技术领域
本发明涉及在早期快速诊断肝病的方法。更具体地，本发明涉及抗脱 唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体；诊断肝病的方法，其使用所述的 单克隆抗体评价试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白；和用于免疫色谱的 诊断条，其由所述的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体和蓖麻凝集 素(RCA)组成。本发明的诊断装置可以方便地测量脱唾液酸α1-酸性糖蛋白 的浓度，并快速诊断肝病。
背景技术
肝病包括肝炎、肝硬化和肝癌，是韩国、日本、台湾、中国和其它东 南亚国家最流行的疾病。目前，通过评价患者尿中的胆红素或尿胆素原的 含量，通过测量谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶、全胆红素、白蛋白、 乳酸脱氢酶等的含量来分析血液中的生化组分的变化，和通过检测来自 乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的抗原或抗这些病毒的抗体， 已经可以诊断肝病。另外，通过甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)实验， 可以诊断肝硬化。但是，肝脏是一个复杂的器官，因为它有多种功能，且 不能从外表上非常特异性地揭示异常状态。而且，尚未建立早期诊断方法， 因而肝病经常难以治疗，因为它是在严重恶化以后才被确诊。
本发明的发明人已经开发出了一种标记，其可以在临床上早期诊断肝 病，且能准确地反映出患者的严重性，从而生产出了一种诊断试剂盒。本 专利申请和论文已经揭示，该标记是诊断肝病的显著试剂。
准确地说，本发明的发明人已经证实了韩国专利申请 PCT/KR00/00840(2000年8月1日)，美国专利申请09/662,363(2000年9 月13日)和韩国专利申请10-2000-0040609(2000年7月14日)中的诊断方 法和诊断试剂盒，其通过使用特异性抗体和凝集素来利用 夹心ELISA方法，并测量血液中的脱唾液酸糖蛋白。证实该技术是可再 现的和准确的，因而可以用于诊断肝功能和治疗肝病。
据报道，脱唾液酸糖蛋白作为血清中的标记代表着肝病的预后状态 (T.Sawamura等，Gastroenterology 1981，81：527～533；T.Sawamura等， Gastroenterology 1984，87：1217～1221)。另外，阐明了脱唾液酸糖蛋白有助 于检测肝癌的状况，因为其浓度与肝癌的严重性成比例(T.Sawamura等， Gastrologia Japonica 1985，20：201～208)。
常规地，从人或其它动物(例如兔子和小鼠)分离出针对脱唾液酸 糖蛋白的受体，纯化后用作捕获蛋白，以测量脱唾液酸糖蛋白的浓度。将 其标记上放射活性的底物后，进行竞争性放射性测定和电免疫扩散(J.S. Marshall等，J.Lab.Clin.Med.1978，92：30～37；N.Serbource-Goguel等， Hepatology 1983，3：356～359)。
不幸的是，存在一些问题。首先，难以大规模地得到针对脱唾液酸 糖蛋白的受体，但是检测试剂盒需要大量的脱唾液酸糖蛋白。在竞争性放 射受体测定中，使用放射性物质是危险的，且难以制备用于处理废弃物等 的特殊设备。在电免疫扩散中，定量分析数据非常困难。特别地，竞争性 测定不适用于一般的诊断试剂盒，因为其缺少准确性和再现性。
附图简述
从下面的详述中，结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述的和其 它的目的、特征和其它优点，其中：
图1显示了通过进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)从血浆中纯化出的α1-酸性糖蛋白(AGP)和去唾液酸化的α1- 酸性糖蛋白。
图2显示了通过进行蛋白印迹从本发明的杂交瘤细胞系生产出的抗 脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体。
图3显示了在本发明中通过实施ELISA方法制备出的单克隆抗体， 其仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白反应，且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白。
图4a显示了在本发明中制备的用于免疫色谱的诊断条的平面图。
图4b显示了在本发明中制备的用于免疫色谱的诊断条的正视图。
图5显示了使用在本发明中制备的用于免疫色谱的盒式诊断条测量 的结果，以浓度依赖方式显示了脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。
发明内容
为了解决上述的技术问题，且通过检测脱唾液酸糖蛋白来快速、容易 地诊断肝病，本发明人已经尝试开发了对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP) 特异性的单克隆抗体、使用所述的单克隆抗体诊断肝病的方法和用于该方 法的免疫色谱的诊断条。
本发明的目的是提供容易地检测肝病的装置和方法。
为了实现所述的目的，本发明提供了仅结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、 且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体也不 与脱唾液酸肝球蛋白和脱唾液酸α2-巨球蛋白作用。优选地，本发明的单 克隆抗体是亚类IgG1。
通过现有技术公开的方法(Davidson R.L.和P.S.Gerald 1976， Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol，Somatic Cell Genet.，2：165～176；Knott C.L.， Kuus-Reichel K.，Liu R.和Wolfert R.L.1997，Development of antibodies for diagnostic assays，In Price C.和Newman D.(eds.)，Principles and Practice of Immunoassay，2nd ed.New York，Stockton Press，36～64；Gillete R.W.1987， Alternatives to pristine priming for ascitic fluid and monoclonal antibody production，J.Immunol.Meth.99，21～23；Norwood T.H.，C.J.Zeigler和G. M.Martin 1976，Dimethyl sulphoxide enhances polyethylene glycol-mediated somatic cell fusion，Somatic cell Genet.，2：263～270)，可以制备出单克隆抗 体。更准确地，通过包含下述步骤的方法生产：(1)分离脱唾液酸α1-酸性 糖蛋白，和(2)免疫小鼠。
首先，为了大规模地生产上面得到的单克隆抗体，通过常规方法制备 出了杂交瘤细胞，经分离、筛选后，腹膜注射进小鼠中，然后从腹膜液中 收集。
具体地，通过专利申请[PCT申请PCT/KR00/00840(2000年8月1日)， 美国专利申请09/662,363(2000年9月13日)，韩国专利申请 10-2000-0040609(2000年7月14日)]所述的方法，从血液中纯化脱唾液 酸α1-酸性糖蛋白。将脱唾液酸α1-酸性糖蛋白悬浮到磷酸盐缓冲液中，通 过Titer-MAX混合，并用于免疫小鼠。从免疫的实验小鼠中分离出脾细胞 和骨髓瘤细胞，融合后，通过ELISA方法筛选对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白 特异性的杂交瘤细胞系。为了从上面的杂交瘤细胞大规模生产对脱唾液酸 α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体，将生产抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的 单克隆抗体的杂交瘤细胞注射进实验小鼠中，收集含有高水平的杂交瘤细 胞的小鼠腹膜液，分离对本发明的单克隆抗体特异性的细胞。
另外，本发明还提供了杂交瘤细胞系，其可以大规模地生产仅结合脱 唾液酸α1-酸性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体。
为了研究从杂交瘤细胞得到的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗 体对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白是否是特异性的，首先通过进行电泳和蛋白 印迹分析了脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。通过如实施例2所述的ELISA方法 等，进一步研究了本发明的单克隆抗体是否仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白 作用、且排斥其它的糖蛋白。
优选地，本发明提供了生产对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的亚型 IgG1单克隆抗体的杂交瘤细胞系，根据布达佩斯条约，其于2004年5月 24日保藏在韩国生命科学与生物技术研究所基因库中(保藏号KCTC 10261 BP)。
另外，本发明提供了检测肝病的方法，其包括下述步骤：(1)使得仅 结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗 体；作为特异性地识别脱唾液酸糖蛋白的凝集素的蓖麻凝集素(在下文中 称作“RCA”)；和试样反应；和(2)测量脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)。
在本发明的检测肝病的方法中，通过夹心(sandwich)酶免疫测定法 (在用于免疫色谱的诊断条上的酶免疫测定法)和不同类型的酶免疫测定 法，可以在微量培养板上分析试样。更特别地，在用于免疫色谱的诊断条 上的酶免疫测定法是这些方法中最方便的。
优选地，在本发明的诊断方法中使用的单克隆抗体是如上所述的亚型 IgG1。更优选地，从以保藏号为KCTC 10261 BP保藏的本发明的小鼠杂 交瘤细胞系生产单克隆抗体。此外，优选地使用识别脱唾液酸α1-酸性糖 蛋白的RCA作为凝集素。
本发明提供了用于免疫色谱的诊断条，其含有仅结合脱唾液酸α1-酸 性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体，和识别脱唾液 酸糖蛋白的凝集素RCA；其可以用于测量试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋 白的浓度，和快速地、容易地诊断肝病。
优选地，本发明提供了用于免疫色谱的诊断条，其包含保藏号为 KCTC 10261BP的单克隆抗体AS 16.89和作为凝集素的RCA。本发明的 用于免疫色谱的诊断条包含：包被了微粒(例如与单克隆抗体偶联的金胶 体)的玻璃纤维(GF)膜；硝化纤维膜(NC)，RCA带在其中排列作为诊断 线；和作为标准线的单克隆抗体带；吸收试样溶液的样品垫；排出非反应 性物质的吸收垫；和用于固定上述元件的粘合塑料底座。
本发明的用于免疫色谱的诊断条以适当的次序固定，优选地，NC膜、 GF膜、样品垫和吸收垫部分地重叠在粘合塑料底座上，以通过毛细管作 用平稳地转移物质。
可以通过常规方法制备用于免疫色谱的诊断条。优选地，本发明的诊 断条可以生产成盒式或杆式。
此外，试样优选地是用洗脱缓冲液稀释10倍的血液或血清，且洗脱 缓冲液优选地为50mM硼酸盐缓冲液，其含有5％蔗糖、1％牛血清白蛋 白或1％Triton X-100。
本发明的用于免疫色谱的诊断条可以用于如下检测肝病：当稀释试样 且滴到样品垫上时，3～5分钟后，标准线和诊断线都在带上着色，根据颜 色可以判断样品是否是肝病阳性的。准确地说，如果抗体-金偶联物形成 为微粒，包含脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的阳性样品会在测试后在标准线和 基准线上都显示红色，而包含正常水平的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的阴性 样品(非肝病患者)仅在标准线上显示红色。
如上所述，本发明的用于免疫色谱的诊断条可以检测直到边界值(约 1.50μg/ml)的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白，其可以早期诊断肝病，如果继续 评价肝硬化和肝癌患者中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的水平，还可以监视 其预后和治疗。
另外如上所述，仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥肝球蛋白 和α2-巨球蛋白的单克隆抗体和使用它的用于免疫色谱的诊断条，可以迅 速、方便地获悉实验结果，使得肝病可以容易地确诊。因此，期望其有助 于预防和治疗肝病。
实施例
如下面的实施例所示，解释了实用的和目前优选的本发明的实施方 案。
但是，本领域的技术人员应当理解，参考本说明书，可以在本发明的 精神和范围内进行修改和改进。
<实施例1>脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的分离和纯化
如下，从人血浆中含有的脱唾液酸糖蛋白分离和纯化出α1-酸性糖蛋 白(AGP)。
将2个NIH单位的凝血酶加入200ml人血浆中，在37℃储存2小时， 在4℃储存过夜，离心去除血块。使用0.05M醋酸钠缓冲液(pH 4.3)透析 上面制备的血清，装载到预先用相同缓冲液平衡的DEAE柱上，混合0.05 M醋酸钠缓冲液(pH 4.3)和0.1M醋酸钠缓冲液(pH 4.3)后，然后通过线性 浓度梯度洗脱。随后，在280nm检测光密度(OD)，数据如图1所示。收 集含有AGP和其它蛋白的级分，与硫酸铵混合至0.5g/ml，离心以沉淀蛋 白。再次将得到的上清液与硫酸铵混合至0.18g/ml，以沉淀蛋白，将沉淀 溶解到少量蒸馏水(D.W.)中，使用D.W.充分透析，然后冻干。
使用6ml 0.1N硫酸盐溶液，将40mg上面分离的AGP在80℃水解 2小时，使用1N氢氧化钠中和，然后使用0.01N磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 透析。将在上面方法中制备的去唾液酸化的α1-酸性糖蛋白(AsAGP)装载 到Sephadex G-200柱上，使用0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)过滤，通过 280nm的OD值计算，最终收集包含蛋白的级分。结果如图1所示：泳 道1是蛋白分子量的标准标记；泳道2是α1-酸性糖蛋白；泳道3和4是 脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)。
<实施例2>制备抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体
(1)小鼠的免疫
为了得到用于制备生产抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体的杂 交瘤细胞系的免疫的小鼠，使用Titer-MAX充分地悬浮作为抗原的脱唾液 酸α1-酸性糖蛋白，调节到50μg/50ml的浓度，然后注射进6～8周龄的 Balb/c小鼠的腹腔中。2周后，将相同量的在首次注射中提到的抗原与 Titer-MAX混合，并重复注射到相同位点。通过相同的方法，7天后再次 注射抗原，3周后重复注射。随后，从小鼠的尾巴收集少量血液，检测， 评价滴度。
(2)细胞融合
为了进行制备杂交瘤细胞系的细胞融合，用上述的脱唾液酸α1-酸性 糖蛋白抗原免疫小鼠，并从小鼠收集脾细胞和骨髓瘤细胞。然后，充分洗 涤108个脾细胞和107个骨髓瘤细胞(SP2/0)，混合到一起，经约1分钟倒 入1ml PEG 1500，轻轻搅拌约1分钟。随后，经约3分钟加入9ml RPMI 培养基，缓慢搅拌达到50ml的终体积。离心细胞悬浮液，收集细胞沉淀， 再使用HAT培养基悬浮到1～2×105细胞/ml，以0.2ml体积/孔倒入96- 孔微量培养板中，然后在CO2培养箱中在37℃孵育。
(3)筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞
为了筛选对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的杂交瘤细胞，使用包被 了脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的微量培养板，如下进行了ELISA方法。准确 地说，以100μl(1μg/ml)/孔将脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原置于微量培养 板中，以包被表面，洗去未反应的抗原。向每个孔中加入100μl杂交瘤细 胞的培养基，反应2小时，使用Tween 20磷酸盐缓冲液(PBST)洗掉未反 应的培养基。随后，加入山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)，在室温 反应1小时，使用PBST溶液洗掉。然后，使用邻苯二胺(OPD)作为过氧 化物酶的底物，反应后，用ELISA读数仪，在490nm检测OD值。
结果，首先筛选到了分泌出高度结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原的 抗体的细胞系，并重复选择以分离分泌对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原特 异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过有限稀释处理得到的细胞，形成单 克隆，再筛分能生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系。随后，收集了2个具有 最高滴度的克隆，例如脱唾液酸α1-酸性糖蛋白1和脱唾液酸α1-酸性糖 蛋白2，通过ELISA方法检测培养基上清液的滴度，然后通过双免疫扩 散分析了单克隆抗体的亚基类型。结果，将本发明的克隆分泌的抗体分别 鉴别为IgG1和IgM。
已经将分泌IgG1的细胞系命名为AS 16.89，并于2004年5月24日 保藏在韩国生命科学与生物技术研究所基因库中(保藏号KCTC 10261 BP)。
(4)大规模生产和纯化单克隆抗体
为了从杂交瘤细胞大规模地生产单克隆抗体，将0.5ml姥鲛烷注射进 Balb/c小鼠的腹腔中。1周后，将在上面步骤(3)得到的每个细胞系以5×106个细胞/小鼠注射进实验小鼠中，然后如果膨胀从腹腔收集腹膜液。在 12,000rpm离心腹膜液，收集细胞，通过蛋白G柱过滤得到的上清液，分 离和纯化抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体，储存在-20℃，用于下 一个实验。
(5)通过蛋白印迹鉴别单克隆抗体的特异性
为了阐明对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体的性质，通 过进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹，鉴别了通过上述步骤(4)纯 化出的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体(见图2)。通过现有技术的 典型方法，进行了蛋白印迹。在图2中，泳道1是蛋白分子量的标准标记； 泳道2是α1-酸性糖蛋白；泳道3是脱唾液酸α1-酸性糖蛋白；泳道4是 α2-巨球蛋白；泳道5是肝球蛋白。
(6)通过酶免疫化学测定鉴定单克隆抗体的特异性
将脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、肝球蛋白、α2-巨球蛋白抗原分别以100μl (1μg/ml)/孔加到96-孔微量培养板中，结合到表面上，与加入的100μl抗 脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体反应2小时，使用磷酸盐缓冲液 -Tween 20(PBST)洗掉未反应的培养基。而且，加入山羊抗小鼠IgG-HRP， 在室温反应1小时，使用PBST溶液充分洗涤。然后，加入邻苯二胺(OPD) 作为过氧化物酶的底物，反应后，用ELISA读数仪，在490nm检测OD 值。结果，证实了上面纯化的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体是 对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体(见图3)。在图3中，AGP 显示了α1-酸性糖蛋白和AsAGP，本发明的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。
<实施例3>通过用于免疫色谱的诊断试剂盒检测肝病
如下，生产了本发明的用于免疫色谱的诊断试剂盒，其可以通过上面 生产的对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体As 16.89和血液中 的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白之间的免疫反应，测量试样中的脱唾液酸α1- 酸性糖蛋白的浓度，并用于临床领域。
(1)用于免疫色谱的诊断试剂盒的制备
用于检测血液中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的诊断试剂盒由如下所述 的组分组成。
A.固定在固体载体(例如微量培养板)上的对脱唾液酸α1-酸性糖 蛋白特异性的单克隆抗体(As16.89)
B.抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的凝集素(RCA)-辣根过氧化物酶 (HRP)
C.样品稀释缓冲液(1％BSA/PBST)
D.酶底物溶液(OPD)
E.洗涤缓冲液(PBST)
F.脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的标准溶液
G.终止缓冲液
(2)测量
a.将100μl脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的标准溶液(1μg/ml)分别加入 固定有单克隆抗体As 16.89的微量培养板上。从St.Mary Hospital， Catholic Medical School得到了实验样品，其中包括40个正常人、155个 没有肝病的患者、36个急性肝炎的患者、272个慢性肝炎(CH)的患者、230 个肝硬化的患者、72个从肝硬化发展成的肝癌(HCC)的患者。使用稀释缓 冲液，以1∶10的比例稀释血液样品，以100μl分配到微量培养板的每个 孔上，在室温温育120分钟。
b.反应后，向每个孔如入100μl洗涤缓冲液，重复洗涤3次。
c.将通过制备方法稀释的凝集素(RCA)-HRP分配到微量培养板的每 个孔上，在室温反应60分钟。
d.重复步骤b。
e.将酶底物溶液(OPD)分配到上面微量培养板的每个孔中。
f.向每个孔中加入100μl终止缓冲液，终止酶反应。
g.使用ELISA读数仪，在490nm测量OD值。
结果，通过上述方法评价了血液中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度， 如表1所示。
<表1>
血液AsAGP的测量
(边界值：1.50μg/ml)
结果，证实了正常人和无肝病的患者的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白 (AsAGP)的浓度平均水平低于1.00μg/ml，AsAGP的浓度超过1.50μg/ml 的样品数目是约10％。在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和具有肝硬化的肝 癌的患者组中，测得AsAGP的平均血液水平分别为1.33μg/ml、1.63 μg/ml、3.12μg/ml和3.64μg/ml。这些浓度与标准组的浓度明显不同，即 使AsAGP超过1.5μg/ml的样品的比例分别为25％、36％、72％和82％。 因此，证实了该实验能有效地诊断肝病。
因而，根据上述数据，当本发明的单克隆抗体As 16.89用于酶免疫 测定法时，确定诊断肝病的边界值是1.50μg/ml。
<实施例4>制备用于免疫色谱的诊断条
(1)制备单克隆抗体-金偶联物
向金颗粒的胶体溶液中，加入15μg/ml在本发明中选择的对脱唾液酸 α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体，在室温反应2小时，并旋转。然后， 以1/10体积混合10％BSA，形成1％的浓度，再次反应1小时，制备抗体 -金偶联物。随后，将得到的产物在12,000rpm离心40分钟，抛弃上清液， 加入2mM硼酸盐缓冲液，洗掉抗体-金偶联物。重复洗涤产物3次，最 后将含有1％BSA的2mM硼酸盐缓冲液加入约1/10体积的金溶液中， 并悬浮。用紫外分光计检测后，通过稀释将530nm的OD值调节到3.00。
(2)样品垫
样品垫是能吸收试样的膜，且由用于该目的的纤维素材料制成。
(3)玻璃纤维(GF)膜
玻璃纤维是试样中的AsAGP和通过本发明的方法制备出的单克隆抗 体于其上反应的组件。GF膜在表面上包被有金胶体颗粒-As 16.89，且如 下制备。
如步骤(1)所述，使从本发明的杂交瘤细胞系As 16.89生产的单克隆 抗体偶联到膜上。
使用20mM硼酸钠缓冲液浸泡购自Millipore Co.Ltd的GF膜(1.0cm ×0.7cm)，将金胶体颗粒-As 16.89均匀地喷雾到表面上，在37℃干燥， 从而制备出用于免疫色谱的GF膜垫(即偶联垫)，其上面固定有与着色颗 粒偶联的单克隆抗体。
(4)硝化纤维(NC)膜和排列
将购自Millipore CoLtd的硝化纤维膜切成合适的大小(0.7cm×5 cm)，排在离塑料底座的底部约3.4cm的位点，山羊抗小鼠IgG作为标准 线，在2.7cm的位点作为基准线，用于通过使用购自EY Lab的RCA检 测脱唾液酸α1-酸性糖蛋白，然后干燥，完成NC膜。
(5)吸收垫
纤维素膜用于吸收免疫反应后试样中的未反应的物质，并通过毛细管 作用转移样品溶液。
(6)制备用于免疫色谱的诊断条
如图4a和图4b所示，将上述的膜固定到粘合塑料底座上。准确地说， 将NC膜、GF膜、样品垫和吸收垫以适当的次序排列，均匀地重叠约 0.1cm部分，通过粘合剂固定，以通过毛细管作用平稳地转移物质。
<实施例5>使用用于免疫色谱的诊断条分析脱唾液酸α1-酸性糖蛋 白
使用洗脱缓冲液(例如含有5％蔗糖、1％牛血清白蛋白或1％Triton X-100的50mM硼酸盐缓冲液)，以1∶10的比例稀释血清样品，并以60～ 70μl的体积加在实施例4中制备的用于免疫色谱的诊断条的样品垫上， 在3～5分钟后，检测标准线和基准线是否着色。
图5显示了从用于免疫色谱的盒式条得到的结果。编号1是α1-酸性 糖蛋白(AGP)、肝球蛋白和α2-巨球蛋白的混合物的标准滴加；编号2是 正常人的血清的诊断条；编号3～编号6分别是1.5μg/ml、2.0μg/ml、3.0 μg/ml和4.0μg/ml脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的带。如图5所示，在编号3中， 该线是模糊的；在编号4～编号6中，标准线(上)和基准线(下)的红色都是 清楚的。
观察了本发明的用于免疫色谱的诊断条，在低于边界值1.50μg/ml脱 唾液酸α1-酸性糖蛋白的正常人的试样(阴性的)中，仅仅标准线变成红 色，因为没有形成抗原-抗体-酶偶联复合物。另一方面，当由于肝病使脱 唾液酸α1-酸性糖蛋白的水平增加到超过1.50μg/ml时，2条线都变红， 其中脱唾液酸α1-酸性糖蛋白吸附在样品垫上，与GF膜上的金颗粒-单克 隆抗体As 16.89偶联物反应，形成免疫复合物，通过毛细管作用转移到 NC膜上，并与NC膜上的基准线中的RCA偶联，形成金沉淀。而且，根 据脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，可以改变基准线的厚度和颜色密度。 因此，通过试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，可以预测肝病的严 重性。
工业实用性
如上所述，本发明的对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体和 诊断条和使用它们用于免疫色谱的诊断试剂盒，可以用于快速、容易地评 价血液样品中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。因此，本发明的单克隆抗体和 诊断装置可以有效地检测肝病的严重性、治疗和预后肝病。
本领域的技术人员应当明白，可以容易地使用前面说明书中公开的概 念和具体实施方案作为改进或设计用于实现本发明的相同目的的其它实 施方案的基础。
本领域的技术人员还应当明白，这些等同的实施方案没有背离所附权 利要求书所述的本发明的精神和范围。