家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒及应用.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310484949.9 (22)申请日 2013.10.16 C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军总医院 地址 100853 北京市西城区复兴路 28 号 (72)发明人 籍灵超 王洪田 贾婧杰 张静 尤少华 白银 (74)专利代理机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 代理人 杨立 (54) 发明名称 家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂 盒及应用 (57) 摘要 本发明涉及一种家族性遗传性鼻出血致病基 因突变检测试剂盒及应用， 其含有检测 ACVRL1 基 因、 ENG 基因和 SM。

2、AD4 基因编码区突变的 34 对特 异性引物， 所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 68 所示， 本试剂盒检测顽固性鼻出血致病基 因 ENG、 ACVRL1、 SMAD4 上的相关位点是否发生突 变， 可应用于临床和实验室筛查， 实现 HHT 基因检 测的快速、 准确， 本试剂盒灵敏性及特异性均较 佳， 具有良好的临床前景。 (51)Int.Cl. 审查员 朱晓乐 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书8页 序列表14页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103555833 B (45)授权公告日 2015.04.08 CN 1035。

3、55833 B 1/2 页 2 1. 一种家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒， 其特征在于， 其含有检测 ACVRL1 基因、 ENG 基因和 SMAD4 基因编码区突变的 34 对特异性引物， 所述引物如 SEQ ID NO ： 1 68 所示 ： SEQ ID NO:1 5 GAGTGGGAAAGAGACACAGAAC3 SEQ ID NO:2 5 CAGTCAAGCTCCTACATTCTCC3 SEQ ID NO:3 5 AAAGCCTGCTTTTCAGAGTGTC3 SEQ ID NO:4 5 AGTTCCTATCTGCCCCTCCTAC3 SEQ ID NO:5 5 GATCT。

4、AACTGGCAGAGTGGTCT3 SEQ ID NO:6 5 GTCCTGCAGAAAGAAGAACCTA3 SEQ ID NO:7 5 GAGTCCAGTCTCATCCTGAAAG3 SEQ ID NO:8 5 GTCCTGCAGAAAGAAGAACCTA3 SEQ ID NO:9 5 AGGCAGCGCAGCATCAAGAT3 SEQ ID NO:10 5 AAACTTGAGCCCTGAGTGCAG3 SEQ ID NO:11 5 CTAGCTTAGCAGTGACCCAGTC3 SEQ ID NO:12 5 CTGAAACAACATGCACCTCTAA3 SEQ ID NO:13 5 。

5、TTAGAGGTGCATGTTGTTTCAG3 SEQ ID NO:14 5 AATACCACTGCCTTGTCCATAC3 SEQ ID NO:15 5 GAGTCTTGCCTCTGCCATTA3 SEQ ID NO:16 5 CAGAGGCCTCAGACACAAGT3 SEQ ID NO:17 5 TGTCCGCCCTGTCTTTCTCC3 SEQ ID NO:18 5 GGCTTGGCACTCTGACTCTGG3 SEQ ID NO:19 5 ACTGGACACAGGATAAGGCCCAG3 SEQ ID NO:20 5 AATACTTGGGGCCTGGTCCGTG3 SEQ ID NO。

6、:21 5 CACCTTATTCTCACCTGGCCTCTT3 SEQ ID NO:22 5 CTGCCTTGGAGCTTCCTCTGAG3 SEQ ID NO:23 5 GGGTGGCACAACCTATACAAAT3 SEQ ID NO:24 5 CAGAGATGGACAGTAGGGACCT3 SEQ ID NO:25 5 TTCCTGACCTCCTACATGGG3 SEQ ID NO:26 5 TTCAGCTCAGCAGCAGAGG3 SEQ ID NO:27 5 TGAGGGAAGGGACTGAGGTG3 SEQ ID NO:285， GTGGGGACTAGTGTCAGGGGC3 SEQ。

7、 ID NO:29 5 GGCCTGTCCGCTTCAGTGTT3 SEQ ID NO:30 5 GTTTTGTGTCCCGGGAGCTG3 SEQ ID NO:31 5 CCCCCTGTTCTGCCTCTCTC3 SEQ ID NO:32 5 CTGATCCAAGGGAGGGGAAG3 SEQ ID NO:33 5 ACACATATCACAGTGACCAGC3 SEQ ID NO:34 5 CTAGGGGAGGAACCAGATGTC3 SEQ ID NO:35 5 CTCCTGATGGTGCCCCTCTCTT3 SEQ ID NO:36 5 TTGTCTTGTGTTCTGAGCCCCTG3 。

8、权 利 要 求 书 CN 103555833 B 2 2/2 页 3 SEQ ID NO:37 5 ATTGGGTGGGATACCCTCTGGG3 SEQ ID NO:38 5 GGGTTAAGCACGTGACTGTCC3 SEQ ID NO:39 5 ATTGACCAAGTCTCCCTCCC3 SEQ ID NO:40 5 GAAAGGCGGAGAGGAAGTTC3 SEQ ID NO:41 5 GGTGGGGTGAAGAGCAGCTG3 SEQ ID NO:42 5 GACCTGGAAGCTCCCACTTGAA3 SEQ ID NO:43 5 GAGTAAACCTGGAAGCCGC3 SE。

9、Q ID NO:44 5 GCCACTAGAACAAACCCGAG3 SEQ ID NO:45 5 CTCCTGATGGTGCCCCTCTCTT3 SEQ ID NO:46 5 CTCAGAGGCTTCACCTGGGCTCC3 SEQ ID NO:47 5 AGGACCCTGACCTCCGCC3 SEQ ID NO:48 5 CTCTCCTGCTGGGCGAGC3 SEQ ID NO:49 5 TTCCTTGCAACGTTAGCTG3 SEQ ID NO:50 5 TATCTGAAGAGATGGAGCAC3 SEQ ID NO:51 5 AGTTGGTAGGATTGTGAGGA3 SEQ ID。

10、 NO:52 5 TGCCGCTCACACAAACTAAT3 SEQ ID NO:53 5 CGTTTATGCTACTTCTGAATTG3 SEQ ID NO:54 5 CTGCCGCTCACACAAACTAA3 SEQ ID NO:55 5 CTCATGCTGTTACCGCTGA3 SEQ ID NO:56 5 CCAAGTGATTGTGCATACC3 SEQ ID NO:57 5 TGATAGGCCATGGGTGAGTT3 SEQ ID NO:58 5 TGAAACAAAATCACAGGATGAA3 SEQ ID NO:59 5 TTGCATTATAAATTGTACTGTATTGGA3 S。

11、EQ ID NO:60 5 TTCTTTTCTTTTGGGGACAGTT3 SEQ ID NO:61 5 TGGAAATTCCTACCTTTTAATGC3 SEQ ID NO:62 5 CACCGACAATTAAGATGGAGTG3 SEQ ID NO:63 5 AGCATGCTATACAATCTGAAC3 SEQ ID NO:64 5 TCCTTCCACCCAGATTTCAA3 SEQ ID NO:65 5 AGTTTTAAATAAGTCAGGCATTG3 SEQ ID NO:66 5 TTCAAAAATGTCATCATCCCAG3 SEQ ID NO:67 5 CTTGGCACTTTAGC。

12、AGAGAAG3 SEQ ID NO:68 5 GGCAGCAAACACATTTTCAAC3 。 2. 根据权利要求 1 所述的一种家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒， 其特征 在于， 所述家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒还 包括 ： dNTP 混合液、 TaqDNA 聚 合酶、 PCR 缓冲液、 MgCl2溶液、 去离子水的 PCR 反应体系。 3. 根据权利要求 1 所述的一种家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒用于非 诊断目的的检测 ACVRL1 基因、 ENG 基因和 SMAD4 基因编码区的突变。 权 利 要 求 书 CN 103555833 B 3 1/8 页 4。

13、 家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒及应用 技术领域 0001 本发明涉及家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒及应用， 属于生物技术 领域。 背景技术 0002 鼻出血有多种病因， 可分为局部原因和全身原因。局部原因有外伤、 鼻中隔偏曲、 鼻腔鼻窦鼻咽的肿瘤、 鼻腔特殊性传染病、 鼻腔异物 ； 全身原因有急性发热性传染病、 心脏 及循环系统疾病、 出血性疾病、 肝肾疾病、 遗传性出血性毛细血管扩张症 （HHT） 。 其中唯一可 家族遗传的就是遗传性出血性毛细血管扩张症。 0003 遗传性出血性毛细血管扩张症是常染色体显性遗传的血管性疾病， 在北美的发病 率达 1:5-8000， 表现。

14、为皮肤黏膜毛细血管扩张和脏器动静脉畸形。鼻出血和胃肠道出血是 黏膜受累的常见并发症。受累的脏器包括肺脏， 肝脏和大脑。HHT 是发育疾病， 严重患病的 婴幼儿较少， 大部分患者的症状随年龄增长逐渐表现， 因此直至其成年期才能做出正确诊 断。最常见的临床症状为自发性反复性鼻出血， 平均发病年龄为 12 岁。肺脏、 肝脏和大脑 的血管畸形可引起突发出血或血流短路， 危及生命。HHT 的治疗主要是对症治疗， 对于顽固 性出血患者尚无有效治疗手段， 突然发病患者唯有通过早期确诊， 定期监测， 早期干预以避 免严重并发症。HHT 的临床诊断主要依据临床表现 ： 鼻出血， 皮肤黏膜的毛细血管扩张， 内 脏。

15、的动静脉畸形和家族史。 分子诊断根据ENG基因、 ACVRL1基因和SMAD4基因的筛查结果， 临床确诊病人的突变检出率为 80%-87%， 且基因检测不受年龄及临床表现的限制， 可实现早 期诊断。 0004 ENG 基因位于 9 号染色体， 编码的 Endoglin 蛋白为血管内皮的主要糖蛋白 ； 其同 型二聚体与 TGFBR1（转化生长因子 的型受体） 和 / 或 TGFBR2（转化生长因子的 型受体） 形成复合受体， 与 TGFB1 和 TGFB3 有很强的亲和性， 参与 TGF-/BMP （骨生成蛋白） 信号通路。在内皮细胞与整合蛋白和 / 或其他 RGD 受体的结合中可能起关键作用，。

16、 调节血 管发育生成。基因变异可导致遗传性出血性毛细血管扩张症。 0005 ACVRL1 基因位于 12 号染色体， 编码 ALK1 蛋白。ALK1 蛋白属于 TGF- 家族的 I 型受体， 位于细胞表面， 在丝氨酸 - 苏氨酸激酶亚区、 甘氨酸 - 丝氨酸富集区、 多肽 C 尾部高 度保守。TGF- 的 I 型受体与 BMP9/GDF2 和 BMP10 结合， 再形成 I-II 型受体复合物， 自动 磷酸化后结合并激活 SMAD， 在转录调节中发挥作用， 主要是调节血管的生成。ALK1 蛋白可 调节血管内皮细胞的增殖和胚胎发育。 ACVRL1基因突变或缺陷， 可导致多种疾病， 有遗传性 出血。

17、性毛细血管扩张症、 动静脉畸形、 血管疾病等。 0006 SMAD4 基因位于 18 号染色体， 编码蛋白属于信号传导蛋白 Smad 家族中一 员。co-SMAD 是 TGF- 信号通路的辅助激活物和调节剂， 在细胞核中可形成 SMAD2/ SMAD3-SMAD4复合物， 有利于SMAD2/SMAD4/FAST-1与DNA结合， 激活转录。 该基因的突变或 缺失可导致胰腺癌、 幼年性息肉病合并 HHT、 肺动脉高压等。 0007 国外报道 HHT 患者中 ENG 基因、 ACVRL1 基因和 SMAD4 基因所占比例分别为 说 明 书 CN 103555833 B 4 2/8 页 5 39%-。

18、59%、 25%-57%、 1%-2%。 对这3个致病基因联合筛查， 可提高HHT患者致病突变的检出率， 基因诊断的灵敏性大大提高， 实现早期诊断， 预防严重并发症。 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题是提供家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂 盒及应用， 本试剂盒检测顽固性鼻出血致病基因ENG、 ACVRL1和SMAD4上的相关位点是否发 生突变， 可应用于临床和实验室筛查， 实现 HHT 基因检测的快速、 准确， 本试剂盒灵敏性及 特异性均较佳， 有利于早期诊断。 0009 本发明解决上述技术问题的技术方案如下 ： 家族性遗传性鼻出血致病基因突变检 测试剂盒， 其含有检测ACV。

19、RL1基因、 ENG基因和SMAD4基因编码区突变的34对特异性引物， 所述引物如 SEQ ID NO ： 1 68 所示 ： 0010 表 134 对引物序列表 0011 说 明 书 CN 103555833 B 5 3/8 页 6 说 明 书 CN 103555833 B 6 4/8 页 7 0012 0013 说 明 书 CN 103555833 B 7 5/8 页 8 0014 在上述技术方案的基础上， 本发明还可以做如下改进。 0015 进一步， 所述家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒还包括 ： dNTP 混合 液、 TaqDNA 聚合酶、 PCR 缓冲液、 MgCL2溶液、 。

20、去离子水的 PCR 反应体系。本发明所用试剂均 为常规 PCR 反应试剂， 本试剂盒的组分和含量包括 ： 0016 （1） 2.5ul 10XPCR 缓冲液 0017 (2)4ul 1mmol/LdNTP 混合液 0018 （3） 0.6ul 2.5u/ul TaqDNA 聚合酶 0019 （4） 1ul 10p/mol 正向引物 0020 1ul 10p/mol 反向引物 0021 （5） 去离子水 13.9ul 0022 本试剂盒为一人份检测应用， 可保存在 4或更低的温度条件下。 0023 进一步， 所述 ACVRL1 基因、 ENG 基因和 SMAD4 基因的核苷酸序列是参考的标准序 。

21、说 明 书 CN 103555833 B 8 6/8 页 9 列， ACVRL1 基因核苷酸序列参考 Gene Bank Ref.ID:NM_000020.2, 所述 ENG 基因核苷酸序 列参考Gene Bank Ref.ID:NM_000118.2， 所述SMAD4基因核苷酸序列参考Gene Bank Ref. ID:NM_005359.5。 0024 本发明还提供了一种家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒用于非诊断 目的的检测 ACVRL1 基因、 ENG 基因和 SMAD4 基因编码区的突变。 0025 本发明还提供了一种家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测方法， 包括 ： 0026。

22、 1） 从受试者的血液或其他组织组织样品内提取基因组 DNA 作为模板， 使用时稀释 成浓度为 100ng/uL 的浓度。 0027 2） 溶解引物 ： 在 3000 6000 转 / 分钟的转速下， 对引物室温离心 5 40 秒， 然 后分别加入无菌去离子水， 室温静置 5 分钟， 混悬约 10 20 秒， 置于 -20保存备用， 所述 引物如 SEQ ID NO:1 68 所示。 0028 3） 配制 PCR 扩增反应体系。 0029 扩增ENG基因和ACVRL1基因的PCR反应条件为 ： 95预变性5分钟 ： 随后是14个 循环， 具体如下 ： 95 30 秒， 63 30 秒， 72 。

23、45 秒 ； 接着是 21 个循环 ： 95 30 秒， 56 30 秒， 72 45 秒， 72 7 分钟 ； 最后 4 0 分钟 24 小时。 0030 扩增 SMAD4 基因序列 PCR 反应条件为 ： 94预变性 4 分钟 ： 随后是 35 个循环， 具 体如下 ： 94 30 秒， 55 45 秒， 72 45 秒 ； 接着是 72 10 分钟 ； 最后 20 0 分钟 24 小 时。 0031 4） 将 PCR 反应产物在 0.8% 的琼脂糖凝胶上以低电压进行电泳， 证实 PCR 扩增产物 条带符合目的片段长度后进行测序。 0032 5） PCR 产物测序， 对结果进行判读。 00。

24、33 本发明的有益效果是 ： 0034 1） 所述 DNA 样品为人全基因组 DNA， 可以有效地对全基因组的突变进行检测。 0035 2） 一次性对3个致病基因的32个编码区全长及其两端的内含子区域均特异扩增， 上述扩增引物对可以有效检测基因突变类型， 推测是否致病。 0036 3） 经临床应用此试剂盒检测的灵敏性及特异性均较佳， 有利于早期诊断。 0037 4） 本发明可应用于临床和实验室基因筛查、 检测及诊断由于 ACVRL1 基因、 ENG 基 因、 SMAD4 基因变异或缺陷而导致的诸多遗传性疾病， 这些疾病包括但不限于 ： HHT、 动静脉 畸形、 息肉病、 胰腺癌、 发育畸形、 。

25、先兆子痫等。 附图说明 0038 图 1 为本发明实施例 5 中的家系图 ； 0039 图 2 为本发明实施例 4 中的电泳图 ； 0040 图 3 为本发明实施例 5 中的测序图。 具体实施方式 0041 下面结合 1 例遗传性出血性毛细血管扩张症的分子遗传学和分子病因学检测对 本发明的实质性内容进一步说明， 但本发明并不局限于此。 0042 除非特别指出， 否则实例中的试剂药品材料均为市售可得， 实验方法参考 分子克 说 明 书 CN 103555833 B 9 7/8 页 10 隆实验指南 （Sambrook 和 Russel， 第三版） 0043 实施例 1 0044 提取受检者及其亲。

26、属的血液样品。蛋白酶 K 和苯酚方法抽提所有血液样品的基因 组 DNA， 通过紫外分光光度计测量 DNA 浓度后于 4保存， 取 5l 稀释到浓度为 100ng/l 备用。 0045 HHT 临床诊断标准 ：（1) 反复自发性鼻衄 ；（2) 皮肤黏膜毛细血管扩张 ；（3) 内脏 受累 （胃肠道、 肝、 脑、 肺动静脉畸形， 有 / 无出血） ；（4) 阳性家族史。提取受检者符合 （1） 和 （4） ， 为临床可疑。 0046 实施例 2 0047 设计并合成 10nmol 的引物 （引物序列参见表 1） ， 将装有引物的离心管置于离心机 上， 在 3000 6000 转 / 分钟的转速下， 室。

27、温离心 5 40 秒， 然后各取室温 100l 无菌去 离子水， 分别加入两个引物管内配制 10pmol/L 的引物液， 室温静置 5 分钟， 混悬约 10 20 秒。 0048 实施例 3 0049 配制用于扩增 DNA 序列的公共液 C ： 等量混合 200nmol/L 的四种脱氧单三磷酸核 苷 ( 即 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP)， 然后将其与灭菌双重蒸馏去离子水按照 1 ： 7.4 的体积比例 混合。 0050 按照表 2 所示配制反应体系， 将配好的反应体系分装到薄壁 PCR 管内， 放到 PCR 仪 上进行扩增， 反应条件如下所示， 循环数为 35 ； 0051 。

28、表 2PCR 反应体系 （25ul 总反应体系） 0052 成分名称成分浓度成分体积 （ul） PCR 缓冲液10X2.5 引物 A10pmol/L1 引物 B10pmol/L1 dNTP1mmol/L4 Taq DNA 聚合酶2.5u/ul0.6 模板 DNA100ng/ul2 ddH2O13.9 合计25 0053 ENG基因和ACVRL1基因PCR反应条件 ： 95预变性5分钟 ： 随后是14个循环， 具体 如下 ： 95 30 秒， 63 30 秒， 72 45 秒 ； 接着是 21 个循环 ： 95 30 秒， 56 30 秒， 72 45 秒， 72 7 分钟 ； 最后 4 0 分。

29、钟 24 小时。 说 明 书 CN 103555833 B 10 8/8 页 11 0054 SMAD4 基因 PCR 反应条件 ： 94预变性 4 分钟 ： 随后是 35 个循环， 具体如下 ： 94 30 秒， 55 45 秒， 72 45 秒 ； 接着是 72 10 分钟 ； 最后 20 0 分钟 24 小时。 0055 实施例 4 0056 PCR 反应产物用浓度为 0.8%（g/100ml） 的琼脂糖凝胶， 在 5V/cm 的电压下进行恒 压电泳， 电泳结束后， 置于凝胶成像系统扫描观察 , 电泳结果如图 2 所示。由图 2 可知， 目 的条带扩增良好。 0057 实施例 5 005。

30、8 纯化 PCR 扩增产物进行 DNA 测序。测序原始数据使用 NCBI BLAST 程序进行比对 分析。 对可疑的突变位点， 通过查找数据库、 专业网站、 搜索引擎及相关文献， 核对检测到的 碱基改变是否已经报道、 是否为致病性突变等。 0059 相关检索网站包括 : 0060 HHT Mutation Database http:/arup.utah.edu/database/hht/ 0061 NCBI SNP Database(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)， 0062 Ensembl(http:/www.ensembl.org/)， 0063 Dat。

31、abase of Genomic 0064 Variants(http:/dgvbeta.tcag.ca/dgv/app/home?ref=GRCh37/hg19), 0065 Human Gene Mutation 0066 Database(HGMD)(http:/www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php), 0067 Locus Specfi c Mutation 0068 Databases(LSDB)(http:/www.hgvs.org/dblist/glsdb.html). 0069 在患者家族成员中对 ACVRL1 基因突变位点所在编码序列及侧翼序列进行突 。

32、变排查， 先证者及家系部分成员有 c.199CG 杂合突变， 即 p.Arg67Gly 杂合突变 （见 图 1 及图 3） 。在正常人群筛查未发现此位点突变， 排除 SNP， 结合相关文献 （Bossler AD,Richards J,George C,et al.Novel mutations in ENG and ACVRL1identifi ed in a series of200individuals undergoing clinical genetic testing for hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT):correlati。

33、on of genotype with phenotype.Hum Mutat.2006Jul;27(7):667-75） 研究， 可证明其致病性。 0070 表 3 家族性遗传性鼻出血患者及家系的突变位点 0071 基因位置突变类型核苷酸改变氨基酸改变分类 ACVRL1第 3 外显子错义突变c.199CGp.Arg67Gly致病性突变 0072 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103555833 B 11 1/14 页 12 0001 0002 。

34、序 列 表 CN 103555833 B 12 2/14 页 13 0003 序 列 表 CN 103555833 B 13 3/14 页 14 0004 序 列 表 CN 103555833 B 14 4/14 页 15 0005 序 列 表 CN 103555833 B 15 5/14 页 16 0006 序 列 表 CN 103555833 B 16 6/14 页 17 0007 序 列 表 CN 103555833 B 17 7/14 页 18 0008 序 列 表 CN 103555833 B 18 8/14 页 19 0009 序 列 表 CN 103555833 B 19 9/14 页 20 0010 序 列 表 CN 103555833 B 20 10/14 页 21 0011 序 列 表 CN 103555833 B 21 11/14 页 22 0012 序 列 表 CN 103555833 B 22 12/14 页 23 0013 序 列 表 CN 103555833 B 23 13/14 页 24 0014 序 列 表 CN 103555833 B 24 14/14 页 25 序 列 表 CN 103555833 B 25 1/1 页 26 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103555833 B 26 。