技术领域
本发明属于天然产物提取分离技术领域，具体涉及一种提取高纯度海参多 肽的方法，即利用高速剪切技术、酶切技术和大孔树脂混合模拟移动床技术从 海参中提取高纯度海参多肽的方法。
背景技术
海参(Sea cucumber)是棘皮动物门海参纲生物的总称，近年来，随着市场需 求的持续升温，海参养殖业发展迅猛，目前，我国海参的年产量约14万吨，主 要集中在山东沿海，山东省海参年产量为7万多吨，占全国海参产量的一半以上， 养殖年产值即达160亿元，且每年还在以20%的增长速度在发展，海参养殖产业 已成为山东省水产养殖支柱产业之一，在当地的水产养殖生产中占有举足轻重 的地位。
海参有着悠久的历史，在中国，很多年前就被当作高级滋补品名列八珍之首； 在大连，很多老人长久以来就保留着进补海参的习惯；在胶东，众海参商家旌 旗飘舞；在内陆，更多的人开始了解海参；在广东，北方的海参供不应求。由 于传统的粗加工而成的原生态海参食用起来比较繁琐，而且不易保鲜保质，此 外，由于海参的特殊形态，在产品的运输和储藏上也有一定的问题。针对这种 状况，海参生产企业推出了“精细加工”的策略：高压即食海参、海参罐头、冻干 即食、海参粉胶囊、海参多肽、海参酒等一系列以海参为原料的海参新产品应 运而生。在高新技术的支持下，这些新产品目标市场直指外埠。这些海参产品 方便消费者食用，有很大的市场需求。就全国市场而言，精细加工的海参产品 必将成为未来海参企业的主导方向。
海参含有丰富的蛋白质，是制备多肽的理想原料。海参多肽市场尚处萌芽阶 段，目前主要应用于食品、保健品和化妆品等领域，随着研究的不断深入，海 参多肽的应用领域不断加大，消费的上升潜力很大，产品价格未来将相对稳定。 随着人民生活水平的提高，国内大中城市的高端消费群体对海参多肽产品的需 求还在不断增加，海参多肽产品市场短期内尚供不应求。
目前，海参多肽的提取纯化工艺已经开始相关的研究，并取得了一定的研究 成果。现阶段而言，海参多肽的提取纯化工艺主要通过膜过滤法，该方法基本 工艺为：海参粉碎后，加入适量的酶进行酶解，酶解液进行膜过滤，得到一定 分子量范围的物质。该方法优点是工艺简单，得到的多肽分子量区间相对集中， 缺点是产品中含杂质太多，纯度不高，而且对滤膜的消耗量太大，成本较高。
海参多肽纯度高低，直接决定了产品的品质和用途。因此，制备高纯度的海 参多肽成为本领域目前迫切需要解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以海参为原料，针对现有技术中存在的缺陷和 不足，结合高速剪切技术、酶切技术和大孔树脂混合模拟移动床技术从海参中 纯化高纯度海参多肽，从而弥补现有技术的不足。
本发明的方法，包括以下步骤：
1）向处理后的新鲜海参或水发后的海参中加入去离子水粉碎，置入发酵罐 中，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶切，酶切后进行高温灭酶灭菌；
2）将灭酶灭菌后的海参酶解液冷却至室温后，离心，收集上清液，得海参 多肽提取液；
3）将海参多肽提取液直接加入大孔吸附树脂柱进行反复多次吸附，流速为 5～10BV/h（柱体积，简称BV），收集吸附残液；吸附结束后，用10～40BV 的洗脱液进行洗脱，流速为5～10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并；将 溶液干燥后得到海参多肽产品。
步骤1）中的粉碎方法为高速剪切机、均质机、胶体磨、匀浆机等中的一种 或几种。
步骤1）中的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白 酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶 中的一种或几种的复合酶。
步骤3）中大孔吸附树脂与海参多肽提取液的质量比为20:1～10，树脂柱径 高比为1:4～1:12；
为了获得更好的分离效果，其中步骤3）中的大孔吸附树脂为混合树脂，其 中AB-8：D101：LSA-21的质量比为2:1:1；
步骤3）中的洗脱液中乙酸乙酯：乙醇：水的体积比为0.5:1:98.5。
步骤3）中的干燥方法为喷雾干燥、微波干燥、真空干燥，鼓风干燥中的一 种或几种。
本发明方法的海参多肽的提取率大于70%，提取纯化的海参多肽纯度均达 到90%以上，而且大孔吸附树脂的再生性能好，可以再生重复使用，洗脱剂无 毒无害，也可以回收多次利用。本发明与已有技术方法相比，特点在于提供了 一种提取高纯度海参多肽的制备工艺；而生产过程中使用绿色溶剂，成本低、 效率高、环境友好；工艺路线简单，可为药物、保健品或食品等提供高纯度的 海参多肽。本发明可进一步促进海参多肽的产业化开发。
附图说明
图1：本发明的工艺流程示意图。
具体实施方式
在海参多肽的提取中，洗脱液的组分及配比对提取效果具有重要的影响， 既要保证提取率，又要保证纯度。因此，申请人经过长期的研究，确定海参多 肽提取的洗脱液的组分及配比。
实施例1
称取处理后的新鲜海参120g置于烧杯中，加入600ml去离子水浸泡，用 高速剪切机进行剪切粉碎，将剪切后的海参溶液置于发酵罐中，用去离子水稀 释至3000ml，然后向发酵罐中分别加入1g木瓜蛋白酶和0.6g胃蛋白酶的复配 酶，在45℃下，酶切3h后，利用发酵罐在121℃下灭酶灭菌20min。将灭酶灭 菌后的海参酶解液冷却至室温后，4000r/min下离心15min，收集上清液，得海 参多肽提取液。
称取300g NKA-9型大孔吸附树脂与320g AB-8型大孔吸附树脂在水溶液 中均匀混合，湿法装入一根内径8cm、柱高120cm的玻璃柱中，利用泵将海参 多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为6BV/h， 收集吸附残液；吸附结束后，用10BV的乙酸乙酯:乙醇:水（0.5:1:98.5,v/v）进 行洗脱，流速为5BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并溶液喷雾干 燥后得到海参多肽产品。
对本品进行高效液相色谱法（HPLC法）检验，海参多肽的纯度为80.3%， 海参多肽的提取率为73%。树脂柱以70%乙醇除杂后，再以95%乙醇再生重复 使用，并回收溶剂。
上述的液相色谱法的测定条件如下：
色谱柱：TSKgel G2000SWXL（300mm I.D.×7.8mm）；
流动相：乙腈：水：三氟乙酸为20:80:0.03(体织比〉。
流速为0.5mL/min；
检测波长为214nm；
进样量为10μL。
实施例2
称取处理后的新鲜海参200g置于烧杯中，加入800ml去离子水浸泡，用 高速剪切机进行剪切粉碎，然后用均质机均质，将均质后的海参溶液置于发酵 罐中，用去离子水稀释至10000ml，然后向发酵罐中分别加入1g风味蛋白酶和 1g胰蛋白酶的复配酶，在50℃下，酶切2h后，利用发酵罐在121℃下灭酶灭 菌25min。将灭酶灭菌后的海参酶解液冷却至室温后，4000r/min下离心15min， 收集上清液，得海参多肽提取液。
为了获得更好的分离效果，称取950g型号为AB-8：D101：LSA-21（2:1:1） 均匀混合的大孔吸附树脂，湿法装入一根内径10cm、柱高150cm的玻璃柱中， 利用泵将海参多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流 速为5BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用10BV的乙酸乙酯:乙醇:水（0.5:1:98.5, v/v）进行洗脱，流速为8BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并溶液 喷雾干燥后得到海参多肽产品。
对本品进行高效液相色谱法（HPLC法）检验，海参多肽的纯度为93.2%， 海参多肽的提取率为85%。树脂柱以70%乙醇除杂后，再以95%乙醇再生重复 使用，并回收溶剂。
实施例3
称取处理后的新鲜海参1Kg置于烧杯中，加入4000ml去离子水浸泡，用 高速剪切机进行剪切粉碎，然后用胶体磨均质，将均质后的海参溶液置于发酵 罐中，用去离子水稀释至20L，然后向发酵罐中分别加入40g中性蛋白酶，在 50℃下，酶切3h后，利用发酵罐在121℃下灭酶灭菌25min。将灭酶灭菌后的 海参酶解液冷却至室温后，4000r/min下离心15min，收集上清液，得海参多肽 提取液。
称取10kg型号为AB-8：D101：LSA-21（2:1:1）均匀混合的大孔吸附树脂， 湿法装入一根内径30cm、柱高350cm的不锈钢柱中，利用泵将海参多肽提取 液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附5次，流速为10BV/h，收集吸附 残液；吸附结束后，用30BV的乙酸乙酯:乙醇:水（0.5:1:98.5,v/v）进行洗脱， 流速为8BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并溶液喷雾干燥后得到 海参多肽产品。而树脂柱以70%乙醇除杂后，再以95%乙醇再生重复使用。
对本品进行高效液相色谱法（HPLC法）检验，海参多肽的纯度为91%，海 参多肽的提取率为83%。结果表明，使用的洗脱液能够满足提取率和纯度两方 面的要求。