、在包含人免疫球蛋白基因的非人动物中产生的抗体(如以及使用体外方法(如噬菌体展示，其中抗体谱是基于人免疫球蛋白序列)选择的抗体。
术语“前导序列”是指促进多肽自哺乳动物细胞分泌的位于多肽N端的氨基酸残基序列。前导序列可以在多肽从哺乳动物细胞输出时被裂解，从而形成成熟蛋白质。前导序列可以是天然或合成的，并且它们可以与它们所连接的蛋白质异源或同源。示例性前导序列包括但不限于抗体前导序列，例如SEQ ID NO：3和4的氨基酸序列，它们分别对应于人轻链和重链前导序列。非限制性示例前导序列还包括来自异源蛋白质的前导序列。在一些实施方案中，抗体缺乏前导序列。在一些实施方案中，抗体包含至少一个前导序列，其可以选自天然抗体前导序列和异源前导序列。
术语“载体”用于描述可以被工程化从而容纳克隆多核苷酸或可以在宿主细胞中增殖的多核苷酸的多核苷酸。载体可以包括一个或多个以下元件：复制起点、一个或多个调节目标多肽表达的调控序列(例如启动子和/或增强子)和/或一个或多个选择性标记基因(例如抗生素抗性基因和可以在比色测定中使用的基因，例如β‑半乳糖苷酶)。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。
“宿主细胞”是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞如酵母菌；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、细胞(Crucell)以及293和CHO细胞及其衍生物，分别如293‑6E和DG44细胞。
本文中使用的术语“分离的”是指已经与至少一些组分分离的分子，通常该分子与这些组分一起在自然界中被发现。例如，当多肽与至少一些产生它的细胞中的组分分离时，该多肽称为“分离的”。当多肽在表达之后被细胞分泌时，从产生它的细胞通过物理方式分离含有所述多肽的上清液被认为是“分离”所述多肽。类似地，当多核苷酸不是在自然界中通常在其中发现该多核苷酸的更大的多核苷酸(例如基因组DNA或线粒体DNA，在DNA多核苷酸的情况下)的一部分时，或与产生它的细胞中的至少一些组分分离(例如在RNA多核苷酸的情况下)时，该多核苷酸被称为“分离的”。因此，只要多核苷酸没有在自然界中的载体中被发现，包含于宿主细胞内的该载体中的DNA多核苷酸就可以称为“分离的”。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，是指人。在一些实施方案中，还提供治疗其它哺乳动物的方法，这些哺乳动物包括但不限于啮齿动物、猿、猫、犬、马、牛、猪、羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农场动物、哺乳类竞赛动物和哺乳类宠物。
术语“类风湿性关节炎”(“RA”)是指主要特征为关节内层(滑膜)炎症的慢性自体免疫性疾病，它可以导致关节损伤，从而产生慢性疼痛、功能丧失和残疾。因为RA可以影响身体的多种器官(包括皮肤、肺和眼睛)，所以它被称为全身性疾病。
术语“多发性硬化症”(“MS”)是指CNS的慢性、自体免疫性、脱髓鞘疾病，其中身体产生针对产生髓鞘的细胞的抗体和白血球。当髓鞘发炎、损伤并且从神经纤维脱离时，就出现“脱髓鞘”。
术语“癌症”是指与不受控的细胞增殖、无限制的细胞生长和减少的细胞凋亡有关的增殖性病症。癌症包括但不限于乳癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、食道癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、葡萄膜黑色素瘤、脑癌、头颈癌、肺腺癌，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、卵巢癌、白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病，包括原始粒细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、骨髓增生异常综合征真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金病、非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、重链疾病、以及实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm′s tumor)、子宫颈癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤和脑膜瘤。术语“转移”和“癌转移”在本文中可互换使用，是指癌细胞扩散到其它组织的能力。例如，“转移至骨骼”是指包括但不限于乳癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌和黑色素瘤在内的某些癌症类型转移至骨骼的能力。
本文中使用的术语“溶骨病症”是指由破骨细胞(它是负责骨吸收的细胞)活性升高引起的任何病状。术语“骨溶解”和“溶骨性骨质缺失”可以互换使用，是指与溶骨病症有关的破骨细胞介导的骨吸收或骨质缺失。溶骨病症可能在有发展溶骨病症倾向的受试者中出现，或其可能在患有通过刺激破骨细胞活性而引起或促成溶骨病症的疾病的受试者中出现。在本发明的示例性实施方案中，溶骨病症可以包括溶骨性骨质缺失和癌症转移诱导的溶骨性骨质缺失。在本发明的其它示例性实施方案中，溶骨性骨病症包括代谢性骨骼疾病，包括内分泌病，如皮质醇过多症、性腺功能减退、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进和甲状腺功能亢进；饮食缺乏，包括佝偻病、软骨病、坏血病和营养不良；骨质疏松；药物使用，包括糖皮质激素(糖皮质激素诱导的骨质疏松)、肝素和酒精；慢性疾病，包括吸收不良综合征；慢性肾衰竭，包括肾性骨营养不良；慢性肝病，包括肝性骨营养不良；遗传性疾病，包括成骨不全和高胱氨酸尿症；以及与关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、纤维性结构不良、牙周病和佩吉特氏病(Paget′sdisease)有关的骨骼炎症。
术语“转移诱导的溶骨性骨质缺失”和“癌症转移诱导的溶骨性骨质缺失”在本文中可互换使用，是指由癌细胞向骨骼转移引起的骨溶解或溶骨性骨质缺失。术语“癌症转移诱导的破骨细胞活化”在本文中用于指转移至骨骼的癌细胞诱导破骨细胞活化的能力。
术语“肿瘤”在本文中用于指显示异常高水平的增殖和生长的一群细胞。肿瘤可以是良性、恶性前或恶性的；恶性肿瘤细胞是癌性的。肿瘤细胞可以是实体肿瘤细胞或白血病肿瘤细胞。术语“肿瘤生长”在本文中用于指引起肿瘤尺寸相应增大的构成肿瘤的细胞的增殖或生长。术语“CSFIR依赖性肿瘤生长”在本文中用于指为了肿瘤细胞增殖或生长，肿瘤细胞需要CSFIR介导的功能。
本文中使用的“治疗”涵盖在哺乳动物(包括人)中的用于疾病的治疗剂的任何施用或应用，并且包括抑制疾病或疾病的发展、抑制或减缓疾病或其发展、阻止其发展、部分或完全减轻疾病或治愈疾病，例如，通过引起退化，或恢复或修复丧失、丢失或缺损的功能；或刺激低效的过程。
术语“抑制”是指任何表型特征的减少或终止或指该特征的发生率、程度或可能性的降低或终止。
“可药用的载剂”是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料、制剂辅助剂，或本领域中用于与治疗剂一起使用共同构成用于对受试者施用的“药物组合物”的常规载剂。可药用的载剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的并且与制剂的其它成分相容。可药用的载剂适合于所使用的制剂。例如，如果要口服施用治疗剂，那么载剂可以是凝胶胶囊。如果要皮下注射施用治疗剂，那么载剂理想地对皮肤没有刺激性并且不会引起注射部位反应。
抗CSF1R抗体
本发明人发明了针对CSF1R的一组新抗体。抗CSF1R抗体包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体和包含本文中讨论的重链和/或轻链CDR的抗体。
示例性人源化抗体
在一些实施方案中，提供结合CSF1R的人源化抗体。人源化抗体适用作治疗性分子，因为人源化抗体减少或消除人对非人抗体的免疫反应(如人抗小鼠抗体(HAMA)反应)，这可以产生对抗体治疗剂的免疫反应并且降低治疗剂的有效性。
非限制性示例人源化抗体包括本文中描述的Ab1至Ab16。非限制性示例人源化抗体还包括包含选自Ab1至Ab16的抗体的重链可变区和/或选自Ab1至Ab16的抗体的轻链可变区的抗体。非限制性示例人源化抗体包括包含选自SEQ ID NO：39至45的重链可变区和/或选自SEQ ID NO：46至52的轻链可变区的抗体。示例性人源化抗体还包括但不限于包含选自0301、0302和0311的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3的人源化抗体。
在一些实施方案中，人源化抗CSF1R抗体包含选自0301、0302和0311的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。非限制性示例人源化抗CSF1R抗体包括包含选自以下序列的重链CDR1、CDR2和CDR3的组的抗体：SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；以及SEQ ID NO：27、28和29。非限制性示例人源化抗CSF1R抗体还包括选自以下序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3的组的抗体：SEQ ID NO：18、19和20；SEQID NO：24、25和26；以及SEQ ID NO：30、31和32。
非限制性示例人源化抗CSF1R抗体包括包含表1中的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的组的抗体(展示SEQ ID NO；序列请参见表8)。表1的每行展示示例性抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
表1：重链和轻链CDR

其它示例性人源化抗体
在一些实施方案中，人源化抗CS F1R抗体包含含有与选自SEQID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的重链，并且其中所述抗体结合CSF1R。在一些实施方案中，人源化抗CSF1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的轻链，并且其中所述抗体结合CSF1R。在一些实施方案中，人源化抗CSF1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的重链；以及含有与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的轻链；其中所述抗体结合CSF1R。
如本文中所使用，特定多肽是否例如与氨基酸序列具有至少95％同一性可以使用例如计算机程序来确定。当确定特定序列是否例如与参比序列具有95％同一性时，同一性百分比是在参比氨基酸序列的全长上来计算。
在一些实施方案中，人源化抗CSF1R抗体包含至少一个本文中讨论的CDR。即，在一些实施方案中，人源化抗CSF1R抗体包含选自本文中讨论的重链CDR1、本文中讨论的重链CDR2、本文中讨论的重链CDR3、本文中讨论的轻链CDR1、本文中讨论的轻链CDR2和本文中讨论的轻链CDR3的至少一个CDR。此外，在一些实施方案中，人源化抗CSF1R抗体包含至少一个基于本文中讨论的CDR的突变型CDR，其中所述突变型CDR包含相对于本文中讨论的CDR的1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。本领域技术人员可以针对特定的CDR序列选择一个或多个合适的保守氨基酸取代，其中所述合适的保守氨基酸取代预计不会显著地改变包含所述突变型CDR的抗体的结合性质。
示例性人源化抗CSF1R抗体还包括与本文中描述的抗体竞争结合CSF1R的抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自Fab 0301、0302和0311以及这些Fab的二价(即具有两个重链和两个轻链)抗体型式的抗体竞争结合CSF1R的人源化抗CSF1R抗体。
示例性人源化抗体恒定区
在一些实施方案中，本文中描述的人源化抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文中描述的人源化抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文中描述的人源化抗体包含人IgG4重链恒定区。在这些实施方案的一些中，本文中描述的人源化抗体在人IgG4恒定区中包含S241P突变。在一些实施方案中，本文中描述的人源化抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
重链恒定区的选择可以决定抗体在体内是否将具有效应功能。在一些实施方案中，这些效应功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且可以导致杀灭与抗体结合的细胞。在一些治疗方法(包括一些癌症的治疗方法)中，细胞杀灭可能是希望的，例如，当抗体与支持肿瘤维持或生长的细胞结合时。可能支持肿瘤维持或生长的示例性细胞包括但不限于肿瘤细胞本身、有助于血管结构向肿瘤募集的细胞以及提供支持或促进肿瘤生长或肿瘤存活的配体、生长因子或反受体的细胞。在一些实施方案中，当希望有效应功能时，选择包含人IgG1重链或人IgG3重链的抗CSF1R抗体。
在一些治疗方法中，效应功能可能是不希望的。例如，在一些实施方案中，可能希望在MS和/或RA和/或骨溶解的治疗中使用的抗体不具有效应功能。因此，在一些实施方案中，针对癌症治疗开发的抗CSF1R抗体可能不适于在MS和/或RA和/或骨溶解的治疗中使用。因此，在一些实施方案中，在MS和/或RA和/或骨溶解的治疗中使用缺乏显著的效应功能的抗CSF1R抗体。在一些实施方案中，用于治疗MS和/或RA和/或骨溶解的抗CSF1R抗体包含人IgG4或IgG2重链恒定区。在一些实施方案中，IgG4恒定区包含S241P突变。
抗体可以通过任何方法人源化。人源化的非限制性示例方法包括例如美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370；Jones等，Nature 321：522‑525(1986)；Riechmann等，Nature332：323‑27(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534‑36(1988)和美国公布No.US 2009/0136500中描述的方法。
如上所述，人源化抗体是其中非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸已置换为来自人框架区中的相应位置的氨基酸的抗体。在一些实施方案中，非人可变区的框架区中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个或至少20个氨基酸置换为来自一个或多个人框架区中的一个或多个相应位置的氨基酸。
在一些实施方案中，用于取代的一些相应的人氨基酸是来自不同人免疫球蛋白基因的框架区。即，在这些实施方案的一些中，一个或多个非人氨基酸可以置换为来自第一人抗体的人框架区或由第一人免疫球蛋白基因编码的相应氨基酸，一个或多个非人氨基酸可以置换为来自第二人抗体的人框架区或由第二人免疫球蛋白基因编码的相应氨基酸，一个或多个非人氨基酸可以置换为来自第三人抗体的人框架区或由第三人免疫球蛋白基因编码的相应氨基酸等。此外，在一些实施方案中，用于在单个框架区(例如FR2)中取代的所有相应人氨基酸无需来自相同的人框架。然而，在一些实施方案中，用于取代的所有相应人氨基酸是来自相同的人抗体或由相同的人免疫球蛋白基因编码。
在一些实施方案中，通过用相应的人框架区置换一个或多个完整的框架区来将抗体人源化。在一些实施方案中，选择与所置换的非人框架区具有最高水平的同源性的人框架区。在一些实施方案中，这种人源化抗体是CDR移植的抗体。
在一些实施方案中，继CDR移植之后，一个或多个框架氨基酸被变回小鼠框架区中的相应氨基酸。在一些实施方案中，进行这种“回复突变”以保留似乎促进一个或多个CDR的结构和/或可能涉及抗原接触和/或似乎涉及抗体的整体结构完整性的一个或多个小鼠框架氨基酸。在一些实施方案中，继CDR移植之后，对抗体的框架区进行十个或十个以下、九个或九个以下、八个或八个以下、七个或七个以下、六个或六个以下、五个或五个以下、四个或四个以下、三个或三个以下、两个或两个以下、一个或零个回复突变。
在一些实施方案中，人源化抗体还包含人重链恒定区和/或人轻链恒定区。
示例性嵌合抗体
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含至少一个非人可变区和至少一个人恒定区。在这些实施方案的一些中，抗CSF1R抗体的所有可变区都是非人可变区，并且抗CSF1R抗体的所有恒定区都是人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的一个或多个可变区是小鼠可变区。嵌合抗体的人恒定区无需具有与其所置换的非人恒定区(如果有)相同的同种型。嵌合抗体例如在美国专利No.4,816,567；和Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851‑55(1984)中论述。
非限制性示例嵌合抗体包括含有选自0301、0302和0311的抗体的重链和/或轻链可变区的嵌合抗体。其它非限制性示例嵌合抗体包括含有选自0301、0302和0311的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3的嵌合抗体。
非限制性示例嵌合抗CSF1R抗体包括含有以下重链及轻链可变区对的抗体：SEQ ID NO：9和10；SEQ ID NO：11和12；以及SEQ IDNO：13和14。
非限制性示例抗CS F1R抗体包括含有上表1中所示的一组重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体。
其它示例性嵌合抗体
在一些实施方案中，嵌合抗CS F1R抗体包含含有与选自SEQ IDNO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的重链，其中所述抗体结合CSF1R。在一些实施方案中，嵌合抗CSF1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的轻链，其中所述抗体结合CSF1R。在一些实施方案中，嵌合抗CSF1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的重链；以及含有与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的轻链；其中所述抗体结合CSF1R。
在一些实施方案中，嵌合抗CSF1R抗体包含至少一个本文中讨论的CDR。即，在一些实施方案中，嵌合抗CSF1R抗体包含选自本文中讨论的重链CDR1、本文中讨论的重链CDR2、本文中讨论的重链CDR3、本文中讨论的轻链CDR1、本文中讨论的轻链CDR2和本文中讨论的轻链CDR3的至少一个CDR。此外，在一些实施方案中，嵌合抗CSF1R抗体包含至少一个基于本文中讨论的CDR的突变型CDR，其中所述突变型CDR包含相对于本文中讨论的CDR的1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。本领域技术人员可以针对特定的CDR序列选择一个或多个合适的保守氨基酸取代，其中所述合适的保守氨基酸取代预计不会显著地改变包含所述突变型CDR的抗体的结合性质。
示例性嵌合抗CSF1R抗体还包括与本文中描述的抗体竞争结合CSF1R的嵌合抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自Fab 0301、0302和0311以及这些Fab的二价(即具有两个重链和两个轻链)抗体型式的抗体竞争结合CSF1R的嵌合抗CSF1R抗体。
示例性嵌合抗体恒定区
在一些实施方案中，本文中描述的嵌合抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文中描述的嵌合抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文中描述的嵌合抗体包含人IgG4重链恒定区。在这些实施方案的一些中，本文中描述的嵌合抗体在人IgG4恒定区中包含S241P突变。在一些实施方案中，本文中描述的嵌合抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
如上所述，是否希望有效应功能可能取决于计划应用抗体的特定治疗方法。因此，在一些实施方案中，当希望有效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的嵌合抗CSF1R抗体。在一些实施方案中，当希望没有效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的嵌合抗CSF1R抗体。
示例性人抗体
人抗体可以通过任何合适的方法来制备。非限制性示例方法包括在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备人抗体。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551‑55(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255‑8(1993)；Lonberg等，Nature 368：856‑9(1994)；以及美国专利No.5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299和5,545,806。
非限制性示例方法还包括使用噬菌体展示库制备人抗体。参见，例如Hoogenboom等，J.Mol. Biol.227：381‑8(1992)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581‑97(1991)；以及PCT公布No.WO 99/10494。
在一些实施方案中，人抗CSF1R抗体与具有SEQ ID NO：1的序列的多肽结合。示例性人抗CSF1R抗体还包括与本文中描述的抗体竞争结合CSF1R的抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自Fab0301、0302和0311以及这些Fab的二价(即具有两个重链和两个轻链)抗体型式的抗体竞争结合CSF1R的人抗CSF1R抗体。
在一些实施方案中，人抗CSF1R抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文中描述的人抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文中描述的人抗体包含人IgG4重链恒定区。在这些实施方案的一些中，本文中描述的人抗体在人IgG4恒定区中包含S241P突变。在一些实施方案中，本文中描述的人抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
在一些实施方案中，当希望有效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的人抗CSF1R抗体。在一些实施方案中，当希望没有效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的人抗CSF1R抗体。
其它示例性抗CSF1R抗体
示例性抗CSF1R抗体还包括但不限于包含例如本文中描述的一个或多个CDR序列的小鼠、人源化、人、嵌合和工程化抗体。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含本文中描述的重链可变区。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含本文中描述的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含本文中描述的重链可变区和本文中描述的轻链可变区。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含本文中描述的重链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含本文中描述的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含本文中描述的重链CDR1、CDR2和CDR3以及本文中描述的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含选自Fab 0301、0302和0311的抗体的重链可变区。非限制性示例抗CSF1R抗体还包括含有选自人源化抗体Ab1至Ab16的抗体的重链可变区的抗体。非限制性示例抗CSF1R抗体包括包含含有选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列的重链可变区的抗体。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含选自Fab 0301、0302和311的抗体的轻链可变区。非限制性示例抗CSF1R抗体还包括含有选自人源化抗体Ab1至Ab16的抗体的轻链可变区的抗体。非限制性示例抗CSF1R抗体包括包含含有选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列的轻链可变区的抗体。
在一些实施方案中，抗CS F1R抗体包含选自Fab 0301、0302和0311的抗体的重链可变区和轻链可变区。非限制性示例抗CSF1R抗体还包括含有选自人源化抗体Ab1至Ab16的抗体的重链可变区和轻链可变区的抗体。非限制性示例抗CSF1R抗体包括含有以下重链及轻链可变区对的抗体：SEQ ID NO：9和10；SEQ ID NO：11和12；以及SEQ ID NO：13和14；SEQ ID NO：39和40；SEQ ID NO：41和42；SEQ ID NO：43和44；SEQ ID NO：45和46；SEQ ID NO：47和48；SEQ ID NO：49和50；以及SEQ ID NO：51和52。非限制性示例抗CSF1R抗体还包括含有以下重链及轻链对的抗体：SEQ ID NO：33和34；SEQ ID NO：35和36；以及SEQ ID NO：37和38。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含选自Fab 0301、0302和0311的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3。非限制性示例抗CSF1R抗体包括含有选自以下序列的重链CDR1、CDR2和CDR3组的抗体：SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；以及SEQ ID NO：27、28和29。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含选自Fab 0301、0302和0311的抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3。非限制性示例抗CSF1R抗体包括含有选自以下序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3组的抗体：SEQ ID NO：18、19和20；SEQ ID NO：24、25和26；以及SEQ ID NO：30、31和32。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含选自Fab 0301、0302和0311的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
非限制性示例抗CSF1R抗体包括含有上表1中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3组的抗体。
其它示例性抗体
在一些实施方案中，抗CS F1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的重链，其中所述抗体结合CSF1R。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的轻链，其中所述抗体结合CSF1R。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含含有与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的重链；以及含有与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列的轻链；其中所述抗体结合CSF1R。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含至少一个本文中讨论的CDR。即，在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含选自本文中讨论的重链CDR1、本文中讨论的重链CDR2、本文中讨论的重链CDR3、本文中讨论的轻链CDR1、本文中讨论的轻链CDR2和本文中讨论的轻链CDR3的至少一个CDR。此外，在一些实施方案中，抗CSF1R抗体包含至少一个基于本文中讨论的CDR的突变型CDR，其中所述突变性CDR包含相对于本文中讨论的CDR的1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。本领域技术人员可以针对特定的CDR序列选择一个或多个合适的保守氨基酸取代，其中所述合适的保守氨基酸取代预计不会显著地改变包含所述突变型CDR的抗体的结合性质。
示例性抗CSF1R抗体还包括与本文中描述的抗体竞争结合CSF1R的抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自Fab 0301、0302和0311和这些Fab的二价(即具有两个重链和两个轻链)抗体型式的抗体竞争结合CSF1R的抗CSF1R抗体。
示例性抗体恒定区
在一些实施方案中，本文中描述的抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文中描述的抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文中描述的抗体包含人IgG4重链恒定区。在这些实施方案的一些中，本文中描述的抗体在人IgG4恒定区中包含S241P突变。在一些实施方案中，本文中描述的抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。
如上所述，是否希望有效应功能可能取决于计划应用抗体的特定治疗方法。因此，在一些实施方案中，当希望有效应功能时，选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的抗CSF1R抗体。在一些实施方案中，当希望没有效应功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的抗CSF1R抗体。
示例性抗CSF1R重链可变区
在一些实施方案中，提供抗CSF1R抗体重链可变区。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链可变区是小鼠可变区、人可变区或人源化可变区。
抗CSF1R抗体重链可变区包含重链CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链可变区更包含重链FR1和/或FR4。非限制性示例重链可变区包括但不限于具有选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链可变区包含含有选自SEQ ID NO：15、21和27的序列的CDR1。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链可变区包含含有选自SEQ ID NOs：16、22和28的序列的CDR2。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链可变区包含含有选自SEQ ID NO：17、23和29的序列的CDR3。
非限制性示例重链可变区包括但不限于含有选自以下序列的CDR1、CDR2和CDR3组的重链可变区：SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；以及SEQ ID NO：27、28和29。
在一些实施方案中，抗CS F1R抗体重链包含与选自SEQ ID NO：9、11、13和39至45的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列，其中所述重链与轻链一起能够形成结合CSF1R的抗体。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链包含至少一个本文中讨论的CDR。即，在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链包含选自本文中讨论的重链CDR1、本文中讨论的重链CDR2和本文中讨论的重链CDR3的至少一个CDR。此外，在一些实施方案中，抗CSF1R抗体重链包含至少一个基于本文中讨论的CDR的突变型CDR，其中所述突变型CDR包含相对于本文中讨论的CDR的1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。本领域技术人员可以针对特定的CDR序列选择一个或多个合适的保守氨基酸取代，其中所述合适的保守氨基酸取代预计不会显著地改变包含所述突变型CDR的重链的结合性质。
在一些实施方案中，重链包含重链恒定区。在一些实施方案中，重链包含人重链恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人重链恒定区是IgG恒定区。在一些实施方案中，重链包含人IgG4重链恒定区。在这些实施方案的一些中，人IgG4重链恒定区包含S241P突变。
在一些实施方案中，当希望有效应功能时，重链包含人IgG1或IgG3重链恒定区。在一些实施方案中，当不太希望有效应功能时，重链包含人IgG4或IgG2重链恒定区。
示例性抗CSF1R轻链可变区
在一些实施方案中，提供抗CSF1R抗体轻链可变区。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链可变区是小鼠可变区、人可变区或人源化可变区。
抗CSF1R抗体轻链可变区包含轻链CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链可变区更包含轻链FR1和/或FR4。非限制性示例轻链可变区包括具有选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链可变区包含含有选自SEQ ID NO：18、24和30的序列的CDR1。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链可变区包含含有选自SEQ ID NO：19、25和31的序列的CDR2。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链可变区包含含有选自SEQ ID NO：20、26和32的序列的CDR3。
非限制性示例轻链可变区包括但不限于含有选自以下序列的CDR1、CDR2和CDR3组的轻链可变区：SEQ ID NO：18、19和20；SEQ ID NO：24、25和26；以及SEQ ID NO：30、31和32。
在一些实施方案中，抗CS F1R抗体轻链包含与选自SEQ ID NO：10、12、14和46至52的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的可变区序列，其中所述轻链与重链一起能够形成结合CSF1R的抗体。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链包含至少一个本文中讨论的CDR。即，在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链包含选自本文中讨论的轻链CDR1、本文中讨论的轻链CDR2和本文中讨论的轻链CDR3的至少一个CDR。此外，在一些实施方案中，抗CSF1R抗体轻链包含至少一个基于本文中讨论的CDR的突变型CDR，其中所述突变型CDR包含相对于本文中讨论的CDR的1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。本领域技术人员可以针对特定的CDR序列选择一个或多个合适的保守氨基酸取代，其中所述合适的保守氨基酸取代预计不会显著地改变包含所述突变型CDR的轻链的结合性质。
在一些实施方案中，轻链包含人轻链恒定区。在一些实施方案中，人轻链恒定区选自人κ和人λ轻链恒定区。
其它示例性CSF1R结合分子
在一些实施方案中，提供结合CSF1R的其它分子。这些分子包括但不限于非典型构架，如抗运载蛋白(anti‑calins)、粘附素(adnectins)、锚蛋白(ankyrin)重复序列等。参见，例如Hosse等，Prot.Sci.15：14(2006)；Fiedler，M.和Skerra，A.，“Non‑Antibody Scaffolds，”在Handbook of Therapeutic Antibodies Dubel，S.编著，Wiley‑VCH，Weinheim，Germany，2007中的第467‑499页。
抗CSF1R抗体的示例性性质
在一些实施方案中，具有上述结构的抗体以小于1nM的结合亲和力(KD)与CSF1R结合，阻断CSF1和/或IL34与CSF1R的结合，并且抑制CSF1和/或IL34诱导的CSF1R磷酸化。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体与CSF1R的胞外结构域(CSF1R‑ECD)结合。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体对CSF1R的结合亲和力(KD)小于1nM、小于0.5nM、小于0.1nM或小于0.05nM。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体具有介于0.01和1nM之间、介于0.01和0.5nM之间、介于0.01和0.1nM之间、介于0.01和0.05nM之间或介于0.02和0.05nM之间的KD。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体阻断配体与CSF1R结合。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体阻断CSF1与CSF1R结合。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体阻断IL34与CSF1R结合。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体同时阻断CSF1和IL34与CSF1R结合。在一些实施方案中，阻断配体结合的抗体与CSF1R的胞外结构域结合。当使用实施例7中描述的测定，抗体使配体与CSF1R的可检测的结合的量降低至少50％时，该抗体被认为“阻断配体与CSF1R结合”。在一些实施方案中，使用实施例7中描述的测定，抗体使配体与CSF1R的可检测的结合的量降低至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在这些实施方案的一些中，据称抗体阻断配体结合的至少50％、至少60％、至少70％等。
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体抑制配体诱导的CSF1R磷酸化。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体抑制CSF1诱导的CSF1R磷酸化。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体抑制IL34诱导的CSF1R磷酸化。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体同时抑制CSF1诱导和IL34诱导的CSF1R磷酸化。当使用实施例6中描述的测定，抗体使可检测的配体诱导的CSF1R磷酸化的量降低至少50％时，该抗体被认为“抑制配体诱导的CSF1R磷酸化”。在一些实施方案中，使用实施例6中描述的测定，抗体使可检测的配体诱导的CSF1R磷酸化的量降低至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在这些实施方案的一些中，据称抗体抑制配体诱导的CSF1R磷酸化的至少50％、至少60％、至少70％等。
在一些实施方案中，抗体抑制CSF1和/或IL34存在下的单核细胞增殖和/或存活反应。当使用实施例10中描述的测定，抗体使CSF1和/或IL34存在下的单核细胞增殖和/或存活反应的量降低至少50％时，该抗体被认为“抑制单核细胞增殖和/或存活反应”。在一些实施方案中，使用实施例10中描述的测定，抗体使CSF1和/或IL34存在下的单核细胞增殖和/或存活反应的量降低至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在这些实施方案的一些中，抗体据称抑制单核细胞增殖和/或存活反应的至少50％、至少60％、至少70％等。
示例性抗体偶联物
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体与标记物和/或细胞毒性剂偶联。本文中使用的标记物是有助于检测抗体和/或有助于检测抗体所结合的分子的部分。非限制性示例标记物包括但不限于放射性同位素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素、表位标签、金属结合标签等。本领域技术人员可以根据计划的应用选择合适的标记物。
本文中使用的细胞毒性剂是降低一种或多种细胞的增殖能力的部分。当细胞增殖的可能性降低时，例如，因为细胞经历细胞凋亡或以其它方式死亡，细胞未能通过细胞周期和/或未能分裂、细胞分化等，细胞就具有降低的增殖能力。非限制性示例细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素、毒素和化学治疗剂。本领域技术人员可以根据计划的应用选择合适的细胞毒性剂。
在一些实施方案中，标记物和/或细胞毒性剂在体外使用化学方法与抗体偶联。偶联的非限制性示例化学方法在本领域是已知的，并且包括可从例如Thermo Scientific Life Science Research Produces(先前为Pierce；Rockford，IL)、Prozyme(Hayward，CA)、SACRI AntibodyServices(Calgary，Canada)、AbD Serotec(Raleigh，NC)等购得的服务、方法和/或试剂。在一些实施方案中，当标记物和/或细胞毒性剂是多肽时，标记物和/或细胞毒性剂可以与至少一个抗体链由同一表达载体表达，以产生包含与抗体链融合的标记物和/或细胞毒性剂的多肽。本领域技术人员可以根据计划的应用选择用于将标记物和/或细胞毒性剂与抗体偶联的合适的方法。
示例性前导序列
为了大量地表达和分泌一些分泌型蛋白质，可能需要来自异源蛋白质的前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自SEQ ID NO：3和4，它们分别是轻链和重链前导序列。在一些实施方案中，使用异源前导序列可能是有利的，原因在于在分泌过程中在ER中除去前导序列时所得成熟多肽可以保持不变。为了表达和分泌一些蛋白质，可能需要添加异源前导序列。
某些示例性前导序列序列描述于例如由新加坡国立大学(National University of Singapore)的生物化学系维护的在线前导序列数据库(online Leader sequence Database)中。参见Choo等，BMCBioinformatics，6：249(2005)；以及PCT公布No.WO 2006/081430。
编码抗CSF1R抗体的核酸分子
提供包含编码抗CSF1R抗体的一个或多个链的多核苷酸的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗CSF1R抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子同时包含编码抗CSF1R抗体的重链的多核苷酸和编码抗CSF1R抗体的轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在这些实施方案的一些中，重链和轻链是由一个核酸分子表达或由两个单独的核酸分子表达为两个单独的多肽。在一些实施方案中，如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码同时包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
在一些实施方案中，编码抗CSF1R抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在被翻译时，位于重链或轻链的N端。如上所述，前导序列可以是天然重链或轻链前导序列，或者可以是另一异源前导序列。
核酸分子可以使用本领域惯用的重组DNA技术来构建。在一些实施方案中，核酸分子是适于在所选择的宿主细胞中表达的表达载体。
抗CSF1R抗体表达和制备
载体
提供包含编码抗CSF1R重链和/或抗CSF1R轻链的多核苷酸的载体。还提供包含编码抗CSF1R重链和/或抗CSF1R轻链的多核苷酸的载体。这些载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链和轻链由载体表达为两个单独的多肽。在一些实施方案中，重链和轻链被表达为单个多肽的一部分，例如，当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的第一多核苷酸并且第二载体包含编码轻链的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以相似的量(如相似的摩尔量或相似的质量量)转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，介于5∶1和1∶5之间的摩尔或质量比的第一载体和第二载体被转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，使用介于1∶1和1∶5之间的质量比的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，使用1∶2的质量比的编码重链的载体和编码轻链的载体。
在一些实施方案中，选择经过优化以供在CHO或CHO来源的细胞中或在NSO细胞中表达多肽的载体。示例性的这些载体描述于例如Running Deer等，Biotechnol.Prog.20：880‑889(2004)中。
在一些实施方案中，选择载体用于在动物(包括人)中体内表达抗CSF1R重链和/或抗CSF1R轻链。在这些实施方案的一些中，多肽的表达是受到以组织特异性方式起作用的启动子的控制。例如，肝脏特异性启动子描述于例如PCT公布No.WO 2006/076288号中。
宿主细胞
在各种实施方案中，抗CSF1R重链和/或抗CSF1R轻链可以在原核细胞(如细菌细胞)中表达；或在真核细胞(如真菌细胞(如酵母菌)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。该表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞(包括COS 7细胞)；293细胞(包括293‑6E细胞)；CHO细胞(包括CHO‑S和DG44细胞)；细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，抗CSF1R重链和/或抗CSF1R轻链可以在酵母菌中表达。参见，例如美国公布No.US 2006/0270045A1。在一些实施方案中，基于对抗CSF1R重链和/或抗CSF1R轻链进行希望的翻译后修饰的能力选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽比在293细胞中产生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。
向希望的宿主细胞中引入一种或多种核酸可以通过任何方法实现，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE‑葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例方法描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。根据任何合适的方法，核酸可以短暂地或稳定地转染于希望的宿主细胞中。
在一些实施方案中，根据任何合适的方法，可以在已经工程化或转染有编码多肽的一种或多种核酸分子的动物中体内制备一种或多种多肽。
抗CSF1R抗体的纯化
抗CSF1R抗体可以通过任何合适的方法来纯化。这些方法包括但不限于使用亲和基质或疏水性相互作用色谱法。合适的亲和配体包括CSF1R ECD和结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或抗体亲和柱可以用于结合恒定区和纯化抗CSF1R抗体。疏水性相互作用色谱法例如丁基或苯基柱也可以适于纯化一些多肽。纯化多肽的许多方法在本领域是已知的。
抗CSF1R抗体的无细胞制备
在一些实施方案中，抗CSF1R抗体是在无细胞系统中制备。非限制性示例无细胞系统描述于例如Sitaraman等，Methods Mol.Biol.498：229‑44(2009)；Spirin，Trends Biotechnol.22：538‑45(2004)；Endo等，Biotechnol.Adv.21：695‑713(2003)中。
治疗组合物和方法
使用抗CSF1R抗体治疗疾病的方法
提供用于在人或动物的治疗方法中使用的本发明的抗体和包含本发明抗体的组合物。还提供包括施用抗CSR1R抗体的治疗疾病的方法。可以用抗CSF1R抗体治疗的非限制性示例疾病包括但不限于RA、MS、癌症、转移诱导的溶骨性骨质缺失、溶骨病症和高血钙诱导的骨质缺失。
在一些实施方案中，提供包括施用抗CSF1R抗体的治疗炎症性病状的方法。在一些实施方案中，炎症性病状选自牛皮癣、SLE(狼疮)、COPD、特应性皮炎和动脉粥样硬化、巨噬细胞活化综合征和组织细胞增多症X。
在一些实施方案中，提供包括施用抗CSF1R抗体的治疗炎症性病状的方法，其中所述炎症性病状选自：增生性血管疾病、急性呼吸窘迫综合征、细胞因子介导的毒性、白细胞介素‑2毒性、阑尾炎、消化性、胃和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性、伪膜性、急性和缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失弛缓症、胆管炎、胆囊炎、肝炎、炎症性肠病、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、肠炎、惠普尔氏病(Whipple′s disease)、哮喘、过敏症、过敏性休克、免疫复合物病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒症、败血病、内毒素休克、恶病质、高热、嗜酸粒细胞性肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、附睾炎、阴道炎、前列腺炎、尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、囊性纤维化、肺炎、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、流感、呼吸道合胞病毒感染、疱疹感染、HIV感染、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、散播性菌血症、登革热(Dengue fever)、念珠菌病、疟疾、丝虫病、阿米巴病、包虫囊肿、烧伤、皮炎、皮肌炎、晒伤、荨麻疹、疣、风疹块、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、风湿热、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、乳糜泻、充血性心力衰竭、脑膜炎、脑炎、脑梗塞、脑栓塞、格林‑巴利综合征(Guillain‑Barre syndrome)、神经炎、神经痛、脊髓损伤、麻痹、葡萄膜炎、关节炎性皮疹、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病(Paget’sdisease)、痛风、牙周病、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、贝赫切特氏综合征(Behcets’s syndrome)、同种异体移植排斥、移植物抗宿主疾病、强直性脊柱炎、伯格氏病(Berger’s disease)、1型糖尿病、2型糖尿病、伯格氏病、瑞特氏综合征(Retier’s syndrome)和霍奇金病，或在治疗与这些病状有关的炎症中。
在一些实施方案中，提供包括施用抗CSF1R抗体的治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述癌症是分泌CSF1的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌、子宫颈癌和卵巢癌的一种或多种癌症。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体可用于治疗选自肺癌、结肠直肠癌、脑癌、胰腺癌、头颈癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、胃癌和肺腺癌的一种或多种癌症。
施用途径和载剂
在各种实施方案中，抗CSF1R抗体可以通过各种途径体内施用，包括但不限于口服、动脉内、肠胃外、鼻内、肌肉内、心脏内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、透皮和鞘内施用，或另外通过植入或吸入施用。可以将主题组合物配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏剂、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。可以将编码抗CSF1R抗体的核酸分子涂在金微粒上并且通过如在文献(参见，例如Tang等，Nature 356：152‑154(1992))中描述的粒子轰击装置或“基因枪”皮内递送。适当的制剂和施用途径可以根据计划的应用进行选择。
在各种实施方案中，包含抗CSF1R抗体的组合物以具有多种可药用的载剂的制剂提供(参见，例如Gennaro，Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus，第20版，(2003)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。有多种可药用的载剂(其包括媒剂、佐剂和稀释剂)可用。此外，多种可药用的辅助物质如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等也是可用的。非限制性示例载剂包括盐水、缓中盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和其组合。
在各种实施方案中，包含抗CSF1R抗体的组合物可以通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(如植物油或其它油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中；并且必要时可同常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起，来配制用于注射(包括皮下施用)。在各种实施方案中，组合物可以例如使用加压的可接受的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等配制用于吸入。在各种实施方案中，也可以将组合物配制成缓释微囊，如用生物可降解或非生物可降解聚合物配制。非限制性示例生物可降解制剂包括聚乳酸‑乙醇酸聚合物。非限制性示例非生物可降解制剂包括聚甘油脂肪酸酯。制备这些制剂的某些方法描述于例如EP 1125584A1中。
还提供包含一个或多个容器的药物包装和试剂盒，所述容器各自含有一种或多种剂量的抗CSF1R抗体。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中所述单位剂量含有预定量的包含抗CSF1R抗体的组合物(有或没有一种或多种其它药剂)。在一些实施方案中，该种单位剂量在用于注射的单次使用预装填注射器中提供。在各种实施方案中，单位剂量中所含的组合物可以含有盐水、蔗糖等；缓中剂如磷酸盐等；和/或配制成处于稳定和有效的pH值范围内。或者，在一些实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，所述冻干粉末可以在添加适当的液体(例如无菌水)时复原。在一些实施方案中，组合物包含抑制蛋白质聚集的一种或多种物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。在一些实施方案中，本发明的组合物包含肝素和/或蛋白多糖。
药物组合物以有效治疗或预防特定的适应症的量施用。治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的体重、他或她的身体或健康状况、待治疗的病状的程度或所治疗的受试者的年龄。一般来讲，抗CSF1R抗体可以以每剂每公斤体重约10μg至每公斤体重约100mg范围内的量施用。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体可以以每剂每公斤体重约50μg至每公斤体重约5mg范围内的量施用。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体可以以每剂每公斤体重约100μg至每公斤体重约10mg范围内的量施用。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体可以以每剂每公斤体重约100μg至每公斤体重约20mg范围内的量施用。在一些实施方案中，抗CSF1R抗体可以以每剂每公斤体重约0.5mg至每公斤体重约20mg范围内的量施用。
抗CSF1R抗体组合物可以按需要对受试者施用。施用频率可以由本领域技术人员如主治医师根据以下考虑因素来确定：所治疗的病状、所治疗的受试者的年龄、所治疗的病状的严重程度、所治疗的受试者的总体健康状态等。在一些实施方案中，对受试者施用一次或多次有效剂量的抗CSF1R抗体。在各种实施方案中，对受试者一月一次、一月一次以上(例如两个月一次或三个月一次)施用有效剂量的抗CSF1R抗体。在其他实施方案中，少于一月一次(例如两周一次或每周一次)施用有效剂量的抗CSF1R抗体。对受试者至少一次施用有效剂量的抗CSF1R抗体。在一些实施方案中，可以多次施用有效剂量的抗CSF1R抗体，包括持续至少一个月、至少六个月或至少一年的时期。
组合疗法
抗CSF1R抗体可以单独施用或与其它治疗方式一起施用。其可以在其它治疗方式(例如手术、化学疗法、放射疗法或施用生物剂，如另一种治疗性抗体)之前、基本上同时或之后提供。对于类风湿性关节炎的治疗，抗CSF1R抗体可以与其它治疗剂一起施用，这些治疗剂例如有甲氨蝶呤、抗TNF剂如英利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、戈利木单抗(Simponi)和恩博(Enbrel)；糖皮质激素如泼尼松(prednisone)；来氟米特(Leflunomide)；硫唑嘌呤(Azothioprine)；JAK抑制剂如CP 590690；SYK抑制剂如R788；抗IL‑6抗体；抗IL‑6R抗体；抗CD‑20抗体；抗CD19抗体；抗GM‑CSF抗体；以及抗GM‑CSF‑R抗体。对于多发性硬化症的治疗，抗CSF1R抗体可以与其它治疗剂一起施用，这些治疗剂例如有干扰素α；干扰素β；泼尼松；抗α4整联蛋白抗体如那他珠单抗(Tysabri)；抗CD20抗体如美罗华(Rituxan)；FTY720(芬戈莫德(Fingolimod))；以及克拉屈滨(Cladribine)(Leustatin)。
实施例
仅希望以下讨论的实施例是本发明的示例并且无论如何不应该认为对本发明构成限制。不希望所述实施例表示以下实验是进行的全部或唯一的实验。虽然已经努力确保所使用的数值(例如量、温度等)的准确性，但是应该容许有一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度并且压力是处于大气压或接近大气压。
实施例1：结合CSF1R胞外结构域(ECD)的Fab的选择
将小鼠用人CSF1R胞外结构域Fc融合体，hCSF1RECD.506‑Fc(SEQ ID NO：6)免疫。从经过免疫的小鼠分离脾脏，并且从脾细胞建立Fab噬菌体展示库。选择表达Fab的噬菌体用于与人CSF1R ECD结合。从细菌中表达并纯化来自阳性结合噬菌体的Fab。选择总共1056个Fab克隆用于进一步分析。
针对结合人CSF1R ECD、阻断人CSF1与人CSF1R ECD结合以及阻断人IL34与人CSF1R ECD结合的能力筛选Fab。随后对从该筛选选择出的Fab进行序列分析和集簇并且选择某些独特的Fab。
针对结合人CSF1R ECD的能力、结合食蟹猴CSF1R ECD的能力以及结合小鼠CSF1R ECD的能力进一步分析所述独特的Fab。还针对在CSF1或IL34存在下阻断人CSF1结合人CSF1R ECD的能力和阻断人IL34结合人CSF1R ECD的能力以及抑制配体诱导的CSF1R磷酸化的能力分析Fab。(数据未展示)。
实施例2：重构(Reformatting)抗CSF1R Fab以制备嵌合抗体
Fab表征之后，选择十一个Fab用于重构成嵌合抗体。各Fab重构成包含具有S241P突变的人IgG4重链恒定区和人κ轻链恒定区的嵌合抗体。简单地说，Fab VH区被克隆到载体pTT5(BiotechnologyResearch Institute，Montreal，Canada；以及National Research ResearchCouncil of Canada，Ottawa，Canada)中并且由载体pTT5表达，所述载体pTT5经修饰成含有小鼠IgH前导序列(SEQ ID NO：4)和具有S241P突变的人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：94)。Fab VL区被克隆到载体pTT5中并且从载体pTT5中表达，所述载体pTT5经修饰成含有小鼠Igκ前导序列(SEQ ID NO：3)和人Igκ轻链恒定区(SEQ ID NO：95)。以不导致将非抗体来源的氨基酸序列引入最终蛋白质中的方式插入FabV区。
实施例3：嵌合抗体的表达和表征
基本上如以下实施例5中所描述，进行嵌合抗体的瞬时表达和纯化。
针对与人、食蟹猴和小鼠CSF1R ECD的结合对所述11个嵌合抗体进行测定。还针对在CSF1或IL34存在下阻断人CSF1结合人CSF1R ECD的能力、阻断人IL34结合人CSF1R ECD的能力、阻断人CSF1结合食蟹猴CSF1R ECD的能力以及抑制配体诱导的CSF1R磷酸化的能力对嵌合抗体进行测定。针对与细胞表面上的CSF1R的结合进一步对嵌合抗体进行测定。最后，对嵌合抗体进行测定以确认它们在没有配体存在下不诱导CSF1R磷酸化。(数据未展示)。
实施例4：抗CSF1R抗体的人源化
根据上述分析，选择嵌合抗CSF1R抗体0301、0302和0311用于人源化。通过改变重链及轻链可变区的框架区中的某些氨基酸残基将抗体人源化。用于人源化的标准如先前例如在美国公布No.US2009/0136500中所描述。
对于cAb 0301，设计了三个人源化重链可变区和两个人源化轻链可变区，总共六个人源化抗体，Ab1至Ab6。对于cAb 0302，设计了两个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，总共六个人源化抗体，Ab7至Ab12。对于cAb 0311，设计了两个人源化重链可变区和两个人源化轻链可变区，总共四个人源化抗体，Ab13至Ab16。
人源化重链可变区和人源化轻链可变区各自的序列与亲本嵌合抗体可变区的序列和人受体可变框架区的序列的比对在图1(重链)和2(轻链)中展示。人源化可变区序列中相对于人受体可变框架区的变化被框出。各可变区的各CDR在加方框的区域中展示，并且在加方框的序列上方标记为“CDR”。
以下表8展示抗体Ab1至Ab16的人源化重链和人源化轻链的完整序列。这些抗体各自的人源化重链和人源化轻链的名称和SEQ IDNO：在表2中展示。
表2：Ab1至Ab16的人源化重链和轻链
人源化抗体人源化HCSEQ ID NO人源化LCSEQ ID NOAb1h0301‑H053h0301‑L060Ab2h0301‑H154h0301‑L060Ab3h0301‑H255h0301‑L060Ab4h0301‑H053h0301‑L161Ab5h0301‑H154h0301‑L161Ab6h0301‑H255h0301‑L161Ab7h0302‑H156h0302‑L062Ab8h0302‑H156h0302‑L163Ab9h0302‑H156h0302‑L264Ab10h0302‑H257h0302‑L062Ab11h0302‑H257h0302‑L163Ab12h0302‑H257h0302‑L264Ab13h0311‑H158h0311‑L065Ab14h0311‑H158h0311‑L166Ab15h0311‑H259h0311‑L065Ab16h0311‑H259h0311‑L166
实施例5：结合人和食蟹猴CSF1R ECD而不结合小鼠CSF1RECD的人源化抗CSF1R抗体
如下在CHO细胞中瞬时表达16个人源化抗体。使用DNA∶PEI比为1∶5的聚亚乙基亚胺(PEI)以1重链质粒与2轻链质粒的质量比将CHO‑3E7细胞用个别重链及轻链表达质粒共转染。每次转染使用的总DNA是每毫升细胞1.5μg。
使用HiTrap蛋白质A HP柱(GE Healthcare)从经过转染的细胞上清液中纯化人源化抗体，随后使用苯基HP柱(GE Healthcare)进一步纯化。将含有抗体的上清液装载到预先用PBS/0.5M NaCl平衡的HiTrap蛋白质A HP柱上。用10柱体积PBS/0.5M NaCl洗涤装载抗体的柱，并且用混合的0.1M甘氨酸(pH 2.7)/0.5M NaCl线性阶段梯度直接洗脱至100μl的1M Tris缓冲液(pH 8.0)中。将含有抗体的洗脱液针对PBS进行透析，随后添加2.4M(NH4)2SO4(Sigma)以获得等于10mM磷酸钾(pH 7.0)/1.2M(NH4)2SO4的电导率。随后将抗体装载到预先用10mM磷酸钾(pH7.0)/1.2M(NH4)2SO4平衡的1ml苯基HP柱(GE Healthcare)上。用15柱体积10mM磷酸钾(pH 7.0)/1.2M(NH4)2SO4洗涤装载抗体的柱，并且用20柱体积10mM磷酸钾(pH 7.0)梯度洗脱。汇集含有抗体的洗脱份并且针对PBS进行透析。
如下测定人源化抗体以及其亲本嵌合抗体(cAb)与人、食蟹猴和小鼠CSF1R ECD的结合。
人CSF1R结合活性
用含1μg/ml重组hCSF1R ECD.506‑Fc(SEQ ID NO：6；FivePrimeTherapeutics)或人M‑CSF RFc嵌合体(R&D Systems)的PBS涂布96孔透明底部ELISA板过夜。次日早晨，用含0.05％Tween20的PBS(PBST)将孔洗涤四次并且用Blocker‑Blotto(Pierce)阻断。将50μl人源化抗体或亲本嵌合抗体的0.5x连续稀释液(从2000ng/ml开始，在Blocker‑Blotto中1∶1稀释)添加至经过CSF1R涂布的孔中。在室温(RT)下孵育90分钟之后，用PBST将孔洗涤四次，并且向各孔中添加过氧化酶偶联的山羊抗人κ轻链抗体(Sigma)于Blocker‑Blotto中的1∶5000稀释液。在室温下孵育60分钟之后，用PBST将孔洗涤四次，并且向各孔中添加50μl邻苯二胺二盐酸盐过氧化酶底物(Sigma)。在室温下孵育30分钟之后，直接在SpectraMaxPlus分光光度计上用SoftMaxPro软件(Molecular Devices)读取各孔的A450值。
该实验的结果在图3中展示。在所测试的浓度范围内，所有人源化抗体都与人CSF1R ECD结合。
食蟹猴CSF1R结合曲线
除了透明底部ELISA板的孔用2μg/ml重组cynoCSF1RECD‑Fc(FivePrime Therapeutics，SEQ ID NO：8，但是没有19个氨基酸的前导序列)涂布过夜之外，如上对于人CSF1R所述测定各人源化抗体与食蟹猴CSF1R ECD结合的结合曲线。
该实验的结果在图4中展示。在所测试的浓度范围内，所有人源化抗体都与食蟹猴CSF1R ECD结合。
小鼠CSF1R结合曲线
除了透明底部ELISA板的孔用2μg/ml重组mCSF1RECD‑Fc(FivePrime Therapeutics，SEQ ID NO：93)涂布过夜之外，如上对于人CSF1R所述测定各人源化抗体与小鼠CSF1R ECD结合的结合曲线。
该实验的结果在图5中展示。在所测试的浓度范围内，人源化抗体或亲本嵌合抗体都没有检测到与小鼠CSF1R ECD结合。
EC50的计算
表3展示使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software)的非线性回归(曲线‑拟合)分析算法计算的各人源化抗体与人CSF1R ECD和食蟹猴CSF1R ECD结合的EC50。因为没有检测到嵌合抗体与小鼠CSF1R ECD的结合，所以不能从该数据计算出EC50。表3还包括对于亲本嵌合抗体计算的EC50。
表3：人源化抗CSF1R抗体的结合活性

实施例6：人源化抗CSF1R抗体抑制配体诱导的CSF1R磷酸化
CSF1R在配体CSF1或IL34存在下磷酸化。如下测试人源化抗体以及其亲本嵌合抗体(cAb)抑制由任一配体诱导的CSF1R磷酸化的能力。
抑制CSF1诱导的磷酸化
将经过CSF1R(SEQ ID NO：2)转染的CHO细胞与各人源化抗体或亲本嵌合抗体的连续稀释液(从8μg/ml开始)在冰上一起孵育60分钟，随后向所述细胞中添加3.3nM人CSF1(M‑CSF，R&D Systems)。(对于人源化抗体的0301系列，使用从2μg/ml人源化抗体和亲本嵌合抗体开始的连续稀释液。)将细胞在37下孵育3分钟，并且随后通过添加1/10x体积的10x细胞裂解缓中液(Cell Signaling Technology)进行裂解。按照制造商的说明，使用人磷酸化M‑CSF R ELISA试剂盒(R&D Systems)对细胞裂解物中磷酸化CSF1R的量进行定量。
该实验的结果在图6A至6C中展示。在所测试的浓度范围内，所有人源化抗体均能够抑制人CSF1诱导的人CSF1R ECD的磷酸化。
抑制IL34诱导的磷酸化
将经过CSF1R(SEQ ID NO：2)转染的CHO细胞与0.002至8μg/ml的各人源化抗体或亲本嵌合抗体在冰上一起孵育60分钟，随后向所述细胞中添加3.3nM人IL34(FivePrime Therapeutics；SEQ ID NO：68)。将细胞在37下孵育3分钟，并且随后通过添加1/10x体积的10x细胞裂解缓中液(Cell Signaling Technology)进行裂解。按照制造商的说明，使用人磷酸化M‑CSF R ELISA试剂盒(R&D Systems)对细胞裂解物中磷酸化CSF1R的量进行定量。
该实验的结果在图7A至7C中展示。在所测试的浓度范围内，所有人源化抗体均能够抑制人IL34诱导的人CSF1R的磷酸化。
实施例7：人源化抗CSF1R抗体阻断人CSF1和人IL34与人和食蟹猴CSF1R的结合
人CSF1/CSF1R阻断活性
如下测试人源化抗体以及亲本嵌合抗体(cAb)阻断人CSF1与人和食蟹猴CSF1R ECD结合的能力。
使用NH2‑生物素标记试剂盒(Dojindo Molecular Technologies)将重组人CSF1(M‑CSF；R&D Systems)生物素化。按照制造商的说明，将100μl含1μg/ml生物素化CSF1的PBST/0.1％BSA添加至预先用SuperBlock阻断缓冲液(Pierce)阻断的Reacti‑Bind抗生蛋白链菌素涂布的板(Pierce)的孔中。将50μl人源化抗体或亲本嵌合抗体的0.5x连续稀释液(从2000ng/ml开始)与含50ng/ml hCSF1R ECD.506‑Fc(SEQID NO：6；FivePrime Therapeutics)或50ng/ml cynoCSF1RECD‑Fc(FivePrime Therapeutics，SEQ ID NO：8，但是没有19个氨基酸的前导序列)的100μl PBST/0.1％BSA一起在室温下孵育90分钟，随后将所述混合物转移至配体涂布的板的一个或多个孔中。在室温下90分钟之后，用PBST洗涤孔，并且向各孔中添加Fc片段特异性过氧化酶偶联的山羊抗人IgG(Jackson Immuno Research)于PBST/0.1％BSA中的1∶5000稀释液。在室温下孵育60分钟之后，用PBST/0.1％BSA洗涤孔，并且向各孔中添加邻苯二胺二盐酸盐过氧化酶底物(Sigma)。在室温下孵育30分钟之后，直接在SpectraMaxPlus分光光度计上用SoftMaxPro软件(Molecular Devices)读取各孔的A450值。
食蟹猴CSF1R的该实验的结果在图8A至8C中展示。在所测试的浓度范围内，基于Fab 0301和0311的所有人源化抗体均能够阻断人CSF1与食蟹猴CSF1R ECD结合。与cAb 0302的阻断活性相比，基于Fab 0302的人源化抗体都没有在该实验中显示类似的阻断活性。
人IL34/CSF1R阻断活性
测试人源化抗体阻断人IL34与人CSF1R ECD结合的能力。除了使用NH2‑生物素标记试剂盒(Dojindo Molecular Technologies)将重组人IL34(FivePrime Therapeutics；SEQ ID NO：68)生物素化之外，如上对于阻断CSF1所述测定各人源化抗体的阻断活性，并且随后按照制造商的说明，将100μl含1μg/ml生物素化重组IL34的PBST/0.1％BSA添加至预先用SuperBlock阻断缓冲液(Pierce)阻断的Reacti‑Bind抗生蛋白链菌素涂布的板(Pierce)的孔中。
食蟹猴CSF1R的该实验的结果在图9A至9C中展示。在所测试的浓度范围内，基于Fab 0301和0311的所有人源化抗体均能够阻断人IL34与食蟹猴CSF1R ECD结合。与cAb 0302的阻断活性相比，基于Fab 0302的人源化抗体都没有在该实验中显示类似的阻断活性。
IC50的计算
表4展示使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software)的非线性回归(曲线‑拟合)分析算法计算的各人源化抗体抑制配体诱导的CSF1R磷酸化的IC50。表4还展示使用GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware)的非线性回归(曲线‑拟合)分析算法计算的各人源化抗体阻断配体与CSF1R ECD结合的IC50。最后，表4展示各人源化抗体的轻链和重链的框架区中回复突变为相应小鼠氨基酸残基的氨基酸的数目。例如，人源化抗体h0301L1H1在轻链框架区中具有一个回复突变为小鼠氨基酸的氨基酸和在重链框架区中具有一个回复突变为小鼠氨基酸的氨基酸。参考图1和2，根据Kabat编号，轻链框架中回复突变的氨基酸在框架1中的位置1，重链中回复突变的氨基酸在框架3中的位置71(参见图1B)。
表4：人源化抗CSF1R抗体的阻断活性


实施例8：人源化抗CSF1R抗体结合常数
如下测定各人源化抗体与人CSF1R ECD结合的ka、kd和KD。
使用Biacore T100表面等离子元共振(SPR)(GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NY)测定抗CSF1R人源化抗体与CSF1R ECD的结合动力学。在150RU下使用人抗体捕捉试剂盒(GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NY)将各人源化抗CSF1R抗体捕捉于用抗人IgG抗体固定的CM5传感器芯片上，以便使hCSF1R ECD.506(SEQ ID NO：5)结合的Rmax值为100RU。对于精确测定动力学值，推荐的Rmax值小于150RU。使用含0.05％Tween20的10mM Hepes缓冲盐水(pH7.4)(HPS‑P；GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NY)作为操作和稀释缓冲液。以六种浓度(90nM、30nM、10nM、3.33nM、1.11nM和0nM)注射hCSF1R ECD.506持续2分钟，并且观察解离5分钟以测定人源化抗体/hCSF1R ECD结合动力学参数。使用Biacore T100评估软件包用1∶1结合模型计算各Fab针对人CSF1R ECD的缔合常数、解离常数、亲和力和结合能力。
动力学测定的结果在表5中展示。
表5：人源化抗体对于人CSF1R的结合亲和力
huAbAbka(M‑1s‑1)Kd(s‑1)KD(nM)huAb 0301‑L0H03.22x1061.11x10‑030.35huAb 0301‑L0H13.56x1061.22x10‑030.34huAb 0301‑L0H22.32x1066.60x10‑040.28huAb 0301‑L1H03.29x1061.15x10‑030.35huAb 0301‑L1H12.87x1069.21x10‑040.32huAb 0301‑L1H22.95x1067.42x10‑040.25huAb 0302‑L0H13.54x1063.69x10‑031.04huAb 0302‑L1H13.47x1064.04x10‑031.17huAb 0302‑L2H11.60x1069.14x10‑040.57huAb 0302‑L0H23.40x1061.79x10‑030.53huAb 0302‑L1H22.71x1061.53x10‑030.56huAb 0302‑L2H21.84x1068.40x10‑040.46huAb 0311‑L0H11.22x1065.40x10‑040.44huAb 0311‑L1H11.32x1066.64x10‑040.50huAb 0311‑L0H21.34x1064.73x10‑040.35huAb 0311‑L1H21.51x1066.09x10‑040.40
除两个之外的所有人源化抗体都显示对人CSF1R ECD具有低于纳摩尔浓度的结合亲和力，并且其余两个人源化抗体显示对人CSF1RECD的结合亲和力小于2nM。
实施例9：人源化抗CSF1R抗体阻断配体诱导的磷酸化
基于以上数据，包括CSF1R结合和配体抑制以及各人源化抗体的免疫原性的可能性，选择三种人源化抗体用于进一步研究：0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1。
确认0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1各自与细胞表面上的CSF1R结合之后(数据未展示)，测试各抗体阻断CHO细胞中配体诱导的CSF1R磷酸化的能力，如实施例6中所描述。
该实验的结果在图10中展示。所测试的所有三种人源化抗体均阻断CHO细胞中CSF1诱导的(A)和IL34诱导的(B)CSF1R磷酸化。
表6展示各抗体阻断配体诱导的CSF1R磷酸化的IC50。
表6：人源化抗体的配体诱导的磷酸化阻断IC50

实施例10：人源化抗CSF1R抗体阻断原代人单核细胞的配体诱导的增殖/存活反应
如下测试人源化抗体0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1阻断配体诱导的单核细胞增殖/存活反应的能力。
根据制造商的说明，通过离心至Ficoll‑Paque缓中器(GEHealthcare Bio‑Sciences)上来从健康供体分离人周边血液单核细胞(PBMC)。随后通过离心至48.5％PercollTM缓冲器(GE HealthcareBio‑Sciences)上来从回收的PBMC部分分离周边血液单核细胞。从PercollTM缓冲器回收之后，在存在或不存在人源化抗体0301‑L0H0、人源化抗体0301‑L1H0或人源化抗体0311‑L0H1的连续稀释液的情况下，用162pM重组人CSF1或1.6nM重组人IL34(均来自R&DSystems)刺激纯化的周边血液单核细胞。在37下孵育48小时之后，按照制造商的说明使用试剂(Promega)评价各个别培养物的相对细胞ATP含量。在该测定中，相对细胞ATP含量与培养物中的活细胞数目成正比，并且因此反映单核细胞增殖/存活反应。
该实验的结果在图11中展示。所测试的所有三种人源化抗体在CSF1(A)或IL34(B)刺激之后均能够阻断单核细胞增殖/存活反应。表7展示各抗体阻断配体诱导的单核细胞增殖/存活反应的IC50。表7中所示的值表示从所测试的三个不同原代供体观察到的范围。
表7：人源化抗体的单核细胞增殖/存活阻断IC50

实施例11：人源化抗CSF1R抗体不直接促进原代人单核细胞增殖或存活反应
如下测试人源化抗体0301‑L0H0、0301‑L1H0和0311‑L0H1直接刺激原代单核细胞增殖和/或存活的能力。
如实施例10中所述分离人周边血液单核细胞。在没有外源CSF1或外源IL34刺激存在下，将人源化抗体0301‑L0H0、人源化抗体0301‑L1H0或人源化抗体0311‑L0H1的连续稀释液添加至单核细胞中。在37下孵育48小时之后，如实施例10中使用试剂(Promega)评价各个别培养物的相对ATP含量。该实验在来自三个不同供体的周边血液单核细胞上进行。
该实验的结果在图12中展示。在所测试的任一原代单核细胞制剂中，人源化抗体均不刺激原代单核细胞增殖或存活。
序列表
表8提供本文中讨论的某些序列。除非另外指出，否则展示的所有多肽和抗体都没有前导序列。
表8：序列和描述