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1、(10)授权公告号 CN 103498007 B (45)授权公告日 2015.01.21 CN 103498007 B (21)申请号 201310504426.6 (22)申请日 2013.10.24 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 青岛大学 地址 266071 山东省青岛市宁夏路 308 号 (72)发明人 王海涛 王斌 鲁晓晴 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 彭成 (54) 发明名称 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测引物及试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了一种 IL-17。
2、F 基因实时荧光 PCR 检测引物， 所用的正反引物如下 ： 正向引物 （SEQI DNO.1） :5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3 ； 反向引物 （S EQINNO.2） :5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3 ； 利用 还有利用本引物的实时荧光 PCR 检测试剂盒和方 法， 本发明所采用的 PCR 试剂盒， 适用于一般的荧 光 PCR 仪器， 操作简单， 可重复性高 ； 检测的成本 低， 特异性和敏感性高， 适合大范围的普及使用。 (51)Int.Cl. 审查员 张蕾 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国。
3、家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书2页 序列表1页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103498007 B CN 103498007 B 1/1 页 2 1.IL-17F 基 因 实 时 荧 光 PCR 检 测 试 剂 盒， 其 特 征 是 ： 其 包 括 一 种 混 合 试 剂，所 述 的 混 合 试 剂 包 括 ： SYBR Premix Ex Taq II(2)、正 向 引 物 (SEQ ID NO.1)5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3 ： 10M、 反向引物(SEQ IN NO.2):5-GTCTGTCGCCTGAACAA CGTCT-3 ： 1。
4、0M。 权 利 要 求 书 CN 103498007 B 2 1/2 页 3 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测引物及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于基因表达领域， 尤其是涉及 IL-17F 基因 PCR 检测引物。 背景技术 0002 白介素 17（IL-17） 是一种炎症前因子， 其家族成员在自身免疫性疾病、 移植排斥 反应及炎症中起着重要作用， IL-17 普遍存在与 Th17 细胞、 CD8 记忆 T 细胞、 嗜酸性粒细胞、 中性粒细胞和单核细胞中， 主要来源于 Th17 细胞家族。IL-17 家族成员主要包括 IL-17A、 IL-17B、 IL-17C、 IL-17C、。
5、 IL-17D 和 IL-17E、 IL-17F。目前， 研究发现 IL-17F 在哮喘中扮 演重要角色， 作为哮喘的促炎因子。IL-17F 经常在哮喘病人的气管中出现， 并且其严重程 度与 IL-17F 浓度相关 ； IL-17F 可以诱导多种细胞因子， 包括趋化因子、 粘结因子等 ； 在小 鼠 IL-17F 过量表达时与出现气管的中性粒细胞增多、 和诱导多种相关促炎因子表达增加 ； IL-17F 成为哮喘治疗和诊断的主要分子标记。 0003 目前 IL-17F 的检测中， 目前没有有效的引物进行检测， 并利用传统的抗体检测方 法， 但是此方法费用较高， 花费时间长， 并且并利用大范围的使用。
6、。 RT-PCR 是研究检测特定 基因表达的一个简便、 准确的方法。通过 RT-PCR 在 mRNA 0004 水平上检测某个基因的表达情况， 可以提高检测的准确率。 发明内容 0005 为了解决上述现有技术的不足， 本发明目的在于提供用于检测 IL-17F 基因表达 的引物。 0006 本发明所采用的技术方案如下 ： 0007 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测引物， 所用的正反引物如下 ： 0008 正向引物 （SEQ ID NO.1） :5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3 0009 反向引物 （SEQ IN NO.2） :5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTC。
7、T-3。 0010 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测试剂盒， 其包括一种混合试剂， 所述的混合试剂包 括 ： SYBR Premix Ex Taq II（2） 、 、 正向引物 10M、 反向引物 10M。 0011 所述的正向引物和反向引物为上述的引物。 0012 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测方法， 具体步骤为 ： 0013 1） 提取 RNA， 并反转录为 cDNA ； 0014 2） 反应体系 ： 取 2l 步骤 1） 制得的模板 cDNA 溶液， 加入上述试剂盒中的溶液 12l， 再加入灭菌超纯水至总体积 20l ； 将以上各组分加入至 0.2mL 实时荧光 PCR。
8、 反 应管中， 短暂离心 ； 0015 3） 实时荧光 PCR 检测， 具体反应提交如下 ： 0016 95 /10s， 1 次循环 ； 95 /50s， 66 /60s， 40 次循环。 0017 本发明采用 SYBR Green I 实时荧光 PCR 检测方法， 对 IL-17A 基因进行鉴定， 具 有检测实时性和高效性， 并可以对早期 IL-17A 基因表达进行检测， 用于早期判断自身免疫 说 明 书 CN 103498007 B 3 2/2 页 4 性疾病， 另外可以对病人进行个性诊断和治疗过程中， IL-17A 的基因表达情况的检测， 并判 断病人复发和加重病情的可能性。 附图说明 。
9、0018 附图 1 为检测样品 1-6 实时荧光 PCR 检测曲线 ； 0019 附图 2 为检测样品 1-6 和阴性对照对比图表。 具体实施方式 0020 结合实施例对发明申请做进一步的说明。 0021 设计 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测引物， 所用的正反引物如下 ： 0022 正向引物 （SEQ ID NO.1） :5-CTGGGACGTACCGGGTCGGT-3 0023 反向引物 （SEQ IN NO.2） :5-GTCTGTCGCCTGAACAACGTCT-3。 0024 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测试剂盒， 其包括一种混合试剂， 所述的混合试剂包 括 ： S。
10、YBR Premix Ex Taq II（2） 、 、 正向引物 10M、 反向引物 10M。 0025 实施例 1 0026 1） 提取 6 位哮喘病人血清样品， 标记为 1-6， 2 位正常人血清作为阴性对照 ； 分别 提取各样品的 RNA， 并反转录为 cDNA， 低温保存备用。 0027 2） 取步骤 1） 中所述的取 2l 步骤 1） 制得的模板 cDNA 溶液， 加入上述试剂盒中 的溶液 12l， 再加入灭菌超纯水至总体积 20l ； 将以上各组分加入至 0.2mL 实时荧光 PCR 反应管中， 短暂离心 ； 0028 3） 实时荧光 PCR 检测， 具体反应提交如下 ： 0029。
11、 95 /10s， 1 次循环 ； 95 /50s， 66 /60s， 40 次循环。 0030 结果分析 ： 0031 对得到实时荧光 PCR 检测的曲线进行分析 ； 并对检测样品和阴性对照的荧光进行 分析。 0032 其中， 如图 1 和图 2 所示， 图 1 中所得的荧光 PCR 扩增曲线的特异性较好， 并通过 附图 2 中的与阴性对照比较， 所得哮喘病人 IL-17F 基因表达较正常高。所得结果有利于针 对对 IL-17F 因子的个性化治疗病人。 说 明 书 CN 103498007 B 4 1/1 页 5 SEQUENCE LISTING 世亮 , 周 IL-17F 基因实时荧光 PCR 检测引物及试剂盒 2013 2 PatentIn version 3.5 1 20 DNA 人工合成 1 ctgggacgta ccgggtcggt 20 2 22 DNA 人工合成 2 gtctgtcgcc tgaacaacgt ct 22 序 列 表 CN 103498007 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103498007 B 6 。