一种具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌 【技术领域】
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌。
背景技术
有机磷农药是国内外广泛生产和使用的农药产品，是目前保证农业高产稳产的重要措施之一。目前，甲胺磷、甲基对硫磷、乐果、马拉硫磷、敌百虫、敌敌畏、氧化乐果、对硫磷、毒死蜱等有机磷农药，占据我国农药的主导市场.虽然国家已出台有关措施限制甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷胺等五种高毒有机磷农药的生产与销售，但是由于有机磷农药的长期超量施用，致使目前有机磷农药的污染成为了农业生产环境中最严重的污染源之一，研究表明，有机磷农药具有诱变性和致畸胎性，哺乳动物的神经和免疫系统疾病大多与有机磷农药相关，这些疾病包括疯牛病、海湾战争综合症、帕金森综合症等。有机磷农药在土壤中发生积累迁移，导致农产品中农药残留超标，引发食品安全问题，也制约了我国农产品的出口。如何消除有机磷农药对环境和人类的危害，已成为事关人类健康和国民经济发展的问题。因此迫切需要建立一种有效方法用于治理环境污染以及去除农产品的农药残留。与常规化学(强碱水解等)、物理(光降解等)降解方法效率低下，其水解产物也是环境的污染物相比，微生物降解有机磷农药具有费用低、环境影响小、可最大限度降低污染物浓度、降解彻底，可用于其他技术难以应用的场地等优点。农药的微生物降解是指在微生物作用下使农药的结构发生改变，导致农药的化学和物理性质改变的过程，通过将农药从大分子化合物降解为小分子化合物，最后成为H2O与CO2，实现对环境的无害化降解。在实际生产中，利用有机磷农药降解菌降解生态环境中的残留农药和农产品表面的农药污染，将可明显减少农民不必要的经济损失和所导致的社会问题；利用生物降解技术可以加速环境中外源污染物的降解，同时也是一种经济、高效且对生态环境安全的清洁手段。现已成为环境农药污染治理工作的热点。但是现有的有机磷农药降解菌对有机磷农药乐果的降解率仅为60％左右，对作物营养、抑病的作用未进行研究，功能单一，实际应用效果不稳，极大的限制了有机磷农药降解菌的使用。而现有的枯草芽孢杆菌菌株的菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。但目前具有机磷农药降解效果的枯草芽孢杆菌株未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是为了提供一种具备营养、抑病的功效，且对有机磷农药具有高降解率的枯草芽孢杆菌。
本发明具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10(Bacillus subtilis SbM-10)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.3583，保藏日期为2010年01月18日；枯草芽孢杆菌SbM-10为杆状，长为2.0～3.0微米，宽为0.7～0.8微米，链状排列，无荚膜，有芽孢；在牛肉膏蛋白胨培养基上粗糙，不透明，不闪光，蔓延，为污白色。
本发明具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10为革兰氏阳性菌，淀粉水解实验为阳性，V.P.试验为阳性，明胶穿刺表面液化呈漏斗状。
本发明具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10在肉汁琼斜面上生长丰厚，粗糙，不透明，蜡质，奶油色。
本发明具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10中的芽孢为圆形到圆柱形，中生到次端生，壁薄，在30hr内形成。
分别以卵磷脂和Ca3(PO4)2作为有机磷源、无机磷源对本发明的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10进行解磷性能的测定(测定方法参见农业行业标准NY412-2000)，测定结果显示在无机磷发酵液中，速效磷产生量为0.45％左右，有机磷发酵液中，速效磷产生量为1.5％左右，本发明的枯草芽孢杆菌SbM-10不仅能将有机磷或无机磷降解，还可将有机磷或无机磷转化成速效磷，为作物提供磷素营养，有利于农作物的吸收利用，对农作物的生长有良好的促进作用；通过降解有机磷农药实验可知：本发明的枯草芽孢杆菌SbM-10(Bacillus subtilis SbM-10)对有机磷农药的降解率达到了70％以上，与现有的机磷农药降解菌及其他枯草芽孢杆菌相比较，降解率高，本发明的枯草芽孢杆菌对有机磷农药的效果好。通过抑菌实验可知本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、拟枝孢镰刀菌Fusarium sporotrichiodes、交链孢菌Alternaria、灰葡萄孢属Thielaviopsisbasicola、棒孢属Corynespora和炭疽菌属Colletotrichum生长均有明显的抑制作用。
本发明地的枯草芽孢杆菌SbM-10从微生物肥料生产菌株中，筛选得到的，本发明的枯草芽孢杆菌对作物具有营养和抑病的同时，还对有机磷农药具有很好的降解作用，本发明的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10应用范围广泛，可延伸微生物肥料在生物修复领域的应用。
具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10(Bacillussubtilis SbM-10)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年01月18日，保藏号为CGMCC No.3583。
【附图说明】
图1为具体实施方式一中的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10的菌体的扫描电镜图。
【具体实施方式】
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10(Bacillus subtilis SbM-10)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.3583，保藏日期为2010年01月18日；枯草芽孢杆菌SbM-10为杆状，长为2.0～3.0微米，宽为0.7～0.8微米，链状排列，无荚膜，有芽孢；在牛肉膏蛋白胨培养基上粗糙，不透明，不闪光，蔓延，为污白色。
参照2007年由沈萍编写、高等教育出版社出版的《微生物学实验》和2004年由杨文博编写、化学工业出版社出版的《微生物学实验》对本实施方式的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10进行生理生化特性鉴定：枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，淀粉水解实验为阳性，V.P.试验为阳性，明胶穿刺表面液化呈漏斗状。
本实施方式的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10的最适生长温度为28～30℃。
本实施方式具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10的筛选方法按照以下方法进行：从活化好的微生物肥料菌株斜面中挑取1～2环，接种于含有质量浓度为40％的乐果的无机盐培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下振荡培养48～72hr，逐渐增大乐果在液体无机盐培养基中的质量比例，乐果占无机盐培养基的质量比依次为4‰、5‰、7‰、8‰，在培养的同时观察各菌体生长状况及发酵液浑浊程度，选取生长速度快，耐受性好的菌株，通过对发酵液中乐果残留量的测定，最终确定具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；其中无机盐培养基由0.2gNaCl、0.5g MgSO4、0.5g K2SO4、0.2gCaCO3、0.001g FeSO4和1000mlH2O组成。
本实施方式的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10的菌体的扫描电镜图如图1所示。
对本实施方式的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10进行解磷功效实验和抑病功效实验的功效实验，具体方法如下：
一、解磷功效实验
1、解磷功效实验(营养作用)：分别以卵磷脂作为有机磷源，Ca3(PO4)2为无机磷源，进行菌株解磷性能的测定(测定方法参见农业行业标准NY412-2000)，将枯草芽孢杆菌(本实施方式的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10)以0.5％接种量分别接种于有机磷或无机磷液体培养基中，在温度为30℃、转速为180r/min的条件下振荡培养72hr；取发酵液10ml加入适量无磷活性炭1g脱色，12000r/min低温离心20min，取5ml上清液，采用钼锑钪比色法，Lambda 20分光光度计680nm进行速效磷含量的测定，测定结果为无机磷发酵液中，速效磷含量为0.432％；有机磷发酵液中，速效磷含量为1.481％；本实施方式的枯草芽孢杆菌SbM-10不仅能将有机磷或无机磷降解，还可将有机磷或无机磷转化成速效磷，为作物提供磷素营养，有利于农作物的吸收，对农作的生长有良好的促进作用；本实施方式的枯草芽孢杆菌对作物具有明显的营养作用。
2、降解有机磷农药乐果
采用同样的实验方法，进行降解有机磷乐果功效实验。
第一组实验：分别用无机盐液体培养基和肉汤液体培养基进行试验；向无机盐液体培养基或肉汤液体培养基中按2‰质量百分比加入质量浓度为40％乐果(沙隆达郑州农药有限公司产)，其中无机盐液体培养由0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.2MgSO4、0.1gCaCl2、0.2gNaCl、0.0001gMnSO4、0.0001gFeCl3、1.0g(NH4)2SO4和1000mlH2O组成，肉汤液体培养基由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g NaCl和1000ml H2O组成。
第二组实验：分别用无机盐液体培养基和肉汤液体培养基进行试验；向无机盐液体培养基或肉汤液体培养基中按4‰质量百分比加入质量浓度为40％乐果(沙隆达郑州农药有限公司产)，其中无机盐液体培养由0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.2MgSO4、0.1gCaCl2、0.2gNaCl、0.0001gMnSO4、0.0001gFeCl3、1.0g(NH4)2SO4和1000mlH2O组成，肉汤液体培养基由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g NaCl和1000ml H2O组成。
这两组实验的具体操作如下：向培养基加入乐果后，将本实施方式的枯草芽孢杆菌SbM-10(Bacillus subtilis SbM-10)按照1％的接种量接入上述培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下振荡培养72hr；然后取发酵液10ml，加入20ml乙腈(气相色谱级)、2gNaCl充分震荡，静止30min，吸取10ml有机相，80℃水浴蒸发至干，加10ml丙酮(气相色谱级)溶解，用于气相色谱测定。
色谱条件：色谱仪Agilent 6890N；自动进样器Agilent 768；色谱柱50％聚苯基甲基硅氧烷(DB-17)，30m×0.53mm×1.0μm；进样口温度：220℃；检测器温度：250℃；柱温：150℃(保持2min)→250℃(保持12min)，升温速度8℃/min。气体及流量载气：氮气，纯度≥99.999％，流速为10mL/min。燃气：氢气，纯度≥99.999％，流速为75mL/min；助燃气：空气，流速为100mL/min。乐果的降解率测定方法参考中国农业行业标准NY/T 761-2008。这两组实验的测定结果如表2所示。
表2 枯草芽孢杆菌对乐果的降解率
从表2中的数据可以看出，第一组采用无机盐液体培养基的进行实验，对乐果的降解率为79.79％，采用肉汤液体培养基的进行实验，对乐果的降解率为91.49％；第二组采用无机盐液体培养基的进行实验，对乐果的降解率为73.59％，采用肉汤液体培养基的进行实验，对乐果的降解率为84.97％。
通过这两组实验可以看出，对于不同浓度的乐果，本实施方式的枯草芽孢杆菌均具有很好的降解效果。
二、抑病功效实验
抑病功效：实验室条件下，挑取已活化好菌株(本实施方式的具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌SbM-10)斜面1～2环于无菌水中，振荡均匀，吸取0.05ml菌悬液于PDA培养基平板上，用玻璃刮刀涂匀后，在平板中心分别接种各病原菌，同时，将病原菌接种于空白平板上作为对照，菌块直径约5mm。各处理3次重复，30℃恒温培养，5～7d观察生长状况，测定各平板上病原菌菌落直径，计算抑菌率：
(A-接种菌的处理组病原菌菌落直径，cm，B-对照组病原菌菌落直径，cm，0.5-接种点病原菌菌落直径，cm)测定结果表明：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、拟枝孢镰刀菌Fusarium sporotrichiodes、交链孢菌Alternaria、灰葡萄孢属Thielaviopsisbasicola、棒孢属Corynespora和炭疽菌属Colletotrichum生长均有明显的抑制作用，对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的抑制率为44.2％、对拟枝孢镰刀菌Fusarium sporotrichiodes的抑制率为81.0％、对交链孢菌Alternaria的抑制率为45.2％、对灰葡萄孢属Thielaviopsis basicola的抑制率为52.1％、对棒孢属Corynespora的抑制率为47.1％、对炭疽菌属Colletotrichum的抑制率为100％。本实施方式的枯草芽孢杆菌对病原菌生长的影响如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌对病原菌生长的影响
注：CK表示未接种枯草芽孢杆菌的对照组病原菌菌落直径，处理表示接种枯草芽孢杆菌病原菌菌落直径。