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1、(10)申请公布号 CN 103555862 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103555862 A (21)申请号 201310565912.9 (22)申请日 2013.11.13 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/42(2006.01) C12R 1/63(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 中华人民共和国青岛出入境检验检 疫局 地址 266001 山东省青岛市市南区中山路 2 号 (72)发明人 杨冰 王春德 倪梦丽 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 3。
2、7201 代理人 张中南 (54) 发明名称 基于荧光定量 PCR 的贝类多种病原生物检测 试剂盒及方法 (57) 摘要 一种基于荧光定量 PCR 的贝类多种病原生物 检测试剂盒及方法。 该试剂盒包括8种试剂 ： 裂解 液、 PCR 反应液、 dNTP 混合物、 Taq 酶液、 2SYBR Premix Ex Taq 反应预混液、 引物对、 阳性对照及 阴性对照等。本发明提供了沙门氏菌、 副溶血弧 菌、 派琴虫、 折光马尔太虫和急性病毒性坏死病毒 (AVNV) 等 5 种病原生物的特异引物。本发明充分 利用了荧光定量 PCR 技术的高效扩增性、 核酸杂 交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性。
3、， 反应结束便可根据扩增曲线即时判定待检测组织 样本中是否含有上述该五种病原中的一种或几种 及其含量， 由于提供了退火温度相近的特异引物， 因此能够同时对上述 5 种病原生物进行检测。本 发明能够快速、 特异的完成检测， 方法简便， 具有 很高的推广价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表4页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103555862 A CN 103555862 A 1/2 页 2 1. 一种基于 PCR 的贝类多种病原生物检测。
4、试剂盒， 其特征在于该试剂盒包括 ： (1) 裂解液 ： 含有胰蛋白酶、 Tris、 EDTA， pH 为 7.5-8.5， 其浓度分别为 1-10mg/mL， 10-50mmol/L， 1-10mmol/L ； (2)PCR 反应液 ： 含 dNTP 和 MgCl2； dATP,dTTP,dCTP, 和 dGTP 的四种混合物 dNTP, 其中每种溶液的浓度 2.5mmol/L ； MgCl2 浓度为 20-30mmol/L ； (3)Taq 酶液 ： 5U/L ； (4)2SYBR Premix Ex Taq 反应预混液 ； (5) 引物对 ： 沙 门 氏 菌 ：普 通 PCR 引 物 上。
5、 游 引 物 ： 5 -CCGTATGGCTGGGCGTTT-3 下游引物 ： 5 -AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3 荧光定量 PCR 引物上游引物 ： 5 -CCGTATGGCTGGGCGTTT-3 下游引物 ： 5 -AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3 副 溶 血 弧 菌 ： 普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3 下游引物 ： 5 -TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3 荧光定量 PCR 引物上游引物 ： 5 -CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3 下游引物 ： 5 。
6、-TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3 派 琴 虫 ：普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CCGCTTTGTTTGGATCCC-3 下游引物 ： 5 -ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3 荧光定量 PCR 引物上游引物 ： 5 -TACCTAGCGGGTTTTGCTACTC-3 下游引物 ： 5 -GTCTACGACGACACGATAATGC-3 折 光 马 尔 太 虫 ： 普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CCGCACACGTTCTTCACTCC-3 下游引物 ： 5 -CTCGCGAGTTTCGACAGACG-3 荧光定量 PCR 引物上。
7、游引物 ： 5 -GCTCTTCTTCCCGATACAAACA-3 下游引物 ： 5 -TAATACGCCTGCCTTCACAAG-3 AVNV ：普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -TCTTTACCATGAAGATACCCACC-3 下游引物 ： 5 -GTGCACGGCTTACCATTTTT-3 荧 光 定 量 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -AGCCTTTTACAGAATTTTGCACCTT-3 下游引物 ： 5 -TGTCGCATGTTAACCTCGTCTG-3 (6) 灭菌去离子水。 (7) 阳性对照 ： 含有上述 5 种病原 DNA 模板的混合液 ； (8)。
8、 阴性对照 ： ddH2O 。 2. 利用权利要求 1 所述的试剂盒检测贝类样品中 5 种病原生物的方法， 其特征在于所 述方法包括以下步骤 ： (1) 提取感染样品组织的基因组 DNA， 以待测样品的 DNA 为模板、 在包括权利要求 1 所 述的 5 种普通引物和 5 种荧光定量 PCR 引物的反应体系中进行普通 PCR 反应和荧光定量 PCR 反应 ； (2) 对普通 PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 根据特异条带的有无判断是有含 有病原生物 ； 权 利 要 求 书 CN 103555862 A 2 2/2 页 3 对荧光定量PCR反应产物进行荧光检测， 根据荧光检测的最低Ct值。
9、和最高荧光强度判 断结果， 荧光定量 PCR 呈阳性， 则待测样品中含有病原生物。 3. 如权利要求 2 所述的检测贝类样品中 5 种病原生物的方法， 其特征在于 ： 所述普通 PCR 反应体系每 20L 组成如下 ： Taq(5U/L)0.1L， 10PCR Buffer( 含 有MgCl2)2L， dNTP Mixture(2.5mM)1.6L， 模板DNA2L， 10M的上下游引物各0.4L， ddH2O13.5L。 4. 如权利要求 2 所述的检测贝类样品中 5 种病原生物的方法， 其特征在于 ： 所述普通 PCR 反应条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 57退火。
10、 45s， 72延伸 1min， 30 个循环 ； 72终延伸 5min。 5. 如权利要求 2 所述的检测贝类样品中 5 种病原生物的方法， 其特征在于 ： 所述荧光定量 PCR 反应体系每 20L 组成如下 ： 2SYBR Premix Ex Taq 主要反应预 混液 10.0L， 标准质粒 DNA2.0L， ddH2O7.2L， 引物浓度 0.2mol/L。 6. 如权利要求 2 所述的检测贝类样品中 5 种病原生物的方法， 其特征在于 ： 所述荧光定量PCR反应条件为 ： 95预变性30s ； 95变性5s， 60退火并延伸20s， 45 个循环 ； 在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信。
11、号。 权 利 要 求 书 CN 103555862 A 3 1/7 页 4 基于荧光定量 PCR 的贝类多种病原生物检测试剂盒及方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基于荧光定量 PCR 的贝类多种病原生物检测试剂盒及方法， 属于 海洋生物病原检测技术领域。 背景技术 0002 沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫、 急性病毒性坏死病毒 (AVNV) 是最 常见的贝类中的主要病原。沙门氏菌是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌， 是常见的人畜共患的 肠道致病菌。 其广泛分布于自然界中， 能够引起严重的食物中毒、 感染、 动物性传播疾病， 对 人类和动物健康具有极大危害。 副溶血弧菌是一种革兰。
12、氏阴性嗜盐菌， 在富含浮游生物、 微 粒和几丁质的环境中能较好生长， 广泛存在于多种水产品中。派琴虫是影响贝类养殖业发 展的主要病原之一， 它使贝类贝壳不闭合， 性腺发育抑制， 套膜收缩， 生长缓慢， 致死率可达 95%。 马尔太虫是给世界贝类养殖产业带来严重危害的主要疾病之一， 也是世界动物卫生组 织规定的必须上报的贝类寄生虫病之一， 它能引起贝类的消化道变色、 消瘦、 生长停止并最 终导致贝类死亡。急性坏死性病毒 （AVNV） 是造成中国北方沿海养殖栉孔扇贝夏季大量死 亡的病原， 已给栉孔扇贝养殖业带来巨大地经济损失。 0003 从前对这些病原生物进行检测， 采取的是传统方法， 大都通过细。
13、菌病毒培养检测 法、 免疫组化检测法、 组织病理学检测法等， 这需要针对具体的病原设计不同的检测方法， 检测过程庞杂、 需要众多仪器设备， 耗时长， 无法做到检测的自动化和标准化。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种基于 PCR 的贝类多种病原生物同步检测试剂盒及方 法 , 以克服现有技术的不足。 0005 本发明的技术构思是通过设计退火温度相近的普通引物和荧光引物， 将多种病原 生物引物在同一个普通 PCR 仪和同一个实时荧光定量 PCR 扩增仪上进行扩增检测， 使得检 验流程可以标准化、 自动化， 建立同时快速检测进口贝类中不同种类病原生物的试剂盒及 方法， 以达到迅速、 直观、。
14、 准确、 简便、 低成本的检验鲜活贝类中的病原生物的目的。 0006 本发明是通过以下技术方案实现上述目的的 ： 0007 一种基于荧光定量 PCR 的贝类多种病原生物检测试剂盒， 其特征在于该试剂盒包 括 ： 0008 (1) 裂解液 ： 含有胰蛋白酶、 Tris、 EDTA， pH 为 7.5-8.5， 其浓度分别为 1-10mg/mL， 10-50mmol/L， 1-10mmol/L ； 0009 (2)PCR 反应液 ： 含 dNTP 和 MgCl2； 0010 含 dATP,dTTP,dCTP, 和 dGTP 的四种混合物 dNTP, 其中每种溶液的浓度 2.5mmol/ L ； M。
15、gCl2浓度为 20-30mmol/L ； 0011 (3)Taq 酶液 ： 5U/L ； 0012 (4)2SYBR Premix Ex Taq 反应预混液 ； 说 明 书 CN 103555862 A 4 2/7 页 5 0013 (5) 引物对 ： 0014 沙 门 氏 菌 ：普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CCGTATGGCTGGGCGTTT-3 下游引物 ： 5 -AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3 0015 荧光定量 PCR 引物上游引物 ： 5 -CCGTATGGCTGGGCGTTT-3 下游引物 ： 5 -AGTACGGCTAAAGCTTT。
16、CCGATAAG-3 0016 副 溶 血 弧 菌 ： 普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3 下游引物 ： 5 -TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3 0017 荧 光 定 量 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3 下游引物 ： 5 -TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3 0018 派 琴 虫 ：普 通 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -CCGCTTTGTTTGGATCCC-3 下游引物 ： 5 -ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3 0019 。
17、荧 光 定 量 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -TACCTAGCGGGTTTTGCTACTC-3 下游引物 ： 5 -GTCTACGACGACACGATAATGC-3 0020 折光马尔太虫 ： 普通 PCR 引物上游引物 ： 5 -CCGCACACGTTCTTCACTCC-3 下游引物 ： 5 -CTCGCGAGTTTCGACAGACG-3 0021 荧 光 定 量 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -GCTCTTCTTCCCGATACAAACA-3 下游引物 ： 5 -TAATACGCCTGCCTTCACAAG-3 0022 AVNV ：普 通 PCR 引 物 上 游 引 。
18、物 ： 5 -TCTTTACCATGAAGATACCCACC-3 下游引物 ： 5 -GTGCACGGCTTACCATTTTT-3 0023 荧 光 定 量 PCR 引 物 上 游 引 物 ： 5 -AGCCTTTTACAGAATTTTGCACCTT-3 下游引物 ： 5 -TGTCGCATGTTAACCTCGTCTG-3 0024 (6) 灭菌去离子水 ； 0025 (7) 阳性对照 ： 含有以上 5 种病原 DNA 模板的混合液 ； 0026 (8) 阴性对照 ： ddH2O 0027 利用上述试剂盒的基于荧光定量 PCR 的贝类多种病原生物同步检测方法， 它的步 骤如下 ： 0028 (。
19、1) 提取待测样品的 DNA， 以待测样品的 DNA 为模板、 在包括如上所述普通引物和 荧光定量 PCR 引物的反应体系中进行普通 PCR 反应和荧光定量 PCR 反应 ； 0029 (2) 对普通 PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 根据特异条带的有无判断是 有含有病原生物 ； 0030 对荧光定量PCR反应产物进行荧光检测， 根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强 度判断结果， 荧光定量 PCR 呈阳性， 则待测样品中含有病原生物。 0031 优选的， 所述普通 PCR 反应体系每 20L 组成如下 ： Taq(5U/L)0.1L， 10PCR Buffer(Mg2+Plus)2L，。
20、 dNTP Mixture(2.5mM)1.6L， 模板DNA2L， 10M的上下游引物各 0.4L， ddH2O13.5L。 0032 优选的， 所述普通 PCR 反应条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 57退火 45s， 72延伸 1min， 30 个循环 ； 72终延伸 5min。 0033 优选的， 所述荧光定量 PCR 反应体系每 20L 组成如下 ： 2SYBR Premix Ex Taq 主要反应预混液 10.0L， 标准质粒 DNA2.0L， ddH2O7.2L， 引物浓度 0.2mol/L。 说 明 书 CN 103555862 A 5 3/7 页 6 。
21、0034 优选的， 所述荧光定量 PCR 反应条件为 ： 95预变性 30s ； 95变性 5s， 60退火 并延伸 20s， 45 个循环 ； 在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。 0035 本发明充分利用了荧光定量 PCR 技术的高效扩增性、 核酸杂交的良好特异性和荧 光检测技术的快速敏感性， 反应结束便可根据扩增曲线即时判定待检测组织样本中是否含 有上述该五种病原中的一种或几种， 由于设计了退火温度相近的特异引物， 因此能够同时 对上述 5 中病原生物进行检测。本发明操作简便快捷， 能在 2.5 小时内完成贝类中沙门氏 菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫和 AVNV 的同时检测。
22、， 以满足口岸进口水产品快速检 测的需要， 具有很高的推广价值。 附图说明 0036 图 1 为普通 PCR 产物电泳结果。 0037 图 2 为五种病原质粒拷贝数与最小循环数 (Ct) 的标准曲线 ； 0038 其中， 图 2a图 2e 分别为沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫、 AVNV 质 粒拷贝数与最小循环数 (Ct) 的标准曲线。 0039 图 3 为五种病原生物的熔解曲线 ； 0040 其中， 图 3a图 3e 分别为沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫、 AVNV 熔 解曲线。 0041 图 4 为五种病原生物荧光定量 20 次重复试验结果。 0042 。
23、其中， 图 4a图 4e 分别为沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫、 AVNV 荧 光定量 PCR20 次重复试验结果。 具体实施方式 0043 以下参考附图给出本发明的具体实施方式， 用来对本发明做进一步说明。 0044 1 试验材料和方法 0045 1.1 病原 0046 用 于 本 试 验 的 沙 门 氏 菌 (Salmonella As1.1552)、副 溶 血 弧 菌 (Vibrio parahaemolyticus As1.1997) 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 ； 急性病毒性坏死 病毒 (AVNV) 由黄海水产研究所惠赠 ； 派琴虫 (Perkinsus s。
24、p.)、 折光马尔太虫 (Marteilia refringens)、 灿烂弧菌 (Vibrio splendidus)、 费氏弧菌 (Vibrio fischeri)、 腐败希瓦 氏菌 (Shewanella putrefaciens)、 肠道弧菌 (Vibrio ichthyoenteri)、 尼氏单孢子虫 (Haplosporidium nelsoni) 均由广西兽医研究所谢芝勋研究员惠赠。 0047 1.2 主要仪器 0048 主 要 仪 器 ： PTC-200 型 自 动 热 循 环 PCR 仪 (M J Research)、 Roche LightCycler480型荧光定量PCR。
25、扩增仪、 岛津UV-2450型紫外分光光度计、 黑马凝胶成像 系统、 D-1 型自动蒸汽灭菌锅 ( 北京发恩科贸 )、 DYY-6C 型稳压电泳仪 ( 北京六一 )、 低温微 量超速离心机、 水浴锅、 电子天平、 振荡仪等常用设备。 0049 1.3 试验方法 0050 1.3.1 普通 PCR 检测 0051 1.3.1.1 试验所用引物 说 明 书 CN 103555862 A 6 4/7 页 7 0052 表 1 试验所用普通引物序列 0053 0054 0055 1.3.1.2 贝类病原 DNA 的提取 0056 切取不多于 30mg 的组织材料， 放入装有 200L GA 缓冲液的离。
26、心管中， 振荡 15 秒。 加入20L蛋白酶K(20mg/ml)溶液， 混匀后置于56水浴中， 直至组织完全溶解， 期间 每小时振荡混合样品 2-3 次， 每次振荡混匀 15 秒。加入 200L 缓冲液 GB， 充分颠倒混匀， 70水浴放置 10 分钟， 直至溶液变清亮。加入 200L 无水乙醇， 充分颠倒混匀， 此时可能 会出现絮状沉淀。 将所得溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)， 12000rpm 离心 30 秒， 倒掉废液， 将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入 500L 缓冲液 GD， 12000rpm 离心 30 秒， 倒掉废液， 将吸附柱放入收集管中。向吸附柱。
27、中加入 700L 漂洗 液 PW， 12000rpm 离心 30 秒， 倒掉废液， 将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入 500L 漂 洗液 PW， 12000rpm 离心 30 秒， 倒掉废液。将吸附柱放入收集管中， 12000rpm 离心 2 分钟， 倒掉废液， 将吸附柱置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 将吸附柱 转入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位滴加 100L 洗脱缓冲液 TE， 室温放置 5 分 钟， 12000rpm 离心 2 分钟， 将溶液收集到离心管中。 0057 1.3.1.3 普通 PCR 反应体系与条件 0058 扩 增 反 应 在 PTC。
28、-200 型 自 动 热 循 环 PCR 仪 (M J Research) 上 进 行。 反 应体系为 20L ： Taq(5U/L)0.1L， 10PCR Buffer(Mg2+Plus)2L， dNTP Mixture(2.5mM)1.6L， 模板 DNA2L， 10M 的上下游引物各 0.4L， ddH2O13.5L。 0059 反应条件 ： 94预变性5min ； 94变性30s， 57退火45s， 72延伸1min， 30个循 环 ； 72终延伸 5min。 0060 阴性对照 ： 以 ddH2O2L 代替模板 DNA， 在同样条件下进行 PCR 反应。 说 明 书 CN 10355。
29、5862 A 7 5/7 页 8 0061 1.3.1.4PCR 产物电泳检测 0062 取 PCR 扩增产物 5L， 加入 1loading buffer1L， 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳， 电 泳电压为 5v/cm， 电泳时间 30min。 0063 1.3.2 荧光定量 PCR 检测 0064 1.3.2.1 试验所用引物 0065 表 2 试验所用荧光引物序列 0066 0067 1.3.2.2 荧光定量 PCR 反应体系与条件 0068 扩增反应在 Roche LightCycler480 型荧光定量 PCR 扩增仪上进行。荧光定量 PCR 反应体系按照 SYBR Premix Ex。
30、 Taq( 宝生物大连生物工程公司 ) 说明书配制。以标准 质粒为 DNA 模板， 采用 20L 体系进行反应条件的优化， 其中 2SYBR Premix Ex Taq 主要 反应预混液 10.0L， 标准质粒 DNA2.0L， ddH2O7.2L， 引物浓度从 0.2mol/L,。 0069 荧光定量PCR的反应条件为 ： 95预变性30s ； 95变性5s， 60退火并延伸20s， 45 个循环 ； 在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。 0070 1.3.2.3 荧光定量 PCR 标准曲线的建立 0071 将沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫和 AVNV 的标准质粒分别作为。
31、 定量的标准品， 用 ddH2O 对标准品进行 10 倍比梯度稀释， 采用建立的体系进行荧光定量 PCR 反应， 同时每个浓度做 3 个平行样品， 以保证试验的准确性。检测各浓度标准品对 应的 Ct 值， 建立质粒拷贝数与 Ct 值对应关系的标准曲线， 用于定量分析。质粒拷贝数 的计算公式为 ： 质粒拷贝数 (copies/L)=6.021023 质粒浓度 (ng/L)10-9/(DNA 说 明 书 CN 103555862 A 8 6/7 页 9 length660)。 0072 1.3.2.4 荧光定量 PCR 特异性检测 0073 以灿烂弧菌 (Vibrio splendidus)、 费。
32、氏弧菌 (Vibrio fischeri)、 腐败希瓦 氏菌 (Shewanella putrefaciens)、 肠道弧菌 (Vibrio ichthyoenteri)、 尼氏单孢子虫 (Haplosporidium nelsoni) 等贝类常见病原作为阴性对照， 以 ddH2O 作为无模板空白对 照， 进行荧光定量 PCR， 检验荧光引物的特异性。 0074 1.3.2.5 荧光定量 PCR 重复性检测 0075 分别取沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔太虫、 AVNV 某一浓度的标准质粒 在一次试验中重复20次， 观察Ct值的标准偏差和变异系数， 以此来初步检验该方法的重复 性。
33、。 0076 2 试验结果 0077 2.1 普通 PCR 产物电泳结果 0078 如图 1 所示， 沙门氏菌引物的扩增产物的条带长度为 112bp， 副溶血弧菌引物的扩 增产物的条带长度为 285bp， 折光马尔太虫引物的扩增产物条带长度为 411bp,ANVN 引物的 扩增产物条带大小为 693bp, 派琴虫引物的扩增产物条带大小为 703bp。电泳结果显示 ： 设 计的普通引物扩增产物的条带位置与预计相符。阴性对照均无条带， 可排除假阳性。 0079 2.2 定量标准曲线的建立 0080 如图 2a 所示， 沙门氏菌标准曲线在 4.881064.881010copy/L 之间有较好 的线。
34、性关系， 相关系数R2=0.9999， 斜率为-3.492， 截距为31.397， 得出质粒拷贝数(X)与Ct 值之间的线性方程为 ： Ct=-3.492lgX+31.397。 0081 如图 2b 所示， 副溶血弧菌标准曲线在 1.531051.53109copy/L 之间有较 好的线性关系， 相关系数R2=0.9998， 斜率为-3.850， 截距为38.012， 得出质粒拷贝数(X)与 Ct 值之间的线性方程为 ： Ct=-3.850lgX+38.012。 0082 如图2c所示， 派琴虫标准曲线在2.551032.55107copy/L之间有较好的线 性关系， 相关系数 R2=0.99。
35、98， 斜率为 -3.520， 截距为 37.980， 得出质粒拷贝数 (X) 与 Ct 值 之间的线性方程为 ： Ct=-3.520lgX+37.980。 0083 如图2d所示， 折光马尔太虫标准曲线在3.941053.94109copy/L之间有较 好的线性关系， 相关系数R2=0.9996， 斜率为-3.863， 截距为37.510， 得出质粒拷贝数(X)与 Ct 值之间的线性方程为 ： Ct=-3.863lgX+37.510。 0084 如图 2e 所示， AVNV 标准曲线在 4.471034.47107copy/L 之间有较好的线 性关系， 相关系数 R2=0.9999， 斜率为。
36、 -3.574， 截距为 37.951， 得出质粒拷贝数 (X) 与 Ct 值 之间的线性方程为 ： Ct=-3.574lgX+37.951。 0085 2.3 定量熔解曲线分析 0086 从熔解曲线可以看出 ( 图 3a图 3e)， 沙门氏菌、 副溶血弧菌、 派琴虫、 折光马尔 太虫、 AVNV 均呈现出典型的熔解峰， 扩增目的基因的熔点值 Tm 分别为 85.08、 85.46、 90.22、 82.49和82.48， 检测结果为阳性。 阴性对照未出现特异性熔解峰， 检测结果为 阴性。 当熔解曲线中没有杂峰的出现、 也没有珠峰的异常增宽时， 可以判定实验中未出现污 染、 引物二聚体和非特异。
37、性扩增。 由该五种病原的熔解曲线可知， 设计的荧光引物特异性均 较强， 无引物二聚体产生。 说 明 书 CN 103555862 A 9 7/7 页 10 0087 2.4 重复性检验 0088 为了初步检验方法的重复性， 本发明分别取沙门氏菌、 派琴虫和 AVNV 某一浓度的 标准质粒在一次试验中重复20次。 结果表明(图4a-图4e)， 沙门氏菌重组质粒的扩增曲线 在阈值线附近基本上重合， Ct值平均读数为23.79， 标准偏差为0.32， 变异系数为1.34%。 副 溶血弧菌重组质粒的扩增曲线在阈值线附近基本上重合， Ct 值平均读数为 27.47， 标准偏 差为0.31， 变异系数为1。
38、.15%。 派琴虫重组质粒的扩增曲线在阈值线附近也基本重合， Ct值 平均读数为 21.83， 标准偏差为 0.07， 变异系数为 0.30%。折光马尔太虫重组质粒的扩增曲 线在阈值线附近也基本重合， Ct值平均读数为21.91， 标准偏差为0.06， 变异系数为0.20%。 AVNV 重组质粒的扩增曲线在阈值线附近也是基本上重合的， Ct 值平均读数为 24.03， 标准 偏差为 0.05， 变异系数为 0.22%。以上统计结果表明， 本研究所建立的沙门氏菌、 副溶血弧 菌、 派琴虫、 折光马尔太虫及 AVNV 荧光定量 PCR 快速检测方法重复性较好。 说 明 书 CN 103555862。
39、 A 10 1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103555862 A 11 2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 103555862 A 12 3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 103555862 A 13 4/4 页 14 序 列 表 CN 103555862 A 14 1/6 页 15 图 1 图 2a 图 2b 说 明 书 附 图 CN 103555862 A 15 2/6 页 16 图 2c 图 2d 图 2e 说 明 书 附 图 CN 103555862 A 16 3/6 页 17 图 3a 图 3b 图 3c 说 明 书 附 图 CN 103555862 A 17 4/6 页 18 图 3d 图 3e 图 4a 说 明 书 附 图 CN 103555862 A 18 5/6 页 19 图 4b 图 4c 图 4d 说 明 书 附 图 CN 103555862 A 19 6/6 页 20 图 4e 说 明 书 附 图 CN 103555862 A 20 。