γ－L－谷氨酰－L－半胱氨酸的合成方法
一、技术领域
本发明涉及γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸(γ-GC)的合成方法，属于化学合 成领域。
二、技术背景
γ-L-氨酰-L-胱氨酸可以用作制备改善食物味道的食品添加剂[中国专 利CN 1550157A]，它还是生物合成还原型谷胱甘肽(glutathione)的重要前 体。还原型谷胱甘肽是一种小分子自由基清除剂，能清除O2、H2O2。它是由谷氨 酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化 合物，是多种酶的底物，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋自及其它辅助因子受氧 化损伤。还在动脉硬化、冠心病、防衰老、抗肿瘤和老年痴呆症等疾病治疗过程 中起重要作用。
虽然可通过化学或生物合成的方法制备谷胱甘肽，目前化学合成需要经过 基团保护、缩合、脱保护等众多步骤，收率低、产品质量不高、成本高等不足， 制约了工业化生产；生物合成主要是利用动植物细胞、细菌和酵母合成谷胱甘肽， 生物合成谷胱甘肽的酶有γ-L-氨酰-L-半胱氨酸合成酶(GSH1)与谷胱甘肽 合成酶(GSH2)组成。产物谷胱甘肽对GSH1有抑制作用，因此一般的生物合 成方法难以实现工业化生产。
为了解决工业化生产谷胱甘肽的难题，本发明采用化学结合生物的方法合 成谷胱甘肽。即首先用化学合成的方法制备γ-GC，具体是以苯酐作为保护基， 与L-谷氨酸反应生成邻苯二甲酰-L-谷氨酸，其在醋酐中回流制备邻苯二甲酰- L-谷氨酸酐，邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐在水溶液中与胱氨酸钠盐缩合生成二邻苯 二甲酰-γ-L-氨酰-L-胱氨酸，经水合肼去保护、电解还原制备γ-L-氨酰- L-半胱氨酸(γ-GC)；再利用具有高活性谷胱甘肽合成酶(GSH2)的基因工程 菌将γ-GC与甘氨酸缩合成谷胱甘肽。此合成路线优点在于化学法合成谷胱甘肽 前体γ-GC收率高、成本低，无需γ-GC合成酶GSH1参与生物合成过程，也就 不存在产物抑制问题。因此具有很好的工业化前景。
目前报道制备γ-GC的方法很少，仅有Harington等[Harington，C.A.； Mead，T.H.Biochem.J.1935，29，1602]采用N-苄氧基-L-谷氨酸的α甲酯 与L-胱氨酸乙酯缩合后，经锌粉还原、皂化反应得N-苄氧基-γ-L谷氨酰-L- 胱氨酸，在冰醋酸中用碘化磷还原为γ-GC，收率低且实验不易重复。
三、发明内容
1.发明目的
本发明的目的是提供生物合成还原型谷胱甘肽的前体物质γ-GC的一种合 成新方法，该方法具有原料价格低廉、生产成本低、选择性高、反应速度快、收 率高的特点。
2.技术方案
一种γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(γ-GC)的合成方法，其方法步骤为：
(1)由L-谷氨酸与邻苯二甲酸酐在熔融条件下生成邻苯二甲酰-L-谷氨酸；
(2)由邻苯二甲酰-L-谷氨酸与醋酸酐回流产生邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐；
(3)由邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐与L-胱氨酸盐的水溶液直接作用生成二邻苯二 甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸盐；
(4)二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸盐经酸酸化后得二邻苯二甲酰-γ-L- 谷氨酰-L-胱氨酸；
(5)由二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸直接与水合肼溶液反应脱除邻苯 二甲酰基而获得γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；
(6)γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸经电解还原制备γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。
在上述步骤(1)中邻苯二甲酸酐与L-谷氨酸的摩尔比为1.0～2.0，反应温 度为120～180℃，反应时间为20-180分钟。
在上述步骤(2)中醋酸酐与邻苯二甲酰-L-谷氨酸的摩尔比为1.0～10.0， 回流时间为3～20分钟。
在上述步骤(3)中L-胱氨酸盐是通过L-胱氨酸与碱反应制备，其碱包括碳 酸钠、碳酸钾、氢氧化钠和氢氧化钾，其中邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐与L-胱氨酸 盐的摩尔比为2.0～4.0，L-胶氨酸盐溶液的百分比浓度为1～20wt％，反应温 度为-10～35℃。
在上述步骤(3)中L-胱氨酸盐与邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐的反应液pH为7～ 11。
在上述步骤(4)中所述的酸包括无机酸中的盐酸、硫酸、硝酸和磷酸等或 有机酸中的甲酸、乙酸和草酸，其浓度为1.0～10.0mol/L。
在上述步骤(5)中所述的水合肼溶液为水合肼的水溶液，或水合肼的乙醇 溶液，或水合肼的乙醇与水的混合溶液，反应温度为-10～35℃，反应时间为48 小时，所用水合肼溶液的百分比浓度为1～10wt％。
在上述步骤(6)中所述的电解还原所用的电流为10-100A。
3.有益效果
本发明与现有技术相比，具有以下的显著特点：
(1)本发明采用价格低廉的邻苯二甲酰基作为L-谷氨酸-α-氨基的保护基合成 γ-GC，每步反应产物易结晶分离，具有生产成本低的优势；
(2)利用电解还原L-胱氨酸的二硫键为巯基，可避免金属还原的效率低、污染 环境的缺陷；
(3)在室温下，直接用L-胱氨酸盐水溶液与邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐反应，反 应速度快、选择性好、收率高。
四、具体实施方式
实施例1
L-谷氨酸147克、邻苯二甲酰酐148克加入500ml烧瓶中，控制油浴温度 150±5℃、熔融后反应45分钟，趁热倾入沸水中，冷却结晶得到邻苯二甲酰-L- 谷氨酸224.4克(收率81％)；邻苯二甲酰-L-谷氨酸55.4克在醋酸中煮沸5分 钟产生邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐46.6克(收率90％)；将该酸酐31.0克在室温下 与12.0克L-胱氨酸、氢氧化钠4.0克、水100ml溶液反应，通过滴加10wt％碳 酸钠溶液维持反应液pH 8～10，8小时后用6 mol/L的盐酸酸化得到30.3克二 邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸(收率80％)；将二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰 -L-胱氨酸22.7克在室温下直接溶于150毫升的3％的水合肼的水溶液中放置二 天，用6mol/L硫酸酸化，调pH至2，过滤除去邻苯二甲酰肼沉淀，清液减压 浓缩，滴加4mol/L氢氧化钠溶液调pH至5.5，用95％乙醇析出γ-L-谷氨酰-L 胱氨酸12.6克(收率84％)；10.0克γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸，在电解电流90A 条件下，电解还原制得9.4克γ-GC(总收率46％)。
实施例2
邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐的制备方法同实施例1，将该酸酐31.0克在室温下 与12.0克胱氨酸、碳酸钠10.6克、水100ml溶液反应，通过滴加10 mol/L氢 氧化钠溶液维持反应液pH 8～10，8小时后用6 mol/L硫酸酸化得到31.1克二 邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸(收率83％)；以下步骤同实施例1，得9.7 克γ-GC(总收率47％)。
实施例3
以实施例2相同的操作步骤合成二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；称 取二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸16克在室温下直接溶于100毫升的3％ 水合肼的水和乙醇溶液中放置二天，用6mol/L甲酸酸化，调pH至3，过滤除去 邻苯二甲酰肼沉淀，滤液减压浓缩，滴加4mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0，用 95％乙醇析出γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸8.9克(收率88％)；以实施例1相同的操 作步骤制备γ-GC(总收率48％)。
实施例4
以实施例1相同的操作步骤合成二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸；称 取二邻苯二甲酰-γ-L-谷氨酰-L-氨酸16克在室温下直接溶于100毫升的3％ 水合肼的水和甲醇溶液中放置二天，用20％(w/v)草酸水溶液酸化，调pH至3， 过滤除去邻苯二甲酰肼沉淀，滤液减压浓缩，滴加4mol/L氢氧化钠溶液调pH 至6.5，用95％乙醇析出γ-L-谷氨酰-L-胱氨酸8.4克(收率84％)；以实施例1 相同的操作步骤制备γ-GC(总收率47％)。