技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引 物及其检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
沃尔巴克氏体(Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是昆虫共 生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目 等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于宿主的 生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性化和杀 雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。
在沃尔巴克氏体(Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的 雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精子和卵子结合后胚胎无法发 育。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致Wolbachia感染的蚊能侵入未感染 或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的 价值。近期研究发现，沃尔巴克氏体(Wolbachia)不仅具有上述的特性外，同时它还能在蚊 子体内与蚊子携带的一些重要的病原生物(如登革病毒，疟原虫等)相互作用，抑制它们在 蚊子体内的增值和扩散从而在阻断这些病原生物传播于人类。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的 这种抑制作用与它在蚊子体内组织的分布相关，所以，了解沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊 子体内组织分布有助于快速筛选出传播阻断效果最好的沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的蚊 子，也有助于监测沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊群中的垂直传播，同时也有利于高效率地 监测大规模大地域范围的沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子组织中的感染情况。
在自然界中，蚊子的种类有很多，常见的有伊蚊和库蚊两种。伊蚊分为白纹伊蚊和埃及 伊蚊，其中埃及伊蚊不携带沃尔巴克氏体。由于沃尔巴克氏菌只能存活于宿主体内，不能在 体外自由生活，因而如何有效特异地检测沃尔巴克氏菌是对该细菌研究的必备工具。比较常 用的检测手段有聚合酶链反应法(PCR法)和免疫染色法。免疫染色法耗时耗力，而且特异 性不好。随着PCR方法的普及，针对沃尔巴克氏体的检测有了很大的进步。不同蚊种携带不 同的沃尔巴克氏体，通过PCR结果能够直观的看出蚊子携带的不同沃尔巴克氏体类型，这样 为我们的日常检测提供了很大的便利。目前针对不同沃尔巴克氏体PCR检测的方法还不完善。
发明内容：
本发明的目的是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏 体的荧光检测引物。
本发明的伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物，其特征在于，包括
(1)针对伊蚊A型沃尔巴克氏体：
wAlbAF：5’-GACATCAGGGTTGATGTTGA-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
wAlbAR：5’-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所 示)；
探针A：5’-ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所 示)；
探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；
(2)针对库蚊沃尔巴克氏体：
wPipF：5’-GCAGGGCTATATTTTGGG-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；
wPipR：5’-ATCAGTTTCTAGGTCATT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；
探针B：5’-TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；
探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。
本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏 体的检测方法，其特征在于，提取样品DNA，以该样品DNA为模板，使用上述伊蚊A型和 库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物wAlbAF、wAlbAR、探针A、wPipF、wPipR和探针B，进 行荧光定量PCR扩增，扩增反应完成后，根据探针标记的荧光发生基团的荧光信号，读取并 记录样品的PCR循环次数Ct，根据样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品是否含有 伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体。
所述的进行荧光定量PCR扩增，其反应条件优选为：预变性50℃5分钟，95℃15分钟； 扩增94℃15秒、55℃45秒，40个循环；55℃的时候收集荧光信号。
本发明的第三个目的是提供一种伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括荧光 检测引物和PCR试剂，其特征在于，所述的荧光检测引物包括
(1)针对伊蚊A型沃尔巴克氏体：
wAlbAF：5’-GACATCAGGGTTGATGTTGA-3’；
wAlbAR：5’-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3’；
探针A：5’-ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3’；
探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；
(2)针对库蚊沃尔巴克氏体：
wPipF：5’-GCAGGGCTATATTTTGGG-3’；
wPipR：5’-ATCAGTTTCTAGGTCATT-3’；
探针B：5’-TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3’；
探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。
利用本发明的荧光检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出伊蚊A型 和库蚊沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体， 而伊蚊B型沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为100copies/ml。
因此，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。
附图说明：
图1是伊蚊A型沃尔巴克氏体的灵敏度的实验结果图，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别代表DNA 抽提液，10、100、1000倍稀释的DNA抽提液；
图2是库蚊沃尔巴克氏体的灵敏度的实验结果图，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别代表DNA抽提 液，10、100、1000倍稀释的DNA抽提液；
图3是伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的重复性的实验结果图，其中Ⅰ、Ⅱ分别代表不同的样 品的扩增曲线；
图4是FAM检测通道对A型沃尔巴克氏体的特异性的实验结果图；
图5是FAM检测通道对B型和wPip型沃尔巴克氏体(库蚊沃尔巴克氏体)的特异性的实验 结果图；
图6是HEX检测通道对wPip型沃尔巴克氏体(库蚊沃尔巴克氏体)的特异性的实验结果图；
图7是HEX检测通道对A型和B型沃尔巴克氏体的特异性的实验结果图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：灵敏度
一、伊蚊A型沃尔巴克氏体的灵敏度
1、一只携带伊蚊A型沃尔巴克氏体的蚊子经二氧化碳熏晕后，解剖腹部置于0.2ul EP 管中；
2、加入20ulDNA提取液(DNA提取液的配方为：30mM NaOH、0.25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶剂为水，使用前需振荡，将白色片状物一同加入)；
3、充分混匀；
4、瞬时离心后，99℃温浴10分钟；
5、得到DNA抽提液，-20℃保存，即获得伊蚊A型沃尔巴克氏体的基因组DNA；
6、将DNA抽提液进行10，100，1000梯度稀释，每个梯度有两个平行，共8个样本， 作为模板DNA进行PCR扩增；
7、PCR扩增体系：
模板DNA 2μl、PCR A液18μl和PCR B液2μl。
所述的PCR A液，每18μl含有10pmol荧光检测引物wAlbAF(5’-GACATCAGGGTTG ATGTTGA-3’)、10pmol荧光检测引物wAlbAR(5’-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3’)、5 pmol探针A(5’-ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生 基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1)，10pmol荧光检测引物wPipF(5’-GCAGGGCTATATTTT GGG-3’)、10pmol荧光检测引物wPipR(5’-ATCAGTTTCTAGGTCATT-3’)、5pmol探针B(5’ -TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX 和荧光淬灭基团BHQ1)，其余为pH值为8.0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/L Tri s-HCl、8mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl，溶剂为水。
所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2μl PCR B液中含有热 启动Taq酶5U、逆转录酶2.5U和dNTPs 10mmol，其余为水。
8、混匀后进行PCR扩增；
9、PCR反应条件：
预变性 50℃ 2min
95℃ 15min
扩增 94℃ 15s
55℃ 45s 40个循环，55℃时收集荧光
10、扩增结束后观察扩增曲线。
具体结果如图1所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值小于 38，则判断为阳性，如果38<Ct<40，判断为可疑，可疑加大模板量，重复扩增，如果得到相 同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40，则判断为阴性。
从图1可以看出，DNA抽提液、10、100、1000倍稀释的DNA抽提液都能扩增出反应 曲线，其Ct都小于38，判断为阳性，1000倍稀释的溶液中的DNA浓度为100copies/ml。由 此，本发明的荧光检测引物的检测下限为100copies/ml。
二、库蚊沃尔巴克氏体的灵敏度
库蚊沃尔巴克氏体的灵敏度的实验流程同A型沃尔巴克氏体的灵敏度试验，只是模板 DNA换成库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA。
具体结果如图2所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值小于 38，则判断为阳性，如果38<Ct<40，判断为可疑，可疑加大模板量，重复扩增，如果得到相 同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40，则判断为阴性。
从图2可以看出，DNA抽提液、10、100、1000倍稀释的DNA抽提液都能扩增出反应 曲线，其Ct都小于38，判断为阳性，1000倍稀释的溶液中的DNA浓度为100copies/ml。由 此，本发明的荧光检测引物的检测下限为100copies/ml。
实施例2：重复性
1、两只携带伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的蚊子经二氧化碳熏晕后，解剖腹部分别置 于0.2ul EP管中；
2、加入20ul DNA提取液(DNA提取液的配方为：30mM NaOH、0.25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶剂为水，使用前需振荡，将白色片状物一同加入)；
3、充分混匀；
4、瞬时离心后，99℃温浴10分钟；
5、得到DNA抽提液，-20℃保存，即获得伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA；
6、上述伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA作为模板DNA进行10次重复，共 计20个样本；
7、PCR扩增体系：
模板DNA 2μl、PCR A液18μl和PCR B液2μl。
所述的PCR A液，每18μl含有10pmol荧光检测引物wAlbAF(5’-GACATCAGGGTTG ATGTTGA-3’)、10pmol荧光检测引物wAlbAR(5’-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3’)、5 pmol探针A(5’-ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生 基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1)，10pmol荧光检测引物wPipF(5’-GCAGGGCTATATTTT GGG-3’)、10pmol荧光检测引物wPipR(5’-ATCAGTTTCTAGGTCATT-3’)、5pmol探针B(5’ -TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX 和荧光淬灭基团BHQ1)，其余为pH值为8.0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/L Tri s-HCl、8mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl，溶剂为水。
所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2μl PCR B液中含有热 启动Taq酶5U、逆转录酶2.5U和dNTPs 10mmol，其余为水。
8、混匀后进行PCR扩增；
9、PCR反应条件：
预变性 50℃ 2min
95℃ 15min
扩增 94℃ 15s
55℃ 45s 40个循环，55℃时收集荧光
10、扩增结束后观察扩增曲线。
具体结果如图3所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值小于 38，则判断为阳性，如果38<Ct<40，判断为可疑，可疑加大模板量，重复扩增，如果得到相 同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40，则判断为阴性。
从图3可以看出，2份伊蚊A和库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA样品各10次重复都能 扩增出反应曲线，其Ct都小于38，判断为阳性，由此说明，本发明的荧光检测引物重复性 好。
实施例3：特异性
1、两只含单A型的沃尔巴克氏体、两只含单B型的沃尔巴克氏体的白纹伊蚊和两只广 州致倦库蚊(含库蚊沃尔巴克氏体)，共6只蚊子经二氧化碳熏晕后，解剖腹部分别置于0.2ul EP管中；
2、分别加入20ul DNA提取液(DNA提取液的配方为：30mM NaOH、0.25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶剂为水，使用前需振荡，将白色片状物一同加入)；
3、充分混匀；
4、瞬时离心后，99℃温浴10分钟；
5、得到DNA抽提液，-20℃保存，即分别获得两份伊蚊A型沃尔巴克氏体的基因组DNA、 两份伊蚊B型沃尔巴克氏体的基因组DNA和两份库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA共六份， 以这六份基因组DNA分别作为模板DNA进行PCR扩增。
6、
PCR组1：
模板DNA 2μl、PCR A液18μl和PCR B液2μl。
所述的PCR A液，每18μl含有10pmol荧光检测引物wAlbAF(5’-GACATCAGGGTTG ATGTTGA-3’)、10pmol荧光检测引物wAlbAR(5’-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3’)、5 pmol探针A(5’-ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生 基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1)，其余为pH值为8.0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50 mmol/L Tris-HCl、8mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl，溶剂为水。
所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2μl PCR B液中含有热 启动Taq酶5U、逆转录酶2.5U和dNTPs 10mmol，其余为水。
PCR组2：
模板DNA 2μl、PCR A液18μl和PCR B液2μl。
所述的PCR A液，每18μl含有10pmol荧光检测引物wPipF(5’-GCAGGGCTATATTT TGGG-3’)、10pmol荧光检测引物wPipR(5’-ATCAGTTTCTAGGTCATT-3’)、5pmol探针B(5’ -TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX 和荧光淬灭基团BHQ1)，其余为pH值为8.0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/L Tri s-HCl、8mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl，溶剂为水。
所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2μl PCR B液中含有热 启动Taq酶5U、逆转录酶2.5U和dNTPs 10mmol，其余为水。
8、混匀后进行PCR扩增；
9、PCR反应条件：
预变性 50℃ 2min
95℃ 15min
扩增 94℃ 15s
55℃ 45s 40个循环，55℃时收集荧光
10、扩增结束后观察扩增曲线。
具体结果如图4、图5、图6和图7所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应 曲线，且Ct值小于38，则判断为阳性，如果38<Ct<40，判断为可疑，可疑加大模板量，重 复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40，则 判断为阴性。
从图4和图5可以看出，FAM通道(只用针对伊蚊A型沃尔巴克氏体的荧光检测引物 wAlbAF、wAlbAR和探针A，PCR组1)只显示伊蚊A型沃尔巴克氏体的扩增曲线，其为阳 性，而B型沃尔巴克氏体和库蚊沃尔巴克氏体都没有扩增曲线，为阴性。
从图6和图7可以看出，HEX通道(只用针对库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物wPipF、 wPipR和探针B，PCR组2)只显示库蚊沃尔巴克氏体的扩增曲线，其为阳性，而A型沃尔 巴克氏体和B型沃尔巴克氏体都没有扩增曲线，为阴性。
由此说明，本发明的荧光检测引物只检测出伊蚊A型沃尔巴克氏体和库蚊沃尔巴克氏体， 而B型沃尔巴克氏体不发生扩增，并能分辨出伊蚊A型沃尔巴克氏体和库蚊沃尔巴克氏体。