热稳定性碳酸酐酶及其使用方法.pdf

本发明的组合物和方法涉及热稳定性碳酸酐酶、编码所述碳酸酐酶的多核苷酸、以及其制备和／或使用方法。含有所述碳酸酐酶的制剂适用于提取二氧化碳。

1.一种包含氨基酸序列的重组多肽，其中所述氨基酸序列具有碳酸酐酶活性，其中所述氨基酸序列在较高离子强度下具有较高的热稳定性和／或解链温度，并且其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID`NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少70％同一性。 2.一种包含氨基酸序列的重组多肽，其中当在约8至约10.5的pH下温育30分钟或更长时间时所述氨基酸序列具有大于25％的所述碳酸酐酶活性的碳酸酐酶活性，并且其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少70％同一性。 3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：3具有至少70％同一性。 4.根据权利要求3所述的重组多肽，其中当在8.5至10.5的pH下温育5个或更多个小时时所述多肽保持大于70％的所述碳酸酐酶活性。 5.根据权利要求3或4所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少90％的所述碳酸酐酶活性。 6.根据权利要求3-5中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少90％的所述碳酸酐酶活性。 7.根据权利要求3-6中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 8.根据权利要求3-7中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 9.根据权利要求3-8中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 10.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEO ID NO：28具有至少70％同一性。 11.根据权利要求10所述的重组多肽，其中当在8.5至9.5的pH下温育5个或更多个小时时所述多肽保持大于70％的所述碳酸酐酶活性。 12.根据权利要求10或11所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少80％的所述碳酸酐酶活性。 13.根据权利要求10-12中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少90％的所述碳酸酐酶活性。 14.根据权利要求10-13中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少40％的所述碳酸酐酶活性。 15.根据权利要求10-14中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 16.根据权利要求10-15中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 17.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：43具有至少70％同一性。 18.根据权利要求17所述的重组多肽，其中当在8.5至10.5的pH下温育5个或更多个小时时所述多肽保持大于70％的所述碳酸酐酶活性。 19.根据权利要求17或18所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少90％的所述碳酸酐酶活性。 20.根据权利要求17-19中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少80％的所述碳酸酐酶活性。 21.根据权利要求17-20中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少40％的所述碳酸酐酶活性。 22.根据权利要求17-21中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少20％的所述碳酸酐酶活性。 23.根据权利要求17-22中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 24.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：53具有至少70％同一性。 25.根据权利要求24所述的重组多肽，其中当在8.5至9.5的pH下温育5个或更多个小时时所述多肽保持大于60％的所述碳酸酐酶活性。 26.根据权利要求24或25所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少80％的所述碳酸酐酶活性。 27.根据权利要求24-26中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少60％的所述碳酸酐酶活性。 28.根据权利要求24-27中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约2小时时所述多肽保持至少40％的所述碳酸酐酶活性。 29.根据权利要求24-28中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约2小时时所述多肽保持至少20％的所述碳酸酐酶活性。 30.根据权利要求24-29中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 31.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：64具有至少70％同一性。 32.根据权利要求31所述的重组多肽，其中当在8.5至10.5的pH下温育3个或更多个小时、5个或更多个小时、10个或更多个小时、或24个或更多个小时时所述多肽保持大于70％的所述碳酸酐酶活性。 33.根据权利要求31或32所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育至少约10小时或至少约24小时时所述多肽保持至少90％的所述碳酸酐酶活性。 34.根据权利要求31-33中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少60％的所述碳酸酐酶活性。 35.根据权利要求31-34中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少40％的所述碳酸酐酶活性。 36.根据权利要求31-35中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 37.根据权利要求31-36中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 38.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：80具有至少70％同一性。 39.根据权利要求38所述的重组多肽，其中当在8.5至10.5的pH下温育1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、或24个或更多个小时时所述多肽保持大于70％的所述碳酸酐酶活性。 40.根据权利要求38或39所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育约10小时时所述多肽保持至少60％的所述碳酸酐酶活性。 41.根据权利要求38-40中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约24小时时所述多肽保持至少35％的所述碳酸酐酶活性。 42.根据权利要求38-41中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约1小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 43.根据权利要求38-42中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约3小时时所述多肽保持至少20％的所述碳酸酐酶活性。 44.根据权利要求38-43中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在约20℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 45.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：130具有至少70％同一性。 46.根据权利要求45所述的重组多肽，其中当在8.5至10.5的pH下温育30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、24小时、或更多个小时时所述多肽保持大于25％的所述碳酸酐酶活性。 47.根据权利要求45或46所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育至少约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约5小时、约10小时、约15小时、或约24小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 48.根据权利要求45-47中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约15小时、或约24小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 49.根据权利要求45-48中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、或约3小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 50.根据权利要求45-49中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约1小时、约2小时、或约3小时时所述多肽保持至少35％的所述碳酸酐酶活性。 51.根据权利要求45-.0中任一项所述的重组多肽，其中当在20℃至50℃的温度下在高离子强度条件下温育至少30分钟、至少1小时、至少2小时、或至少3小时、或更长时间时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 52.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：136具有至少70％同一性。 53.根据权利要求52所述的重组多肽，其中当在8.5至10.5的pH下温育至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、或至少5小时所述多肽保持大于25％的所述碳酸酐酶活性。 54.根据权利要求52或53所述的重组多肽，其中当在约25℃的温度下温育约1小时、约2小时、约3小时、约5小时、约10小时、或约24小时时所述多肽保持至少50％的所述碳酸酐酶活性。 55.根据权利要求52-54中任一项所述的重组多肽，其中当在约40℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约5小时、约10小时、或约24小时时所述多肽保持至少40％的所述碳酸酐酶活性。 56.根据权利要求52-55中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、或约3小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 57.根据权利要求52-56中任一项所述的重组多肽，其中当在约50℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、或约3小时时所述多肽保持至少35％的所述碳酸酐酶活性。 58.根据权利要求52-57中任一项所述的重组多肽，其中当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时所述多肽保持至少25％的所述碳酸酐酶活性。 59.根据权利要求9、16、23、30、37、44、51或58所述的重组多肽，其中所述高离子强度条件包括1M碳酸氢盐。 60.根据权利要求1-59中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在1M至2M碳酸氢盐存在下具有升高的解链温度。 61.根据权利要求2-60中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在较高离子强度下具有较高的热稳定性和／或解链温度。 62.根据权利要求1或2中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少75％同一性的氨基酸序列。 63.根据权利要求1或2中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少80％同一性的氨基酸序列。 64.根据权利要求1或2中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少90％同一性的氨基酸序列。 65.根据权利要求1或2任一项所述的重组多肽，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少95％同一性的氨基酸序列。 66.一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽以及含二氧化碳的介质。 67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述重组多肽被固定化。 68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述重组多肽被固定在聚合物、膜、基质、胶束材料、圆片、固体支撑物或微粒上。 69.一种分离的核酸，编码根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽。 70.根据权利要求69所述的分离的核酸，其中所述多肽还包含信号肽序列。 71.根据权利要求70所述的分离的核酸，其中所述信号肽序列选自SEQ ID NO：10-15、69-73、81-83以及131-132。 72.一种表达载体，包含与调节序列有效组合的根据权利要求69-71中任一项所述的分离的核酸。 73.一种宿主细胞，包含根据权利要求72所述的表达载体。 74.根据权利要求73所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞。 75.一种组合物，包含根据权利要求73或74所述的宿主细胞以及培养基。 76.一种产生碳酸酐酶的方法，包括：在合适条件下在培养基中培养根据权利要求73或74所述的宿主细胞以产生所述碳酸酐酶。 77.一种组合物，包含依据根据权利要求76所述的方法在所述培养基的上清液中产生的所述碳酸酐酶。 78.一种从含二氧化碳的介质提取二氧化碳的方法，包括：使所述含二氧化碳的介质与根据权利要求1-64中任一项所述的多肽接触以得到二氧化碳减少的介质。 79.根据权利要求78所述的方法，其中所述含二氧化碳的介质选自气体、液体和多相混合物。 80.根据权利要求78所述的方法，其中所述含二氧化碳的介质是选自烟道气、原天然气、合成气、氢气和沼气的气体。 81.根据权利要求78所述的方法，其中所述含二氧化碳的介质是燃烧或发酵的副产物。 82.一种调节含有CO和碳酸氢盐中的一者或二者的介质的pH的方法，包括：使所述介质与根据权利要求1-65中任一项所述的多肽接触以得到具有改变的pH的介质。

交叉引用

本申请要求2011年5月10日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／073886、2011年5月10日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／073876、2011年5月10日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／073873、2011年5月10日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／073871、2011年12月21日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／084371、2011年12月21日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／084366、2011年12月21日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／084363、2011年12月21日提交的中国PCT申请号 PCT／CN2011／084384、2011年12月21日提交的美国临时申请号 61／578408、2011年12月21日提交的美国临时申请号61／578429、2011年 12月21日提交的美国临时申请号61／578416以及2011年12月21日提交 的美国临时申请号61／578421的优先权，特此明确地将这些临时申请的提 交日期以及各临时申请全文以引用的方式并入。

背景技术

世界上大部分的电力是由诸如煤、天然气和燃料油之类的化石燃料的 燃烧产生的。二氧化碳(CO2)是燃烧的副产物并且是主要的温室气体。因 此，CO2排放物被认为是全球变暖现象的主要促成因素，全球变暖现象可 能导致剧烈的气候变化(例如，狂暴的天气模式、降水变化、海平面上升 以及温度升高)。另外，因为CO2是一种酸性气体，所以它在水的存在下 形成腐蚀性产物碳酸。

已经提出若干种提取CO2的方法，包括利用藻类转化、封存在海洋 中、储存在废弃的油井和天然气井中、溶解在深层地下水位中以及转化为 碳酸盐。然而，这些方法中许多具有显著的缺点，并且往往在经济上或生 态上不可行。

碳酸酐酶(EC4.2.1.1；以及CAS No.9001-03-0)可催化二氧化碳与 碳酸氢盐之间的相互转化大部分碳酸酐酶的活 性位点含有锌离子，因此，这些酶也归类为金属酶。碳酸酐酶可充当生物 催化剂来加速CO2的捕获。天然存在的碳酸酐酶通常在低温下起作用并且 不太适于从热燃烧气体中提取CO2。因此，需要可以在不适合条件下(例 如，高温、碱性pH和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下)有效地水合CO2的 碳酸酐酶。

发明内容

本公开提供涉及来自吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)、维也纳原小单 孢菌(Promicromonospora vindobonensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)、始旋 链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus  agaradhaerens)、弧菌属物种AND4(Vibrio sp.AND4)、弧菌属物种Ex25 (Vibrio sp.Ex25)的重组碳酸酐酶的组合物和方法、编码这些碳酸酐酶的多 核苷酸，以及其制备和／或使用方法。含有这些重组碳酸酐酶的制剂适用于 提取二氧化碳。

在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及来自吉氏芽孢杆菌的重 组碳酸酐酶1(Bgi CA1)。在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及来 自维也纳原小单孢菌的重组碳酸酐酶1(Pvi CA1)。在一些实施例中，本发 明的组合物和方法涉及克隆自土曲霉的重组碳酸酐酶1(Ate CA1)。在一些 实施例中，本发明的组合物和方法涉及来自始旋链霉菌的重组碳酸酐酶1 (Spr CA1)。在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及来自粘琼脂芽孢 杆菌的重组碳酸酐酶1(Bag CA1)。在一些实施例中，本发明的组合物和方 法涉及来自弧菌属物种AND4的重组碳酸酐酶1(Vsp CA1)。在一些实施例 中，本发明的组合物和方法涉及来自弧菌属物种Ex25的重组碳酸酐酶I (VspE CA1)。在一些实施例中，本发明的组合物和方法涉及来自弧菌属 Ex25的重组碳酸酐酶II(VspE CA2)。含有一种或多种所述重组碳酸酐酶的 制剂适用于从含二氧化碳的介质(例如燃烧废气和烟道气流)中提取二氧 化碳。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ  ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO： 80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少55％(例如，55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多肽具有碳酸酐酶活性。在一 些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子强度溶液中。

在一些实施例中，本发明提供包含氨基酸序列的重组多肽，其中该氨 基酸序列具有碳酸酐酶活性，其中该氨基酸序列在较高离子强度下具有较 高的热稳定性和／或解链温度，并且其中该氨基酸序列与氨基酸序列SEQ  ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO： 64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少70％同 一性。

在一些实施例中，本发明提供包含氨基酸序列的重组多肽，其中当在 约8至约10.5的pH下温育30分钟或更长时间时该氨基酸序列具有大于 25％的该碳酸酐酶活性的碳酸酐酶活性，并且其中该氨基酸序列与氨基酸 序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、 SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有 至少70％同一性。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3具有至 少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在8.5至10.5的pH下温育5个或更多 个小时(在一些实施例中在25℃至40℃的温度下进行)时，该多肽保持 大于70％(例如，大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于 90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或100％) 的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约25℃的温度下温育约24小 时(在一些实施例中是在8.5至10.5的pH下)时，该多肽保持至少90％ (例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，当在约40℃的温度下温育约24小时(在一些 实施例中是在8.5至10.5的pH下)时，该多肽保持至少90％(例如，至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约3小时(在一些实施例中是在 8.5至9.5的pH下)时，该多肽保持至少50％(例如，至少50％、至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％) 的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约3小时 (在一些实施例中是在10.5的pH下)时，该多肽保持至少25％(例如， 至少25％、至少35％、至少45％、至少55％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时，该 多肽保持至少50％(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，这些高离子强度条件包含1M碳酸氢盐。在一些实施例 中，该多肽在1-2M碳酸氢盐存在下具有升高的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：28具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在8.5至9.5的pH下温育5个或更多个 小时(在一些实施例中在25℃至40℃的温度下进行)时，该多肽保持大 于70％(例如，大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、 大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或100％)的该碳 酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约25℃的温度下温育约24小时(在 一些实施例中是在8.5至9.5的pH下)时，该多肽保持至少80％(例如， 至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少 94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％) 的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约40℃的温度下温育约24小 时(在一些实施例中是在8.5至9.5的pH下)时，该多肽保持至少80％ (例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％ 或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约50℃的温度下温 育约3小时(在一些实施例中是在8.5至9.5的pH下)时，该多肽保持至 少40％(例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、 至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约40℃的温度下温育约3小时(在一些实施例中是在10.5的pH 下)时，该多肽保持至少25％(例如，至少25％、至少35％、至少45％、 至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％) 的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在高离子强度条件下在20℃至 50℃的温度下温育1至3小时时，该多肽保持至少50％(例如，至少 50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，这些高 离子强度条件包含1M碳酸氢盐。在一些实施例中，该多肽在1-2M碳酸 氢盐存在下具有升高的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：43具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在8.0至11(例如，8.0至10.5、8.5至 10.5、8.5至11、8.5至10、8.0至10、9.0至11等)的pH下温育5个或更 多个小时(在一些实施例中在25℃至40℃的温度下进行)时，该多肽保 持大于70％(例如，大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于 90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或100％) 的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约25℃的温度下温育约24小 时(在一些实施例中是在8.5至10.5的pH下)时，该多肽保持至少90％ (例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，当在约40℃的温度下温育约24小时(在一些 实施例中是在8.5至10.5的pH下)时，该多肽保持至少80％(例如，至 少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约50℃的温度下温育约3小时(在一些实施例中是在8.5至10 (例如，8.5至9.5、8.5至10、9至10等)的pH下)时，该多肽保持至少 40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至 少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约3小时(在一些实 施例中是在10.5的pH下)时，该多肽保持至少25％(例如，至少25％、 至少35％、至少45％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在高 离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3小时时，该多肽保持至 少50％(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、 至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，这些高离子强度条件包含1M碳酸氢盐。在一些实施例中，该多肽在 1-2M碳酸氢盐存在下具有升高的解链温度。在相关的实施例中，该多肽在 较高离子强度条件下具有增加的热稳定性。例如，相比于在较低离子强度 条件下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氢盐下)，该多肽在较 高离子强度条件下(例如，在1M碳酸氢盐下)具有较高的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：53具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在8至10(例如，8至9.5、8.5至9.5、 8.5至10、8至10等)的pH下温育5个或更多个小时(在一些实施例中在 25℃至40℃的温度下进行)时，该多肽保持大于50％(例如，大于50％、 大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于 95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，当在约25℃的温度下温育约24小时(在一些 实施例中是在8至11(例如，8至10.5、8.5至10.5、8.5至11、8.5至10 等)的pH下)时，该多肽保持至少70％(例如，至少70％、至少80％、 至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约40℃的温度下温育约24小时(在一些实施例中是 在8.5至10.5(例如，8.5至10、8.5至10.5、8.5至9.5、8至10、8至9.5 等)的pH下)时，该多肽保持至少50％(例如，至少50％、至少55％、 至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约2小时(在一些实施例中是在 8至11(例如，8至10.5、8.5至10.5、8.5至11、8.5至10、9至10.5等) 的pH下)时，该多肽保持至少30％(例如，至少30％、至少35％、至少 40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约2小时(在一些实施例中是在 8、8.5、9.0、9.5、10、10.5或11的pH下)时，该多肽保持至少15％(例 如，至少15％、至少20％、至少25％、至少35％、至少45％、至少55％、 至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度 下温育1至3小时时，该多肽保持至少50％(例如，至少50％、至少 55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％ 或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该高离子强度条件包含 1M碳酸氢盐。在一些实施例中，该多肽在1-2M碳酸氢盐存在下具有升高 的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：64具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在约8.0至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8.5至约10、约9至约10.5 等)的pH下温育5个或更多个小时(在一些实施例中在约20℃至约55℃ (例如，约25℃至约50℃、约30℃至约45℃、约35℃至40℃等)的温 度下进行)时，该多肽保持大于70％(例如，大于70％、大于75％、大于 80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于 98％、大于99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约 25℃的温度下温育约3、约5、约10、约24小时或更长时间(在一些实施 例中是在8.0至11(例如，8.5至10.5、8.5至9.5、9.5至10.5、8.5至10、 9至10、9至10.5等)的pH下)时，该多肽保持至少90％(例如，至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约40℃的温度下温育约3、约5、约10、约24小时 (在一些实施例中是在8.0至11(例如，8.5至10.5、8.5至9.5、9.5至 10.5、8.5至10、9至10、9至10.5等)的pH下)时，该多肽保持至少 90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至 少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸 酐酶活性。在一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约3小时(在一些 实施例中是在约8至约10(例如，约8.5至约9.5等)的pH下)时，该多 肽保持至少50％(例如，至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至 少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约50℃的温度下温育约3小时(在一些实施例中是在约9.5至11 (例如，约10至约10.5等)的pH下)时，该多肽保持至少25％(例如， 至少25％、至少35％、至少45％、至少55％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在高离子强度条件下在约20℃至约55℃(例如，约25℃至约50 ℃、约20℃至约50℃、约30℃至约50℃等)的温度下温育长达10小时 (例如，1至3小时、1至5小时、1至7小时、1至9小时等)时，该多 肽保持至少50％(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至 少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，这些高离子强度条件包含1M碳酸氢盐。在一些实施例 中，该多肽在1M至2M碳酸氢盐存在下具有升高的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：80具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在约8至约11(例如，约8至约10.5、 约8.5至约9.5、约8.2至约10.6、约8.5至约10.5、约8.4至约10.2、约 8.6至约10、或9.5至约10.5等)的pH下温育3个或更多个小时(在一些 实施例中在20℃至55℃(例如，25℃至50℃、30℃至45℃、35℃至40℃ 等)的温度下进行)时，该多肽保持大于50％(例如，大于50％、大于 55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于 85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％ 或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约25℃的温度下温 育至少约1小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时或更长 时间(在一些实施例中是在约8至约11(例如，约8至约10.8、约8.2至 约10.6、约8.5至约10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8.6至约 10.2、约8.8至约10等)的pH下)时，该多肽保持至少60％(例如，至 少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约40℃的温度下温育长于约1小时、约3小时、约5 小时、约10小时、约24小时或更长时间(在一些实施例中是在约8至约 10(例如，约8至约10.8、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8.2至约 10.6、约8.5至约10.5、约8.6至约10.2、约8.8至约10等)的pH下) 时，该多肽保持至少50％(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少 65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约50℃的温度下温育约1小时、约3小时、约5小时、约10小 时或至少24小时(在一些实施例中是在约8.5的pH下)时，该多肽保持 至少50％(例如，至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约50℃的温度下温育约1小时、约2小时或约3小时(在一些实 施例中是在约9.5至约10.5的pH下)时，该多肽保持至少20％(例如， 至少20％、至少25％、至少35％、至少45％、至少55％、至少65％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在高离子强度条件下在约20℃的温度下温育1至3小时 时，该多肽保持至少30％(例如，至少30％、至少35％、至少40％、至少 45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在高离子强度条件下温育10分钟至40分钟时，该多肽保持至少约 30％(例如，至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至 少55％、至少60％、至少65％或至少70％)的该碳酸酐酶活性。在一些实 施例中，这些高离子强度条件包含1M碳酸氢盐。在一些实施例中，该多 肽在1-2M碳酸氢盐存在下具有升高的解链温度。在相关的实施例中，该 多肽在较高离子强度下具有增加的热稳定性。例如，相比于在较低离子强 度下(例如，在0.8M碳酸氢盐下、在0.6M碳酸氢盐下、在0.4M碳酸氢 盐下、在0.2M碳酸氢盐下或在0.1M碳酸氢盐下等)，该多肽在较高离子 强度下(例如，在1M碳酸氢盐下)可适宜地具有升高的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：130具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在约8至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10.5等)的pH下温育1 个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多 个小时(在一些实施例中在约20℃至约55℃(例如，约25℃至约50℃、 约25℃至约40℃、约40℃至约55℃等)的温度下进行)时，该多肽保持 大于50％(例如，大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于 70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于 96％、大于97％、大于98％、大于99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在约25℃的温度下温育约30分钟或更长时间、1小时或 更长时间、2小时或更长时间、3小时或更长时间、5小时或更长时间、10 小时或更长时间、15小时或更长时间、或甚至24小时或更长时间(在一 些实施例中是在约8至约11(例如，约8.5至约10.5、约9.5至约10.5、 约8.5至约9.5)的pH下)时，该多肽保持至少60％(例如，至少60％、 至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约 40℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约5小 时、约10小时、约15小时或约24小时(在一些实施例中是在约8至约 11(例如，约8.5至约10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约 10.5等)的pH下)时，该多肽保持至少70％(例如，至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％ 或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约50℃的温度下温 育约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时或更长时间(在一些实施例 中是在约8至约11(例如，约8.5至约10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约 10.5、约8至约10.5等)的pH下)时，该多肽保持至少30％(例如，至 少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少 65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，当在约50℃的温度下温育约30分钟、1小时、 2小时或3小时或更长时间(在一些实施例中是在约8.5至约11的pH(例 如，约8.5至约10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10.5、 或约8、约8.5、约9.0、约9.5、约10、约10.5或约11的各个pH)下) 时，该多肽保持至少15％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少 35％、至少45％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在高 离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2 小时、约3小时或更长时间时，该多肽保持至少30％(例如，至少30％、 至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少 65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，这些高离子强度条件包含1M碳酸氢盐。在一 些实施例中，该多肽在1-2M碳酸氢盐存在下具有升高的解链温度。在相 关的实施例中，该多肽在较高离子强度条件下具有改善或较高的热稳定 性。例如，相比于在较低离子强度(例如，0.8M碳酸氢盐、0.6M碳酸氢 盐、0.4M碳酸氢盐、0.2M碳酸氢盐、0.1M碳酸氢盐等)下的解链温度， 该多肽在较高离子强度(例如，1M碳酸氢盐)下具有较高的解链温度。

在一个方面，提供重组多肽，包含与氨基酸序列SEQ ID NO：136具有 至少55％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，其中该多 肽具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该重组多肽包含在碱性的高离子 强度溶液中。在一些实施例中，当在约8至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10等)的pH下温育30 分钟或更长时间、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时或更长时间 (在一些实施例中在20℃至55℃(例如，25℃至40℃、40℃至55℃、20 ℃至50℃等)的温度下进行)时，该多肽保持大于25％(例如，大于 25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于 55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于 85％、大于90％、大于95％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约25℃的温度下温育至少约30分钟、至少约1小时、至少约2 小时、至少约3小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时或 更长时间(在一些实施例中是在约8至约11(例如，约8.5至约10.5、约 8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10等)的pH下)时，该多肽保 持至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％) 的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约40℃的温度下温育至少30 分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时或至少24小 时或更长时间(在一些实施例中是在约8至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10等)的pH下)时， 该多肽保持至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约50℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、约3小 时或更长时间(在一些实施例中是在约8至约11(例如，约8.5至约9.5、 约8.5至约10.5、约8至约10、约9.5至约10.5等)的pH下)时，该多肽 保持至少25％(例如，至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少 45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例 中，当在约50℃的温度下温育约30分钟、约1小时、约2小时、约3小 时或更长时间(在一些实施例中是在10.5的pH下)时，该多肽保持至少 25％(例如，至少25％、至少35％、至少45％、至少55％、至少65％、至 少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的该碳酸酐酶活性。在 一些实施例中，当在高离子强度条件下在20℃至50℃的温度下温育1至3 小时时，该多肽保持至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、 至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％ 或100％)的该碳酸酐酶活性。在一些实施例中，该高离子强度条件包含 1M碳酸氢盐。在一些实施例中，该多肽在1-2M碳酸氢盐存在下具有升高 的解链温度。在相关的实施例中，该多肽在较高离子强度条件下具有增加 或较高的热稳定性。例如，相比于在较低离子强度(例如，0.8M碳酸氢 盐、0.6M碳酸氢盐、0.4M碳酸氢盐、0.2M碳酸氢盐或0.1M碳酸氢盐 等)下，该多肽在较高离子强度(例如，1M碳酸氢盐)下具有较高的解 链温度。

在一些实施例中，多肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列与氨基酸 序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、 SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有 至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％)同一性，与氨基酸序列SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、 SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少80％(例 如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、 至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或 100％)同一性，与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID  NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID  NO：130或SEQ ID NO：136具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、 至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％)同一性，或与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ  ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO： 80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少95％(例如，至少95％、 至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。还提供包 含重组多肽和含二氧化碳的介质的组合物。在一些实施例中，重组多肽被 固定化。在一些实施例中，重组多肽被固定在聚合物、膜、基质、胶束材 料、圆片(wafer、)、固体支撑物或微粒上。

在某些方面，提供分离的核酸，其编码任何前述段落的重组多肽。在 一些实施例中，多肽还包含信号肽序列。在一些实施例中，该信号肽和碳 酸酐酶多肽源于不同的微生物。在某些实施例中，该信号肽序列选自SEQ  ID NO：10-15、69-73、81-83和131-132。还提供包含与调节序列有效组合 的分离的核酸的表达载体。另外，提供包含表达载体的宿主细胞。在一些 实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。在其他实施例中，提供组合 物，其包含宿主细胞和培养基。

在某些方面，提供制备碳酸酐酶的方法，包括：在合适的条件下在培 养基中培养前述段落的宿主细胞以产生碳酸酐酶。还提供包含根据本文提 供的方法在培养基的上清液中产生的碳酸酐酶的组合物。

在另一个方面，提供从含二氧化碳的介质中提取二氧化碳的方法，包 括：使该含二氧化碳的介质与前述段落之一的多肽接触以得到二氧化碳减 少的介质。在一些实施例中，含二氧化碳的介质是选自气体、液体和多相 混合物。在一些实施例中，含二氧化碳的介质是选自烟道气、原天然气、 合成气、氢气和沼气的气体。在一些实施例中，含二氧化碳的介质是燃烧 或发酵的副产物。

在某些方面，提供调节含有CO2和碳酸氢盐中的一者或二者的介质的 pH的方法，包括：使该介质与前述段落之一的多肽接触以得到具有改变的 pH的介质。

本文还提供碳酸酐酶或其合适的变体，其已经被工程化以在确定的碱 性pH下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下实现改善的热稳定性、改善的活 性／稳定性。在一些实施例中，碳酸酐酶是来源于吉氏芽孢杆菌碳酸酐酶的 重组碳酸酐酶。

在某些实施例中，重组碳酸酐酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ  ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少55％同一性的氨基 酸序列，或为由这样的多核苷酸序列编码的重组碳酸酐酶，该多核苷酸序 列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、 SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：133具有 至少50％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性或能够在 中等、高或最大严格性下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO： 41SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：127或 SEQ ID NO：133的互补序列杂交。在某些实施例中，重组碳酸酐酶在如本 文所述的合适宿主生物体中表达和／或产生。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约30℃ 至约85℃之间(例如，约30℃至约80℃之间、约40℃至约70℃之间、约 45℃至约65℃之间、约40℃至约60℃之间)的温度下温育时，保持至少 约30％(例如，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至 少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高百分比)的酶活 性。在一些实施例中，在确定的碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下体 现或证明：在约8.0至约10.0之间(例如，约8.0至约9.8之间、约8.2至 约9.6之间、约8.4至约9.4之间、约8.6至约9.5之间等)的pH下，保持 至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约 40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约 65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％或更高)的活性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢 盐存在下改善的活性／稳定性通过如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、 0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在 下温育该酶持续较长的一段时间(例如，持续至少1小时、2小时、3小 时、5小时、10小时、12小时、24小时、若干天、一个星期、若干个星 期、一个月或更长时间)时，保持至少约25％(例如，至少约25％、至少 约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约 55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约 80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活性。在相关的 实施例中，该多肽在较高离子强度条件下具有升高的解链温度。多肽可因 此被称为在较高离子强度条件下具有改善或增加的热稳定性。例如，相比 于在较低离子强度条件下(例如，在0.8M、0.6M、0.4M、0.2M或0.1M 碳酸氢盐下)，多肽的解链温度在较高离子强度条件下(例如，在1M碳 酸氢盐下)较高。在某些实施例中，重组碳酸酐酶包含与氨基酸序列SEQ  ID NO：3具有至少55％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约20℃ 至约75℃之间(例如，约25℃至约60℃之间、约30℃至约50℃之间、约 25℃至约55℃之间、约35℃至约65℃之间)的温度下温育时，保持至少 约30％(例如，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至 少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高百分比)的酶活 性。在一些实施例中，在确定的碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下体 现或证明：在约8.0至约11.0之间(例如，约8.0至约9.8之间、约8.2至 约9.6之间、约8.4至约9.4之间、约8.6至约9.5之间、约8.5至约10.8之 间、约9.0至约10.5之间等)的pH下，保持至少约25％(例如，至少约 25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约 50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活 性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活性／稳定性通过 如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、 1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持续较长的一段时 间(例如，持续至少1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时、 24小时、若干天、一个星期、若干个星期、一个月或更长时间)时，保持 至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约 40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约 65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％或更高)的活性。在某些相关的实施例中，随着离子强 度增加观测到热稳定性改善和／或增加。例如，相比于在较低离子强度下 (例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氢盐下)，在较高离子强度下 (例如，在1M碳酸氢盐下)多肽的解链温度较高。在某些实施例中，重 组碳酸酐酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：28具有至少55％同一性的氨基 酸序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约30℃ 至约85℃之间(例如，约30℃至约80℃之间、约40℃至约70℃之间、约 45℃至约65℃之间、约40℃至约60℃之间)的温度下温育时，保持至少 约30％(例如，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至 少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高百分比)的酶活 性。在一些实施例中，在确定的碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下体 现或证明：在约8.0至约11.0之间(例如，约8.0至约10.5之间、约8.5至 约11之间、约8.5至约10.5之间、约8.5至约10之间、约8.0至约9.5之 间、约8.2至约10之间、约8.6至约10.8之间等)的pH下，保持至少约 25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少 约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约 70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％ 或更高)的活性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活 性／稳定性通过如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、 0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持 续较长的一段时间(例如，持续至少1小时、2小时、3小时、5小时、10 小时、12小时、24小时、若干天、一个星期、若干个星期、一个月或更长 时间)时，保持至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约 35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约 60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活性。在相关的实施例中，本 文提供的多肽在较高离子强度条件下具有改善的热稳定性。例如，相比于 在较低离子强度条件下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氢盐 下)，该多肽在较高离子强度条件下(例如，在1M碳酸氢盐下)可适宜 地具有较高的解链温度。在某些实施例中，重组碳酸酐酶包含与氨基酸序 列SEQ ID N0：43具有至少55％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约30℃ 至约85℃之间(例如，约30℃至约80℃之间、约40℃至约70℃之间、约 45℃至约65℃之间、约40℃至约60℃之间)的温度下温育时，保持至少 约30％(例如，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至 少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高百分比)的酶活 性。在一些实施例中，在确定的碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下体 现或证明：在约8.0至约11.0之间(例如，约8.0至约11之间、约8至约 10.5之间、约8.5至约10之间、约8.5至约9.8之间、约8.2至约9.6之 间、约8.4至约9.4之间、约8.6至约9.5之间等)的pH下，保持至少约 25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少 约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约 70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％ 或更高)的活性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活 性／稳定性通过如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、 0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持 续较长的一段时间(例如，持续至少1小时、2小时、3小时、5小时、10 小时、12小时、24小时、若干天、一个星期、若干个星期、一个月或更长 时间)时，保持至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约 35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约 60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活性。在某些实施例中，重组 碳酸酐酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：53具有至少55％同一性的氨基酸 序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约20℃ 至约85℃之间(例如，约25℃至约80℃之间、约30℃至约70℃之间、约 35℃至约65℃之间、约40℃至约60℃之间等)的温度下温育时，保持至 少约30％(例如，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、 至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高百分比)的酶 活性。在一些实施例中，在确定的碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下 体现或证明：在约8.0至约11之间(例如，约8.0至约10.5之间、约8.5 至约9.5之间、约8.2至约10.2之间、约8.4至约10之间、约8.6至约9.8 之间、约8.5至约10.5之间、约9.5至约10.5之间等)的pH下，保持至少 约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至 少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约 70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％ 或更高)的活性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活 性／稳定性通过如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、 0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持 续较长的一段时间(例如，持续至少1小时、2小时、3小时、5小时、10 小时、12小时、24小时、若干天、一个星期、若干个星期、一个月或更长 时间)时，保持至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约 35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约 60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活性。在相关的实施例中，碳 酸酐酶在较高离子强度条件下具有较高或增加的热稳定性和／或解链温度。 例如，相比于在较低浓度的碳酸氢盐下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或 0.1M碳酸氢盐下)的解链温度，碳酸酐酶多肽在较高浓度的碳酸氢盐下 (例如，在1M碳酸氢盐下)适宜地具有较高的解链温度。在某些实施例 中，重组碳酸酐酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：64具有至少55％同一性 的氨基酸序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约20℃ 至约55℃之间(例如，约20℃至约50℃之间、约25℃至约50℃之间、约 25℃至约40℃之间、约40℃至约55℃之间等)的温度下温育时，保持至 少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、 至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少 约85％、至少约90％、至少约95％或更高百分比)的酶活性。在一些实施 例中，在确定的碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下体现或证明：在约 8.0至约11(例如，约8.0至约10.8、约8.2至约10.6、约8.5至约10.5、 约8.2至约10、约8.4至约9.8、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5等)的 pH下持续至少约0.5、约1.0、约2.0、约3.0、约4.0或约5.0小时或更长 时间的一段时间，保持至少约20％(例如，至少约20％、至少约25％、至 少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约 55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约 80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活性。在一些实 施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活性／稳定性通过如下体现或证 明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、1.2M、1.5M、2.0M 或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持续较长的一段时间(例如，持续至 少1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时、24小时、若干 天、一个星期、若干个星期、一个月或更长时间)时，保持至少约20％ (例如，至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约 40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约 65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％或更高)的活性。在相关的实施例中，碳酸酐酶多肽在 较高离子强度下具有增加的热稳定性。例如，相比于在较低离子强度条件 下(例如，在0.8M碳酸氢盐下、在0.6M碳酸氢盐下、在0.4M碳酸氢盐 下、在0.2M碳酸氢盐下或在0.1M碳酸氢盐下等)，碳酸酐酶多肽在较高 离子强度条件下(例如，在1M碳酸氢盐下)可适宜地具有较高的解链温 度。在某些实施例中，重组碳酸酐酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：80具 有至少55％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约20℃ 至约55℃之间(例如，约20℃至约50℃之间、约25℃至约55℃之间、约 25℃至约40℃之间、约30℃至约50℃之间)的温度下温育时，保持至少 约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至 少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％或更高百分比)的酶活性。在一些实施例中，在确定的 碱性pH下改善的活性／稳定性通过如下体现或证明：在约8.0至约11之间 (例如，约8.5至约10.5之间、约8.5至约9.5之间、约9.5至约10.5之 间、约8至约10之间等)的pH下，保持至少约25％(例如，至少约 25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约 50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活 性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活性／稳定性通过 如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、 1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持续较长的一段时 间(例如，持续至少30分钟、至少1小时、2小时、3小时、5小时、10 小时、12小时、24小时、若干天、一个星期、若干个星期、一个月或更长 时间)时，保持至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约 35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约 60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活性。在相关的实施例中，碳 酸酐酶多肽在较高离子强度条件下适宜地具有增加或改善的热稳定性。例 如，相比于在较低离子强度下(例如，在0.8M碳酸氢盐下、在0.6M碳酸 氢盐下、在0.4M碳酸氢盐下、在0.2M碳酸氢盐下、或在0.1M碳酸氢盐 下等)，该多肽在较高离子强度下(例如，在1M碳酸氢盐下)可适宜地 具有较高的解链温度。在某些实施例中，重组碳酸酐酶包含与氨基酸序列 SEQ ID NO：130具有至少55％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，改善的热稳定性通过如下体现或证明：当在约20℃ 至约85℃之间(例如，约20℃至约80℃之间、约20℃至约70℃之间、约 30℃至约65℃之间、约40℃至约60℃之间)的温度下温育时，保持至少 约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至 少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％或更高百分比)的酶活性。在一些实施例中，在某一碱 性pH下改善的活性／稳定性通过如下体现或证明：在约8.0至约11之间 (例如，约8.0至约10之间、约8.5至约10.5之间、约8.5至约9.5之间、 约9.5至约10.5之间等)的pH下，保持至少约25％(例如，至少约 25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约 50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的活 性。在一些实施例中，在高浓度的碳酸氢盐存在下改善的活性／稳定性通过 如下体现或证明：当在约0.1M、0.2M、0.5M、0.7M、0.9M、1.0M、 1.2M、1.5M、2.0M或更高浓度的HCO3-存在下温育该酶持续较长的一段时 间(例如，持续至少1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时、 24小时、若干天、一个星期、若干个星期、一个月或更长时间)时，保持 至少约25％(例如，至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约 40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约 65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％或更高)的活性。在相关的实施例中，碳酸酐酶多肽在 较高离子强度条件下具有增加或较高的热稳定性。例如，相比于在较低离 子强度(例如，0.8M碳酸氢盐、0.6M碳酸氢盐、0.4M碳酸氢盐、0.2M碳 酸氢盐、0.1M碳酸氢盐等)下，碳酸酐酶多肽在较高离子强度(例如， 1M碳酸氢盐)下具有较高的解链温度。在某些实施例中，重组碳酸酐酶 包含与氨基酸序列SEQ ID NO：136具有至少55％同一性的氨基酸序列。

使用碳酸酐酶将CO2转化为碳酸氢盐的二氧化碳捕获或封存 (sequestration)工艺通常涉及使用在某些胺溶剂或碳酸盐水溶液中固定化或 可溶的碳酸酐酶。因此，本公开的碳酸酐酶多肽，除了高温(例如，处于 或高于40℃、50℃、60℃、70℃或80℃)下的良好稳定性和／或在高离子 强度(例如，处于或约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或甚至3.0M碳酸氢盐)下 的高活性／稳定性或热稳定性之外，在一些方面中还适宜地具有当暴露于胺 溶剂(例如，处于或高于在工业用途中为固定CO2通常用于固定化或增溶 碳酸酐酶的胺溶剂的浓度)时的高稳定性。

此外，烟道气(其为燃煤发电厂产生的燃烧废气)通常可包含(不限 于)氧气、氮气、二氧化碳、水蒸气以及少量的一氧化碳、氮氧化物、硫 氧化物和／或重金属(例如汞)。因此，本公开的碳酸酐酶多肽，除了高温 下的良好稳定性、和／或高离子强度下的高活性／稳定性或热稳定性、和／或 当暴露于胺溶剂时的高稳定性之外，在某些方面中还适宜地具有当暴露于 硫氧化物、氮氧化物和／或重金属(例如汞)时的稳定性。

此外，天然气组成可根据提取这些组合物的来源而变化。例如，它们 可主要含有甲烷和不同量的乙烷、丙烷、丁烷、高级烷烃、氮气、二氧化 碳和氢硫化物。当暴露于氢硫化物时，多种先前已知的碳酸酐酶可能失去 稳定性。然而，本公开的碳酸酐酶多肽，在一些方面中，除了高温下的良 好稳定性、和／或高离子强度下的高活性／稳定性或热稳定性、和／或当暴露 于胺溶剂时的高稳定性、和／或当暴露于硫氧化物、氮氧化物和／或重金属 时的稳定性之外，还可能适宜地具有当暴露于氢硫化物时的良好稳定性。

本文还提供固定化碳酸酐酶或其固定化变体，以及制备和／或使用此类 固定化酶的方法。在一些实施例中，碳酸酐酶是使用本文提供的多种技术 来固定化的。在某些实施例中，碳酸酐酶是重组酶。在一些实施例中，碳 酸酐酶在给定条件下(例如，在约8.0至约10.0之间的pH下、在约30℃ 至85℃之间的温度下、或在由至少约0.1M(例如，至少约0.2M、至少约 0.5M、至少约1M、至少约1.5M、至少约2.0M或更高浓度的)HCO3-所赋 予的离子强度下)的稳定性和／或活性高于天然(亲本)碳酸酐酶在相同条 件下的稳定性和／或活性。

碳酸酐酶组合物和方法的这些和其他方面根据以下描述将显而易见。

附图说明

图1提供了pHPLT02-BgiCA1的质粒图谱。

图2A-C提供了Bgi CA1分别在(A)8.5、(B)9.5和(C)10.5的pH值下 的温度稳定性特征图。

图3提供了Bgi CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图4提供Bgi CA1的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与其他碳 酸酐酶的序列(SEQ ID NO：16-25)的比对。表1G-1列出了该比对的碳酸酐 酶所共有的同一性百分比。

图5提供了Bgi CA1及其同源物的系统发生树。

图6提供了pJG183(A4-celA-PviCA1)的质粒图谱。

图7A-C提供了Pvi CA1分别在(A)8.5、(B)9.5和(C)10.5的pH值下 的温度稳定性特征图。

图8提供了Pvi CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图9提供了Pvi CA1的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)与其他 碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO：16、20、21、32-38)的比对。表2G-1列出了 该比对的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。

图10提供了Pvi CA1及其同源物的系统发生树。

图11提供了pTTT-AteCA1的质粒图谱。

图12A-C提供了Ate CA1分别在(A)8.5、(B)9.5和(C)10.5的pH值下 的温度稳定性特征图。

图13提供了Ate CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图14提供了Ate CA1的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：43)与其 他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO：45-48)的比对。表3G-1列出了该比对的碳 酸酐酶所共有的同一性百分比。

图15提供了Ate CA1及其同源物的系统发生树。

图16提供了pJG187(A4-CelA-SprCA1)的质粒图谱。

图17A-C提供了Spr CA1分别在(A)8.5、(B)9.5和(C)10.5的pH值下 的温度稳定性特征图。

图18提供了Spr CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图19提供了Spr CA1的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)与其 他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO：54-61)的比对。表4G-1列出了该比对的碳 酸酐酶所共有的同一性百分比。

图20提供了Spr CA1及其同源物的系统发生树。

图21提供了pHPLT02-BagCA1的质粒图谱。

图22A-C提供了Bag CA1分别在(A)8.5、(B)9.5和(C)10.5的pH值 下的温度稳定性特征图。

图23提供了Bag CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图24提供了Bag CA1的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)与其 他碳酸酐酶的序列(SEQ ID NO：16、19、21、21、22、24、25、35、74-76) 的比对。表5G-1列出了该比对的碳酸酐酶所共有的同一性百分比。

图25提供了Bag CA1及其同源物的系统发生树。

图26提供了pHPLT02-Vsp CA1的质粒图谱。

图27A-C提供了Vsp CA1分别在(A)8.5、(B)9.5和(C)10.5的pH值 下的温度稳定性特征图。

图28提供了Vsp CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图29提供了Vsp CA1及其同源物的系统发生树。

图30提供了pHPLT02-VspE CA1的质粒图谱。

图31提供了VspE CA1在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

图32提供了pHPLT02-VspE CA2的质粒图谱。

图33提供了VspE CA2在1M碳酸氢钠(NaHCO3)存在下的稳定性特征 图。

具体实施方式

I.引言

本公开提供涉及来自吉氏芽孢杆菌、维也纳原小单孢菌、土曲霉、始 旋链霉菌、粘琼脂芽孢杆菌、弧菌属物种AND4、弧菌属物种Ex25的重组 碳酸酐酶的组合物和方法、编码所述碳酸酐酶的多核苷酸，以及其制备和／ 或使用方法。

在一些实施例中，描述了涉及来自吉氏芽孢杆菌菌株DSM8722的重 组碳酸酐酶(Bgi CA1)的组合物和方法。所述组合物和方法部分是基于所克 隆和表达的Bgi CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下 是热稳定性的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。Bgi CA1的这些特征使 得其适用于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工 艺。

重组Bgi CA1碳酸酐酶已显示在约8.5至约10.5的pH值下的热稳定 性。具体而言，重组Bgi CA1当在40℃下在约8.5至约10.5的pH下温育 至少约24小时时保持约90％的碳酸酐酶活性，并且当在50℃下在约8.5至 约9.5的pH下温育约5小时时保持约40％的碳酸酐酶活性。此外，重组 Bgi CA1在碳酸氢盐溶液中至少约3小时仍保持超过70％的活性。另外， 重组Bgi CA1在碳酸氢盐溶液中在高离子强度条件下具有处于或高于约76 ℃的解链温度。这些特征使得本文所述的Bgi CA1适用于CO2提取。

在一些实施例中，描述了涉及来自维也纳原小单孢菌菌株YIM65009 的重组碳酸酐酶(Pvi CA1)的组合物和方法。所述组合物和方法部分是基于 所克隆和表达的Pvi CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存 在下是热稳定性的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。Pvi CA1的这些特 征使得其适用于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的 工艺。

重组Pvi CA1碳酸酐酶已显示在约8.5至约10.5的pH值下的热稳定 性。具体而言，重组Pvi CA1当在40℃下在约8.5至约9.5的pH下温育至 少24小时时保持大于60％的碳酸酐酶活性。此外，重组Pvi CA1在50℃ 下在碳酸氢盐溶液中至少3小时仍保持其全部的碳酸酐酶活性。另外，重 组Pvi CA1在高离子强度条件下具有处于或高于约75℃的解链温度。

在一些实施例中，描述了涉及克隆自土曲霉NIH2624的重组碳酸酐酶 (Ate CA1)的组合物和方法。所述组合物和方法部分是基于所克隆和表达的 Ate CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下是热稳定性 的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。Ate CA1的这些特征使得其适用于 从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工艺。

重组Ate CA1碳酸酐酶已显示在约8.5至约10.5的pH值下的热稳定 性。具体而言，重组Ate CA1当在40℃下温育至少24小时时保持约60％ 或更大(例如，约65％或更大、约70％或更大、约75％或更大、约80％或 更大、约85％或更大)的碳酸酐酶活性。重组Ate CA1当在50℃下在约 8.5至约9.5的pH下温育约1小时时还可以保持约50％或更大(例如，约 55％或更大、约60％或更大)的碳酸酐酶活性。此外，重组Ate CA1在碳 酸氢盐存在下超过3小时仍保持约70％或更大(例如，约75％或更大、约 80％或更大、约85％或更大)的活性。另外，重组Ate CA1在碳酸氢盐溶 液中在高离子强度条件下具有超过约74℃的解链点。此外，重组Ate CA1 可具有在较高离子强度条件下(例如，在1M碳酸氢盐下)相比于在较低 离子强度条件下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M碳酸氢盐下)较高 的热稳定性和／或解链温度。这些特征使得本文描述的Ate CA1适用于CO2提取。

在一些实施例中，描述了涉及来自始旋链霉菌株ATCC25486的重组 碳酸酐酶(Spr CA1)的组合物和方法。所述组合物和方法部分是基于所克隆 和表达的Spr CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下是 热稳定性的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。在一些实施例中，本公开 的Spr CA1多肽在较高离子强度条件下具有改善的热稳定性。Spr CA1的 这些特征使得其适用于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳 (CO2)的工艺。

重组Spr CA1碳酸酐酶已显示在约8.5至约10.5的pH值下的热稳定 性。具体而言，重组Spr CA1当在0℃至40℃之间在8.5至9.5之间的pH 下温育至少24小时时保持超过60％的碳酸酐酶活性。此外，重组Spr CA1 在50℃下在碳酸氢盐溶液中至少约2小时仍保持超过60％的活性。这些特 性使得Spr CA1适用于二氧化碳提取。

在一些实施例中，描述了涉及来自粘琼脂芽孢杆菌的重组碳酸酐酶 (Bag CA1)的组合物和方法。这些组合物和方法部分是基于所克隆和表达的 Bag CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下是热稳定性 的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。还观测到令人惊讶的是重组碳酸酐 酶在增加的离子强度下具有增加的热稳定性。Bag CA1的这些特征使得其 适用于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工艺。

重组Bag CA1碳酸酐酶已显示在约8.0至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8.5至约10.8、约8.6至约 10.6、约8.4至约10.4、约8.2至约10.2、约8.0至约10、或约7.8至约9.8 等)的pH值下的热稳定性。具体而言，重组Bag CA1当在约25℃下并且 在约8.0至约11(例如，约8.5至约10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约 10.5)的pH下温育至少约3小时、5小时、10小时、24小时或更长时间时 保持约90％的碳酸酐酶活性。碳酸酐酶活性在较高pH下下降较明显。然 而，在较低pH(例如，约8至约9.5、约8.5至约9.5等)下，Bag CA1在 进行酶促CO2提取的超生理温度下持续长的一段时间仍适宜地保持稳定。 此外，已经观测到重组Bag CA1在碳酸氢盐溶液中至少约3小时、至少约 5小时、至少约10小时、至少约24小时或更长时间仍保持超过50％的活 性。另外，重组Bag CA1在高离子强度条件下(例如，在碳酸氢盐溶液 中)具有处于或高于约50℃(例如，至少约55℃、至少约60℃、至少约 70℃等)的解链温度。此外，相比于在较低离子强度条件下(例如，在 0.9M碳酸氢盐浓度下、在0.8M碳酸氢盐浓度下、在0.6M碳酸氢盐浓度 下、在0.5M碳酸氢盐浓度下、在0.4M碳酸氢盐浓度下、在0.3M碳酸氢 盐浓度下、在0.2M碳酸氢盐浓度下或在0.1M碳酸氢盐浓度下等)的热稳 定性、碳酸酐酶活性和解链温度这些参数(单独或这些参数的组合)，本 公开的Bag CA1多肽在较高离子强度条件下(例如，在1M碳酸氢盐浓度 下)可适宜地具有改善的热稳定性、碳酸酐酶活性和／或较高的解链温度。 这些特征使得本文描述的Bag CA1适用于CO2提取。

在一些实施例中，描述了涉及来自弧菌属物种AND4的重组碳酸酐酶 (Vsp CA1)的组合物和方法。这些组合物和方法部分是基于所克隆和表达的 Vsp CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下是热稳定性 的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。还观测到本公开的Vsp CA1多肽在 较高离子强度条件下展现出增加的热稳定性，例如它们在较高离子强度条 件下可适宜地具有较高的解链温度，这是令人惊讶的。Vsp CA1的这些特 征使得其适用于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的 工艺。

重组Vsp CA1碳酸酐酶已显示在约8.0至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8.5至约10等)的pH下的热稳 定性。在该碱性pH的较低端，例如，在约8至约9.5(例如，约8.5至约 9.5等)的pH下，重组Vsp CA1保持其大部分碳酸酐酶活性持续较长的一 段时间，例如，持续至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少5小 时、至少10小时、至少24小时或甚至更长时间。例如，当在25℃下在约 8.5至约9.5的pH下温育至少约1小时、3小时、5小时、10小时、或24 小时或更长时间时，重组Vsp CA1适宜地保持至少约35％(例如，至少约 35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约 60％、至少约65％、至少约70％或更高百分比)的碳酸酐酶活性。在碱性 pH的较高端，例如，在约10.5或更高的pH下，重组酶更迅速地失去其碳 酸酐酶活性。例如，当在约10.5的pH下温育至少1小时、2小时或3小时 时，重组Vsp CA1可适宜地保持至少约20％、至少约25％、至少约30％、 至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％或至少 约60％的其碳酸酐酶活性。此外，重组Vsp CA1在20℃下在碳酸氢盐溶 液中至少约1小时、至少约2小时或至少约3小时仍保持超过35％(例 如，超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、 超过65％或甚至超过70％)的活性。另外，重组Vsp CA1在高离子强度条 件下(例如，在碳酸氢盐溶液中)具有处于或高于约65℃(例如，处于或 高于约65℃、处于或高于约66℃、处于或高于约67％、或处于或高于约 68℃等)的解链温度。在相关的实施例中，重组Vsp CA1在较高离子强度 条件下可适宜地具有较高或增加的热稳定性。例如，相比于在较低离子强 度下(例如，在0.8M碳酸氢盐下、在0.6M碳酸氢盐下、在0.4M碳酸氢 盐下、在0.2M碳酸氢盐下、或在0.1M碳酸氢盐下等)的解链温度，重组 Vsp CA1在较高离子强度下(例如，在1M碳酸氢盐下)适宜地具有较高 的解链温度。这些特性使得本文描述的Vsp CA1适用于CO2提取。

在一些实施例中，描述了涉及来自弧菌属物种Ex25的重组碳酸酐酶 (VspE CA1)的组合物和方法。这些组合物和方法部分是基于所克隆和表达 的VspE CA1在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下是热稳 定性的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。此外，VspE CA1多肽在较高 离子强度条件下适宜地具有较高或改善的热稳定性。VspE CA1的这些特 征使得其适用于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的 工艺。

重组VspE CA1碳酸酐酶已显示在约8至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10等)的pH下的热稳 定性。具体而言，当在约25℃或约50℃下、在约8至约11(例如，约8.5 至约10.5、约8.5至约9.5、约9.5至约10.5、约8至约10等)的pH下温 育至少约30分钟、约1小时、约2小时、约5小时、约10小时、约15小 时、或约24小时或更长时间时，重组VspE CA1保持至少约55％(例如， 至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或100％) 的该碳酸酐酶活性。此外，重组VspE CA1在约20℃、约25℃或约40℃ 下在碳酸氢盐溶液中至少约30分钟、约1小时、约2小时、或约3小时或 更长时间仍保持超过30％的活性。另外，重组VspE CA1在碳酸氢盐溶液 中在高离子强度条件下具有处于或高于约45℃(例如，处于或高于约45 ℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、或约50℃或更高)的解链温 度。在一些实施例中，重组VspE CA1在较高离子强度条件下具有增加或 较高的热稳定性。例如，相比于在较低离子强度(例如，0.8M碳酸氢盐、 0.6M碳酸氢盐、0.4M碳酸氢盐、0.2M碳酸氢盐、或0.1M碳酸氢盐等) 下，重组VspE CA1在较高离子强度(例如，1M碳酸氢盐)下适宜地具有 较高的解链温度。这些特征使得本文所述的VspE CA1适用于CO2提取。

在一些实施例中，描述了涉及来自弧菌属物种Ex25的重组碳酸酐酶 II(VspE CA2)的组合物和方法。这些组合物和方法部分是基于所克隆和表 达的VspE CA2在高离子强度条件下和／或在高浓度的碳酸氢盐存在下是热 稳定性的和／或保持碳酸酐酶活性的观测结果。此外，VspE CA2在较高离 子强度条件下也具有较高的热稳定性。VspE CA2的这些特征使得其适用 于从例如燃烧废气和烟道气流中提取或封存二氧化碳(CO2)的工艺。

重组VspE CA2碳酸酐酶已显示在约8至约11(例如，约8.5至约 10.5、约8至约10、约8.4至约9.5、约9.5至约10.5等)的pH值下的热 稳定性。具体而言，当在25℃下在约8至约11(例如，约8.5至约10.5、 约8至约10、约8.4至约9.5、约9.5至约10.5等)的pH下温育至少30分 钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少5小时、至少10小时、 至少24小时时，重组VspE CA2保持至少约25％(例如，至少约25％、至 少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约 55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或更高百分比)的碳酸酐酶 活性。此外，重组VspE CA2在20℃下在碳酸氢盐溶液中至少约30分 钟、约1小时、约2小时或约3小时仍保持超过40％(例如，超过40％、 超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过 75％、超过80％或更高百分比)的活性。另外，重组VspE CA2在碳酸氢 盐溶液中在高离子强度条件下具有处于或高于约45℃(例如，处于或高于 47℃、处于或约50℃、处于或高于65℃、处于或高于70℃、处于或高于 75℃、或更高温度)的解链温度。重要的是，重组VspE CA2在较高离子 强度条件下具有增加或较高的热稳定性。例如，相比于在较低离子强度 (例如，0.8M碳酸氢盐、0.6M碳酸氢盐、0.4M碳酸氢盐、0.2M碳酸氢 盐、0.1M碳酸氢盐等)下，重组VspE CA2在较高离子强度(例如，1M 碳酸氢盐)下可适宜地具有较高的解链温度。这些特性使得本文描述的 VspE CA2适用于CO2提取。

II.定义

在详细描述本发明的组合物和方法之前，为清晰起见定义如下术语。 未定义的术语和缩写应符合它们在本领域中所用的普通含义。

如本文所用，“碳酸酐酶”或“CA”描述具有EC4.2.1.1活性的多 肽，其能够催化二氧化碳与碳酸氢盐之间的相互转化[即，]。

术语“含CO2的介质”描述可含有至少0.001％CO2、碳酸、碳酸氢 盐、碳酸盐或它们的混合物、或者含有至少0.01％、至少0.1％、至少 1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少50％或更多的CO2、碳酸、碳 酸氢盐、碳酸盐或它们的混合物的任何物质。为简洁起见，提及含CO2的 介质涵盖除含有CO2之外或在不存在CO2的情况下含有碳酸、碳酸氢盐、 碳酸盐或它们的混合物的介质。含二氧化碳的介质可能是气相、液体或多 相混合物，但也可能是固体。含CO2的气相是例如可从油井、气井以及凝 析气井获得的原天然气、通过含碳燃料(例如，甲烷)气化为包含CO和／ 或H2的气态产物而产生的合成气、或来自燃烧过程(例如，来自基于碳的 发电厂、来自此类工厂、工业炉、电炉、烘箱或壁炉的烟道气烟囱、或来 自飞机或汽车废气)的排放流。含CO2的气相或者可来自哺乳动物、活植 物以及其他排放CO2的物质(尤其是来自温室的那些)中的呼吸过程。含 CO2的气相还可以是来自好氧或厌氧发酵(例如酿造、产生诸如乙醇之类 的有用产物的发酵、或沼气的产生)的排出气体。如果此类发酵过程受嗜 热微生物促进(例如可见于沼气的产生中)，那么它们可在高温下发生。 含CO2的气相或者可能是出于使用或储存目的而富集CO2的气相。上述气 相也可以多相混合物出现，其中气体与某种程度的流体(例如，水或其他 溶剂)和／或固体物质(例如，灰分或其他粒子)共同存在。含二氧化碳的 液体是含有可测量的量的CO2的任何溶液或流体，尤其是水性液体。含二 氧化碳的液体可以通过将含CO2的气体或固体(例如，干冰或含可溶性碳 酸盐的盐)通入到液体中而获得。含二氧化碳的流体还可能是压缩的CO2液体(其含有污染物，例如干式清洁流体)、或超临界CO2、或CO2溶剂 液体，例如离子液体。

术语“二氧化碳提取”或“CO2提取”描述从含CO2的介质中减少或 以其他方式分离CO2。此种提取可以从一种介质到另一种介质进行，例 如，气-液、液-气、气-液-气、液-液、或液-固，但提取也可以是指在相同 介质内CO2转化为碳酸氢盐或碳酸盐、或碳酸氢盐或碳酸盐转化为CO2。 术语“CO2捕捉”和“CO2封存”也用于指示CO2从一种介质提取到另一 种介质中、从含CO2的介质中分离CO2、CO2转化为碳酸氢盐或碳酸盐、 或碳酸氢盐或碳酸盐转化为CO2。

术语“合成气”或“合成气体”描述通过将含碳燃料(例如，甲烷或 天然气)气化为具有热值的气态产物而产生的含有不同量的一氧化碳(CO) 和氢气(H2)的气体混合物。二氧化碳产生于合成气反应中并且被去除以增 大热值。

如本文所用，关于蛋白质的“离子强度条件”是指在含有离子盐(例 如，氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸 钠、碳酸钾、碳酸铵等)的溶液中温育蛋白质。当该盐以高浓度(例如， 0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M等)存在时，则蛋白质被称为在高离子强度 条件下温育。

如本文所用，“催化活性”或“活性”定量地描述给定底物在限定反 应条件下的转化。术语“残余活性”定义为酶在某组条件下的催化活性与 在不同的一组条件下的催化活性的比率。术语“比活性”定量地描述每一 量的酶在限定反应条件下的催化活性。

如本文所用，关于蛋白质的“pH稳定性”是指蛋白质承受有限暴露 于显著偏离使稳定性最佳的pH的pH的能力(例如，高于或低于pH最佳 值一个以上pH单位，而不显著失去其在可测量其活性的条件下所测量的 活性)。

术语“热稳定性”或“热稳定的”在关于碳酸酐酶使用时，是指碳酸 酐酶在二氧化碳水合、碳酸氢盐脱水或本文公开的其他工艺期间一般的条 件下暴露于所确定的改变的温度历经给定的一段时间后保持指定量的酶活 性。改变的温度包括与通常操作天然酶的温度相比增加或降低的温度。在 一些实施例中，所确定的改变的温度是例如在约20℃至约80℃、例如约 30℃至约70℃、或约40℃至约65℃的范围内的温度。在一些实施例中， 碳酸酐酶在暴露于改变的温度历经给定的一段时间(例如，至少约15分 钟、约30分钟、约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约 300分钟、一个月、若干个月、一年、若干年等)后保持至少约20％、约 30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约 90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约 98％或约99％的碳酸酐酶活性。

如本文所用，术语“纯化的”或“分离的”是指主题分子(例如Bgi  CA1)与其天然来源(例如，吉氏芽孢杆菌)或诸如蛋白质、核酸、脂 质、培养基组分等之类的其他分子的物理分离。一旦纯化或分离，主题分 子可占样品中物质总量的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至 少85％、至少90％、至少95％或更多(重量／重量)。

如本文所用，“多肽”是指包含多个经由肽键连接的氨基酸的分子。 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用。蛋白质可任选被修饰 (例如，糖基化、磷酸化、酰化、法呢基化、异戊烯化、磺化等)以增添 功能性。如果此类氨基酸序列展现活性，那么它们可被称为“酶”。氨基 酸残基使用常规单字母代码或三字母代码，其中氨基酸序列是以标准的氨 基-羧基端取向(即，N→C)呈现。

如本文所用，“固定化多肽”是指在物理上限制于固定化材料上而同 时保持其功能或催化活性的多肽。固定化材料的例子包括(不限于)聚合 物、膜(包括液膜)、基质、圆片、固体支撑物或微粒。在一些实施例 中，“固定化多肽”描述在物理上受限制的多肽，其具有增加的稳定性和／ 或催化活性。

术语“多核苷酸”涵盖DNA、RNA、异型双链以及能够编码多肽的 合成分子。核酸可能是单链或双链，并且可具有化学修饰。术语“核酸” 与“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码具简并性，所以不止一个密码 子可用于编码特定氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基 酸序列的核苷酸序列。除非另外指示，否则核酸序列以5′-3′取向呈现。

如本文所用，术语“野生型”或“天然”是指自然界中存在的多肽或 多核苷酸。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括一个或 多个氨基酸位置处的人为置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地， 关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为核 苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，编码野生型、亲本或参考多肽的多 核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，而是涵盖任何编码野生型、亲本或参 考多肽的多核苷酸。

如本文所用，“变体多肽”是指通常利用重组DNA技术通过置换、 添加或缺失一个或多个氨基酸而衍生自亲本(或参考)多肽的多肽。变体 多肽与亲本多肽相差少量的氨基酸残基。它们可以通过其与亲本多肽的一 级氨基酸序列同源性／同一性程度来限定。适宜的是，变体多肽与亲本多肽 具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、 至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。

序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程 序采用标准参数来确定。(参见例如Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子 生物学杂志》)215：403-410，1990；Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(《美国科学院院刊》)89：10915，1989；Karin等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《(美国科学院院刊》)90：5873，1993；以及Higgins等人，Gene (《基因》)73：237-244，1988)。用于进行BLAST分析的软件可通过国 家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获 得。也可以使用FASTA搜索数据库(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(《美国科学院院刊》)85：2444-2448，1988)。两个多肽基本上相同 的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于 保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别 仅在于保守置换，则多肽基本上与第二多肽相同。

如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽，与亲本多核苷酸具有 指定程度的同源性／同一性，或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列 杂交。适宜的是，变体多核苷酸与亲本多核苷酸或与该亲本多核苷酸的互 补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、或甚至至少99％的核苷酸序列同一性。确定同一性百分 比的方法在本领域中是已知的并且在上文进行了描述。

术语“衍生自”涵盖术语“源自”、“获自”、“可获自”、“分离 自”以及“产生自”并且一般指示一种指定物质起源于另一种指定物质或 具有可关于另一种指定物质所描述的特征。

如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的 碱基配对与互补链接合的方法。

如本文所用，短语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件 通常根据测量杂交的条件的“严格”程度来分类。严格程度可基于例如核 酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常发生在 约Tm-5℃(低于探针的Tm5℃)；“高严格性”在低于Tm约5-10℃； “中等严格性”在低于探针的Tm约10-20℃；而“低严格性”在低于Tm 约20-25℃。作为另外一种选择或另外，杂交条件可基于杂交的盐或离子 强度条件、和／或基于一次或多次严格洗脱，例如：6X SSC＝极低严格性； 3X SSC＝低至中等严格性；1X SSC＝中等严格性；以及0.5X SSC＝高严格 性。在功能上，最大严格性条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或 近严格同一性的核酸序列；而高严格性条件用于鉴定与探针具有约80％或 更大序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常期望使用相 对严格的条件来形成杂交物(例如，使用相对低的盐和／或高温度条件)。 如本文所用，严格条件被定义为50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M  NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。

在至少两条核酸或多肽的情形下，短语“基本上类似”或“基本上相 同”意指多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90％、至少约 91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约 96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％同一性的序列，或不包 括仅用于规避本描述而不增添功能性的氨基酸置换、插入、缺失或修饰。

如本文所用，“表达载体”是指含有编码指定多肽并且有效连接至能 够实现该多肽在合适宿主中的表达的合适控制序列的DNA序列的DNA构 建体。此类控制序列可包括实现转录的启动子、可选的控制此种转录的操 纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和／或控制转录和翻 译的终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体粒子或潜在的基因组插入物。 一旦转化进合适的宿主中，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥作 用，或在一些情况下可以整合到宿主基因组中。

术语“重组”是指已经被修饰以改变其序列或表达特性的遗传物质 (即，核酸、它们编码的多肽、以及包含此类多核苷酸的载体和细胞)， 例如通过使编码序列突变以产生变更的多肽、使编码序列与另一基因的编 码序列融合、将基因置于不同启动子的控制下、在异源生物体中表达基 因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于其天然表达谱的方式条件性 地或组成性地表达基因等。通常重组核酸、多肽和基于它们的细胞已经由 人操纵而使得它们与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不相同。

“信号序列”是指结合于多肽的N端部分的氨基酸序列，并且其促进 从细胞分泌成熟形式的蛋白质。成熟形式的胞外蛋白缺乏信号序列，该信 号序列在分泌过程期间被切除。

术语“选择标记”或“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的基 因，该基因允许容易地选择含有所引入的核酸或载体的那些宿主。选择性 标记的例子包括(但不限于)抗微生物物质(例如，潮霉素、博来霉素或 氯霉素)和／或赋予宿主细胞代谢优势(例如营养优势)的基因。

术语“调节元件”是指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件。例 如，启动子是促进有效连接的编码区的转录起始的调节元件。另外的调节 元件包括剪接信号、多聚腺苷酸化信号和终止信号。

如本文所用，“宿主细胞”一般是利用使用本领域中已知的重组 DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主的细胞。转化的宿主细 胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达所需的蛋白质变体。就编码蛋白 质变体的前形式或原形式的载体而言，此类变体在表达时通常从宿主细胞 分泌进宿主细胞培养基中。

在将核酸序列插入进细胞中的情形下，术语“引入”意指转化、转导 或转染。转化方式包括本领域中已知的原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿 孔、裸DNA等。(参见Chang和Cohen Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学 与普通遗传学》)168：111-115，1979；Smith等人，Appl.Env.Microbiol. (《应用与环境微生物》)51：634，1986；以及Ferrari等人，载于Harwood， Bacillus(《芽孢杆菌》)，普莱南出版公司(Plenum Publishing  Corporation)，第57-72页，1989的综述文章)。

其他技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员所通常了解相 同的含义(参见例如Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and  Molecular Biology(《(微生物学和分子生物学词典》)，第2版，纽约市的 约翰威立父子出版公司(John Wiley and Sons，NY)1994；以及Hale和 Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(《哈珀柯林斯生物学词 典》)，纽约市的哈珀永久出版社(Harper Perennial，NY)1991)。

除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”、“一个”和“该” 包括复数个指代物。

除非在上下文中另外明确地定义术语，否则如本文结合数值所用的术 语“约”是指数值的-10％至+10％的范围。举例来说，除非另外明确地定 义pH值，否则短语“约6的pH值”是指5.4至6.6的pH值。

提供标题是出于方便目的而不应理解为具限制性。包括在一个标题下 的描述可适用于本说明书整体。

III.碳酸酐酶多肽、多核苷酸、载体以及宿主细胞

A.碳酸酐酶多肽

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 Bgi CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组Bgi CA1多肽的一个例 子分离自吉氏芽孢杆菌菌株DSM8722。成熟Bgi CA1多肽具有以SEQ ID  NO：3示出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的Bgi CA1多肽可存在于 自然界中，例如，存在于吉氏芽孢杆菌的其他菌株或分离株中。这些和其 他重组Bgi CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 Pvi CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组Pvi CA1多肽的一个例 子分离自维也纳原小单孢菌菌株YIM65009。成熟Pvi CA1多肽具有以 SEQ ID NO：28示出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的Pvi CA1多肽可 存在于自然界中，例如，存在于维也纳原小单孢菌的其他菌株或分离株 中。这些和其他重组Pvi CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 Ate CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组Ate CA1多肽的一个例 子分离自土曲霉菌株NIH2624。成熟Ate CA1多肽具有以SEQ ID NO：43 示出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的Ate CA1多肽可存在于自然界 中，例如，存在于土曲霉的其他菌株或分离株中。这些和其他重组Ate  CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 Spr CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组Spr CA1多肽的一个例 子分离自始旋链霉菌株ATCC25486。成熟Spr CA1多肽具有以SEQ ID  NO：53示出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的Spr CA1多肽可存在于 自然界中，例如，存在于始旋链霉菌的其他菌株或分离株中。这些和其他 重组Spr CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 Bag CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组Bag CA1多肽的一个例 子分离自粘琼脂芽孢杆菌。成熟Bag CA1多肽具有以SEQ ID NO：64示出 的氨基酸序列。类似的、基本上类似的Bag CA1多肽可存在于自然界中， 例如，存在于粘琼脂芽孢杆菌的其他菌株或分离株中。这些和其他重组 Bag CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 Vsp CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组Vsp CA1多肽的一个例 子分离自弧菌属物种AND4。成熟Vsp CA1多肽具有以SEQ ID NO：80示 出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的Vsp CA1多肽可存在于自然界 中，例如，存在于弧菌属物种AND4的其他菌株或分离株中。这些和其他 重组Vsp CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 VspE CA1碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组VspE CA1多肽的一个 例子分离自弧菌属物种Ex25。成熟VspE CA1多肽具有以SEQ ID NO：130 示出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的VspE CA1多肽可存在于自然 界中，例如，存在于弧菌属物种Ex25的其他菌株或分离株中。这些和其 他重组VspE CA1多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一个方面，本发明的组合物和方法提供具有碳酸酐酶活性的重组 VspE CA2碳酸酐酶多肽、其片段、或其变体。重组VspE CA2多肽的一个 例子分离自弧菌属物种Ex25。成熟VspE CA2多肽具有以SEQ ID NO：136 示出的氨基酸序列。类似的、基本上类似的VspE CA2多肽可存在于自然 界中，例如，存在于弧菌属物种Ex25的其他菌株或分离株中。这些和其 他重组VspE CA2多肽为本发明的组合物和方法所涵盖。

在一些实施例中，重组多肽是与示例性亲本多肽具有指定程度的氨基 酸序列同一性的变体多肽，例如，与氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID  NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO： 80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少50％、至少51％、至少 52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少 58％、至少59％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列同一性。可例如使用诸如 本文描述的BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序通过氨基酸序列比 对来确定序列同一性。

在某些实施例中，重组多肽以重组方式产生，而在其他实施例中多肽 以合成方式产生，或纯化自天然来源(例如，吉氏芽孢杆菌、维也纳原小 单孢菌、土曲霉、始旋链霉菌、粘琼脂芽孢杆菌、弧菌属物种AND4或弧 菌属物种Ex25)。

在某些实施例中，重组多肽包括不会显著影响多肽的结构和／或功能的 置换。这些置换的例子是保守突变，如表I中所汇总的。

表I.氨基酸置换

涉及天然存在的氨基酸的置换一般是通过使编码重组碳酸酐酶多肽的 核酸突变并且然后在生物体中表达该变体多肽来进行的。涉及非天然存在 的氨基酸的置换或对氨基酸的化学修饰一般是通过在已由生物体合成碳酸 酐酶多肽后对其进行化学修饰来进行的。

在一些实施例中，变体重组多肽与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、 SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ  ID NO：130或SEQ ID NO：136基本上相同，意指它们不包括不会显著影响 多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失。此类变体重组碳酸 酐酶多肽将包括设计用于规避本描述的那些。在一些实施例中，包含这些 变体的变体重组多肽、组合物和方法不是基本上相同的SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：64、SEQ  ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136，而是包括在某些情形下基 本上影响本文多肽的结构、功能或表达的氨基酸置换、插入或缺失，使得 可实现与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO： 53、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136 的多肽相比在高离子强度条件下改善的特性，包括例如改善的比活性、改 善的热稳定性、改善的pH稳定性和／或改善的活性。

在一些实施例中，重组多肽(包括其变体)具有碳酸酐酶活性。可使 用本文描述的测定法或利用本领域已知的其他测定法来确定和测量碳酸酐 酶活性。在一些实施例中，重组碳酸酐酶多肽在用于提取或封存二氧化碳 的组合物存在下具有活性。

重组多肽包括“全长”多肽保持碳酸酐酶活性的片段。此类片段适宜 地保持全长多肽的活性位点，但可以具有非关键氨基酸残基的缺失。片段 的活性可容易地使用本文描述的测定法或利用本领域已知的其他测定法确 定。在一些实施例中，多肽的片段在用于提取或封存二氧化碳的组合物存 在下保持碳酸酐酶活性。

在一些实施例中，氨基酸序列和衍生物是以N端和／或C端融合蛋白 产生，例如，用以帮助提取、检测和／或纯化和／或用以给多肽增添功能特 性。融合蛋白伴侣的例子包括(但不限于)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、 6XHis、GAL4(DNA结合和／或转录活化结构域)、FLAG标签、MYC标 签或本领域技术人员已知的其他标签。在一些实施例中，在融合蛋白伴侣 与所关注的蛋白质序列之间提供蛋白水解裂解位点以允许移除融合蛋白序 列。适宜的是，融合蛋白不妨碍重组多肽的活性。在一些实施例中，重组 多肽与包括前导肽、前肽、结合结构域和／或催化结构域在内的功能结构域 融合。融合蛋白任选通过接合多肽与融合域的接头序列连接至重组多肽而 不会显著影响任一种组分的性质。接头任选在功能上有助于预期应用。

在一些实施例中，重组多肽在异源生物体(即，不同于天然来源的生 物体)中表达。合适的异源生物体的例子是革兰氏阳性细菌，例如枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢 杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus(以前称为嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus  stearothermophilus))、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆 菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽 孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、变铅青链霉 菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉素(Streptomyces murinus)；革兰氏阴性 细菌，例如大肠埃希杆菌(Escherichia coli)；酵母，例如酵母属物种 (Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces spp.)，例如酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；以及丝状真菌，例如曲霉属物种 (Aspergillus spp.)，例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus  niger)，以及里氏木霉(Trichoderma reesei)。将核酸转化进这些生物体中的 方法是本领域已知的。例如，用于转化曲霉宿主细胞的合适程序描述于EP 238023中。

在一些实施例中，将重组多肽与信号肽融合，例如，以利于重组多肽 的胞外分泌。例如，在某些实施例中，信号肽由选自SEQ ID NO：10、 11、12、13、14、15、69、70、71、72、73、81、82、83、131和132的 序列编码。在特定实施例中，重组多肽在异源生物体中以分泌多肽表达。 本文的组合物和方法因此涵盖在异源生物体中以分泌多肽形式表达碳酸酐 酶多肽的方法。

B.碳酸酐酶多核苷酸

本文描述的组合物和方法的另一个方面是编码具有碳酸酐酶活性的重 组碳酸酐酶多肽(包括其变体和片段)的多核苷酸。在一些实施例中，多 核苷酸提供于用于引导碳酸酐酶多肽在异源生物体(例如本文鉴定的那 些)中表达的表达载体的情形中。编码重组碳酸酐酶多肽的多核苷酸可有 效连接至调节元件(例如，启动子、终止子、增强子等)以帮助表达所编 码的多肽。

编码重组碳酸酐酶多肽的多核苷酸序列的例子是核苷酸序列SEQ ID  NO：1、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO： 62、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：133。类似的(包括 基本上相同的)编码重组碳酸酐酶多肽和变体的多核苷酸可存在于自然界 中，例如，存在于天然来源的不同菌株或其他分离株中。鉴于遗传密码的 简并性，应当理解具有不同核苷酸序列的多核苷酸可编码相同的碳酸酐酶 多肽、变体或片段。

在一些实施例中，编码重组多肽的多核苷酸与编码亲本多肽的示例性 多核苷酸具有指定程度的氨基酸序列同一性，例如，与氨基酸序列SEQ ID  NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO： 64、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：136具有至少50％、 至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少 57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少 89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列同一性。可例 如使用诸如本文所述的BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序通过氨 基酸序列比对来确定同源性。

在一些实施例中，编码重组多肽的多核苷酸在用于引导重组多肽的胞 外分泌的信号肽的编码序列后面(即，下游)框内融合。异源信号序列包 括例如来自细菌纤维素酶基因的那些。表达载体可提供于适于表达重组多 肽或适于在将其引入合适的宿主细胞中之前使该表达载体增殖的异源宿主 细胞中。

在一些实施例中，编码重组多肽的多核苷酸在指定杂交条件下与多核 苷酸SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：41SEQ ID NO：51、SEQ  ID NO：62、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：133(或与其 互补序列)杂交。条件的例子是本文所述的中等严格性、高严格性和极高 严格性条件。

碳酸酐酶多核苷酸可以是天然存在的或合成的(即，人造的)，并且 可经密码子优化以在不同宿主中表达、突变以引入克隆位点、或以其他方 式改变以增添功能性。

C.碳酸酐酶载体和宿主细胞

为了产生所公开的重组多肽，编码该多肽的DNA可以从已公开的序 列化学合成或可以从带有该基因的宿主细胞直接获得(例如，通过cDNA 文库筛选或PCR扩增)。在一些实施例中，碳酸酐酶多核苷酸包括在表达 盒中和／或通过标准分子克隆技术克隆进合适的表达载体中。此类表达盒或 载体含有帮助转录的起始和终止的序列(例如，启动子和终止子)，并且 通常还可以含有一种或多种选择性标记。

将表达盒或载体引入进合适的表达宿主细胞中，其然后表达相应的碳 酸酐酶多核苷酸。合适的表达宿主是细菌表达宿主属，包括埃希杆菌属 (Escherichia)(例如，大肠埃希杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例 如，荧光假单胞菌(P.fluorescens)或斯氏假单胞菌(P.stutzerei))、变形杆 菌属(Proteus)(例如，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、罗尔斯通菌属 (Ralstonia)(例如，富养罗尔斯通菌(Ralstonia eutropha))、链霉菌属 (Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(S. carnosus))、乳球菌属(Lactococcus)(例如，乳酸乳球菌(L.lactis))或芽 孢杆菌属(Bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌 等)。另外合适的是酵母表达宿主，例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉 逊酵母Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或巴 斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。合适的真菌表达宿主包括黑曲霉、鲁氏金 孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、曲霉属(Aspergillus)(例如，米曲霉、 黑曲霉、构巢曲霉(A.nidulans)等)或里氏木霉。另外合适的是哺乳动物表 达宿主，例如小鼠(例如，NS0)、中国仓鼠卵巢(CHO)或幼仓鼠肾(BHK) 细胞系。诸如昆虫细胞或病毒表达系统之类的其他真核宿主(例如，诸如 M13、T7噬菌体或λ噬菌体之类的噬菌体、或诸如杆状病毒(Baculovirus) 之类的病毒)也适于产生碳酸酐酶多肽。

所关注的特定宿主中与分泌性蛋白质相关的启动子和／或信号序列是用 于在该宿主中或在其他宿主中异源产生和分泌热稳定性碳酸酐酶的候选 者。举例来说，可使用来自热稳定性蛋白质的启动子，例如地衣芽孢杆菌 热稳定性淀粉酶LAT启动子(pLAT)。或者，在丝状真菌系统中，驱动纤维 二糖水解酶I的基因的启动子(cbhl)、驱动葡萄糖淀粉酶A的基因的启动 子(glaA)、驱动TAKA-淀粉酶的基因的启动子(amyA)、驱动木聚糖酶的基 因的启动子(exlA)、gpd-启动子cbh1、cbhll、内切葡聚糖酶基因eg1-eg5、 Cel61B、Cel74A、gpd启动子、Pgk1、pki1、EF-1α、tefl、cDNA1和hex1 是合适的并且可源自多种不同生物体(例如，黑曲霉、里氏木霉、米曲 霉、泡盛曲霉(A.awamori)、构巢曲霉)。

在一些实施例中，碳酸酐酶多核苷酸与编码导致重组碳酸酐酶多肽分 泌进胞外(或周质)空间中的合适同源或异源信号序列的多核苷酸通过重 组方式关联，从而允许在细胞上清液(或周质空间或溶胞产物)中直接检 测酶活性。适用于大肠埃希杆菌、其他革兰氏阴性细菌和本领域中已知的 其他生物体的信号序列包括驱动HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、 OmpA、OmpT或M13噬菌体Gill基因的表达的那些。对于枯草芽孢杆 菌、革兰氏阳性生物体和本领域中已知的其他生物体，合适的信号序列还 包括驱动AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB的表达的那 些，并且对于酿酒酵母或其他酵母，包括杀伤毒素、Bar1、Suc2、交配因 子α、Inu1A或Ggplp信号序列。信号序列可通过多种信号肽酶裂解，因而 使其从所表达的蛋白质的其余部分移除。另外，可使用来自热稳定性蛋白 质(包括(但不限于)地衣芽孢杆菌LytD、NucB、BglC、假想蛋白 BLi01309(细胞壁结合)、YhcJ以及假想蛋白BLi03260)的信号序列。

在一些实施例中，重组碳酸酐酶多肽是单独表达或以与位于N端或C 端的其他肽、标签或蛋白质(例如，6XHis、HA或FLAG标签)的融合物 表达。合适的融合物包括利于亲和纯化或检测的标签、肽或蛋白质(例 如，6XHis、HA、几丁质结合蛋白、硫氧还蛋白或FLAG标签)，以及利 于靶标碳酸酐酶的表达、分泌或加工的那些。合适的加工位点包括肠激 酶、STE13、Kex2或用于体内或体外裂解的其他蛋白酶裂解位点。

通过多种转化方法将碳酸酐酶多核苷酸引入进表达宿主细胞中，包括 (但不限于)电穿孔、脂质辅助转化或转染(“脂质转染”)、化学介导 转染(例如，CaCl和／或CaP)、醋酸锂介导的转化(例如，宿主细胞原生 质体的转化)、生物弹射“基因枪”转化、PEG介导的转化(例如，宿主 细胞原生质体的转化)、原生质体融合(例如，使用细菌或真核原生质 体)、脂质体介导的转化、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、腺病 毒或其他病毒或噬菌体转化或转导。

或者，重组碳酸酐酶多肽是在细胞内表达。任选地，在酶变体细胞内 表达或使用诸如上文所提及的那些之类的信号序列分泌进周质空间中之 后，可使用透化或溶解步骤来释放重组碳酸酐酶多肽进上清液中。通过使 用诸如超声波、压力处理(弗氏压碎器(French press))、空化(cavitation)之 类的机械手段，或通过使用诸如溶菌酶或酶混合物之类的膜消化性酶来实 现膜屏障的破坏。作为另一种备选方案，使用合适的无细胞表达系统来表 达编码重组碳酸酐酶多肽的多核苷酸。在无细胞系统中，通常利用启动子 的辅助来转录所关注的多核苷酸，但连接以形成环状表达载体是可任选 的。在一些实施例中，在无细胞系统中外源添加RNA或在无转录的情况 下产生并翻译。

IV.碳酸酐酶多肽的活性

本文公开的重组碳酸酐酶多肽可在宽泛范围的pH条件下具有碳酸酐 酶活性。在某些实施例中，当在约8.0至约11、约8.5至约10.5、或约9.0 至约10.0的pH下温育至少1小时、至少2.5小时、至少5小时、至少10 小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少一个星期、一个 月、六个月、12个月、18个月或更长时间时，所公开的重组碳酸酐酶多肽 具有碳酸酐酶活性。适宜的是，重组碳酸酐酶多肽在约8.5至约10.5的pH 下具有碳酸酐酶活性。在一些实施例中，当在约6.0、7.0、8.0、8.5、 9.0、9.5、10.0、10.5或11.0的pH下温育至少5小时、至少10小时、至少 12小时、至少18小时、至少24小时或更长时间时，重组碳酸酐酶多肽具 有碳酸酐酶活性。在其他实施例中，当在约8.5至约10.5的pH下温育 时，重组碳酸酐酶多肽保持至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、 至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、至少99％或更高的碳酸酐酶活性。应注意到，本文描述的pH值可 变化±0.2。例如，约8.0的pH值可在pH7.8至pH8.2变化。

本文公开的重组碳酸酐酶多肽可在宽泛范围的温度(例如，约0℃至 约80℃)下具有碳酸酐酶活性。在某些实施例中，当在约0℃至约80℃、 约0℃至约70℃、约0℃至约60℃、约0℃至约50℃、约0℃至约45℃、 约0℃至约40℃、约0℃至约35℃、约0℃至约30℃、约0℃至约25℃、 约0℃至约20℃、约0℃至约15℃、约0℃至约10℃、或约0℃至约5℃ 的温度下温育至少1小时、至少2.5小时、至少5小时、至少10小时、至 少12小时、至少18小时、至少24小时、至少一个星期、一个月、六个 月、12个月、18个月或更长时间时，重组碳酸酐酶多肽具有碳酸酐酶活 性。在一些实施例中，当在约0℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35 ℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃的温度下 温育至少1小时、至少2.5小时、至少5小时、至少10小时、至少12小 时、至少18小时、至少24小时、至少一个星期、一个月、六个月、12个 月、18个月或更长时间时，重组碳酸酐酶多肽具有碳酸酐酶活性。应该注 意的是，本文描述的温度值可变化±0.2℃。例如，约50℃的温度可在49.8 ℃至50.2℃变化。

在某些实施例中，当在约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55 ℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃的温度下温育至少1小时、至少2.5 小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24 小时、至少一个星期、一个月、六个月、12个月、18个月或更长时间时， 本文公开的重组碳酸酐酶多肽保持至少10％、至少20％、至少30％、至少 40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少99％或更大的碳酸酐酶活性。在一些实 施例中，温育温度是约40℃至约80℃。

在其他实施例中，当在碳酸氢盐(HCO3-)存在下温育至少1小时、至少 2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小 时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少12小时、至少18小 时、至少24小时、至少一个星期、一个月、六个月、12个月、18个月或 更长时间时，本文公开的重组碳酸酐酶多肽具有碳酸酐酶活性。适宜的 是，HCO3-浓度是用0.1M、0.25M、0.5M、1M、1.5M、2M或更高浓度的 碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢钾(KHCO3)或碳酸氢铵(NH4CO3)来实现的。在 相关的实施例中，本文公开的重组碳酸酐酶多肽在增加的离子强度下具有 增加或改善的热稳定性。例如，相比于在较低离子强度条件下(例如，在 0.8M、0.6M、0.4M、0.2M或0.1M碳酸氢盐下)，重组碳酸酐酶多肽在较 高离子强度条件下(例如，在1M碳酸氢盐下)具有较高的解链温度。

根据pH、离子强度条件和碳酸氢盐的存在，本文公开的重组碳酸酐 酶多肽可具有宽泛范围的解链温度。在一些实施例中，重组碳酸酐酶多肽 在约7.5至约11(例如，约7.5至约10.5、约8.0至约10.5、约8.5至约 10、约9.0至约10.5等)的pH下具有至少约50℃(例如，至少约56℃、 57℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74 ℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、 96℃、98℃或甚至100℃)的解链温度。在某些实施例中，重组碳酸酐酶 多肽在约8.0、8.5、9.0、9.5、10.0或10.5的pH下具有约56℃、56.5℃、 57℃、57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、59.5℃、60℃、60.5℃、61℃、61.5 ℃、62℃、62.5℃、63℃、63.5℃、64℃、64.5℃、65℃、65.5℃、66℃、 66.5℃、67℃、67.5℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、75℃、78℃、 80℃、82℃、85℃、90℃或更高的解链温度。在一些实施例中，重组碳酸 酐酶多肽在高离子强度条件下具有约65℃、69℃、70℃、71℃、71.5℃、 72℃、72.5℃、73℃或更高的解链温度。适宜的是，通过在约0.5M、 1M、1.5M、2M或更高浓度的氯化钠(NaCl)存在下使重组碳酸酐酶多肽解 链来实现高离子强度条件。在一些实施例中，重组碳酸酐酶多肽在HCO3-存在下具有约65℃、69℃、70℃、71℃、71.5℃、72℃、72.5℃、73℃或 更高的解链温度。适宜的是，用0.5M、1M、1.5M、2M或更高浓度的 NaHCO3或KHCO3来实现HCO3-浓度。在一些实施例中，重组碳酸酐酶多 肽在HCO3-存在下并且在高离子强度条件下具有约70℃、70.5℃、71℃、 71.5℃、72℃、72.5℃、73℃、73.5℃、74℃、74.5℃、75℃、75.5℃、76 ℃、76.5℃、77℃、77.5℃、80℃、80.5℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85 ℃、88℃、90℃、92℃、95℃、97℃、100℃或更高的解链温度。适宜的 是，通过在约0.5M、1M、1.5M、2M或更高浓度的NaCl存在下使重组碳 酸酐酶多肽解链来实现高离子强度条件，并且在HCO3-存在下，用0.5M、 1M、1.5M、2M或更高浓度的NaHCO3或KHCO3来实现。在相关的实施 例中，重组碳酸酐酶多肽在增加的离子强度下具有增加的热稳定性。例 如，相比于在较低离子强度条件下(例如，在0.8、0.6、0.4、0.2或0.1M 碳酸氢盐下)，重组碳酸酐酶多肽在较高离子强度条件下(例如，在1M 碳酸氢盐下)具有增加或较高的解链温度。

实例1C显示重组Bgi CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶活 性。具体而言，该Bgi CA1多肽显示具有4,023±387Wilbur-Anderson单位／ 毫克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组Bgi CA1多 肽将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐的 物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组Bgi CA1多肽相比于天然 Bgi CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例2C显示重组Pvi CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶活 性。具体而言，该Pvi CA1多肽显示具有937+65Wilbur-Anderson单位／毫 克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组Pvi CA1多肽 将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐的物 质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组Pvi CA1多肽相比于天然Pvi  CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例3C显示重组Ate CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶活 性。具体而言，该Ate CA1多肽显示具有1,327±285Wilbur-Anderson单位／ 毫克的比活性。因此，在某些实施例中，本文公开的重组Ate CA1多肽任 一者将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐 的物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组Ate CA1多肽相比于天然 Ate CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例4C显示重组Spr CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶活 性。具体而言，该Spr CA1多肽显示具有2,433+412Wilbur-Anderson单位／ 毫克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组Spr CA1多 肽将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐的 物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组Spr CA1多肽相比于天然 Spr CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例5C显示重组Bag CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶活 性。具体而言，该Bag CA1多肽显示具有3715+274Wilbur-Anderson单位／ 毫克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组Bag CA1多 肽将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐的 物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组Bag CA1多肽相比于天然 Bag CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例6B显示重组Vsp CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶活 性。具体而言，该Vsp CA1多肽显示具有10，028+551Wilbur-Anderson单 位／毫克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组Vsp CA1 多肽将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐 的物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组Vsp CA1多肽相比于天然 Vsp CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例7B显示重组VspE CA1多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶 活性。具体而言，该VsoE CA1多肽显示具有4621+431Wilbur-Anderson 单位／毫克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组VspE  CA1多肽将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳 酸盐的物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组VspE CA1多肽相比 于天然VspE CA1具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

实例8B显示重组VspE CA2多肽在二氧化碳饱和水中具有碳酸酐酶 活性。具体而言，VspE CA2多肽显示具有3189+112Wilbur-Anderson单位 ／毫克的比活性。因此，在某些实施例中，任何本文公开的重组VspE CA2 多肽将二氧化碳转化为碳酸氢盐或碳酸盐产物，或将含碳酸氢盐或碳酸盐 的物质转化为CO2。在某些实施例中，任何重组VspE CA2多肽相比于天 然VspE CA2具有改善的比活性和／或改善的稳定性。

V.包含重组碳酸酐酶多肽的组合物

在一些实施例中，本公开提供包含具有碳酸酐酶活性的重组碳酸酐酶 多肽(包括其变体或片段)的组合物以及在二氧化碳提取或封存应用中使 用此类组合物的方法。在一些实施例中，重组碳酸酐酶多肽选自Bgi  CA1、Pvi CA1、Ate CA1、Spr CA1、Bag CA1、Vsp CA1、VspE CA1和 VspE CA2。

除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组 分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂 或副产物)不计算在内。

在某些实施例中，本公开的重组碳酸酐酶多肽是组合物(例如，单组 分组合物)的主要组分。此类组合物还可包含赋形剂，该赋形剂在单组分 组合物的情形下应理解为用于配制组合物的任何辅助剂或化合物并且包括 (不限于)溶剂(例如，水、无机盐、填料、颜料、蜡)、载体、稳定 剂、交联剂、粘结剂、防腐剂以及缓冲剂。

在某些实施例中，组合物还可包含一种或多种除重组碳酸酐酶多肽以 外的酶，包括(不限于)内肽酶、氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过 氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱羧酶、 脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、 α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘 露糖苷酶、单加氧酶、腈水解酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、 过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰 胺酶、木聚糖酶或它们的组合。

除本文提供的重组碳酸酐酶多肽之外，一种或多种其他合适的碳酸酐 酶可包含在本公开的组合物中。合适的碳酸酐酶包括(不限于)α-碳酸酐 酶、β-碳酸酐酶、γ-碳酸酐酶、δ-碳酸酐酶、ε-碳酸酐酶、细胞溶质碳酸酐 酶、线粒体碳酸酐酶、分泌性碳酸酐酶以及膜相关碳酸酐酶。另外，合适 的碳酸酐酶包括(不限于)动物、植物、真菌、细菌、蓝细菌以及硅藻来 源的那些。本公开涵盖经化学或遗传修饰的突变体。

在一些实施例中，本文公开的多肽可包含修饰。如本文所用，“修 饰”描述多肽中以共价键方式、离子键方式或通过疏水或亲水缔合与各种 修饰剂相互作用的各种官能团。对各种多肽的共价修饰可通过酶与疏水 剂、亲水剂或两亲性剂的反应来进行。这些相互作用给酶增添疏水性、亲 水性或两亲性部分。可使用各种疏水剂，例如，单胺(例如，烷基胺)、 醛(例如戊醛、异丁醛、乙醛、己醛、辛醛、癸醛)、季铵盐、烷基三甲 基铵阳离子、有机阳离子、阳离子、比啶阳离子、咪唑阳离子、紫 精(viologen)、双(三苯基膦)亚胺金属络合物、联吡啶金属络合物、基于 邻二氮杂菲的金属络合物或它们的组合。在多个实施例中，疏水剂可为丁 胺、己胺、辛胺、癸胺、十二烷胺、戊醛、异丁醛、乙醛、己醛、辛醛、 癸醛、乙酰基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸铵、三苯基 、十六烷基吡啶、乙啡啶(ethidium)、甲基紫精、苄基紫精、[Ru(联吡 啶)3]2+、[Fe(邻二氮杂菲)3]3+或它们的组合。在一些实施例中，疏水剂可为 丁胺、己胺、辛胺、癸胺、十二烷胺、戊醛、异丁醛、乙醛、己醛、辛 醛、癸醛、乙酰基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸铵、三苯 基、十六烷基吡啶、乙啡啶、甲基紫精、苄基紫精或它们的组合。在 某些实施例中，本文公开的多肽可用烷基胺或水溶性聚合物(例如非支链 或支链聚乙二醇、乙二醇／丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯 醇等)共价修饰。可用于共价修饰的烷基胺为丁胺、己胺、辛胺、癸胺、 十二烷胺等。在一些实施例中，本文公开的多肽可通过各种表面活性剂修 饰。例如，非离子型表面活性剂可为N,N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)胆胺 (BigCHAP)、N,N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆胺(脱氧BigCHAP)、聚氧乙 烯醇(例如，Brij35和Brij58P)、2-环己基甲基-3-D-麦芽糖苷(Cymal- 1)、2-环己基乙基-β-D-麦芽糖苷(Cymal-2)、环己基戊基-β-D-麦芽糖苷 (Cymal-5)、环己基己基-β-D-麦芽糖苷(Cymal-6)、癸基-β-D-麦芽吡喃糖 苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十六烷基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β- D-麦芽糖苷、癸基-β-D-1-硫代麦芽吡喃糖苷、辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖 苷、洋地黄皂苷(digitonin)、二甲基癸基膦氧化物、十二烷基二甲基膦氧化 物、(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(CA630)、N-辛酰基-N-甲基葡糖 胺(MEGA-8)、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-9)、N-癸酰基-N-甲基葡糖 胺(MEGA-10)、聚氧乙烯辛基苯酚(P40-替代物)、聚氧乙烯-聚氧 丙烯嵌段共聚物(Pluronic F-68)、皂苷、聚氧乙烯9-月桂醚()、聚氧 乙烯辛基苯酚(例如，X-100和X-114)、脱水山梨糖醇单 月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物(例如，20、40和 80)、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、醇乙氧基化物 (Synperonic A7)、酰胺基磺基甜菜碱-14、酰胺基磺基甜菜碱-16、C7BzO、 3-[(3-胆酰胺丙基二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基二甲 基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)、(十二烷基二甲基铵基)乙酸盐 (BB)、3-(N,N--二甲基辛基铵基)丙磺酸盐、3-(十二烷基铵基)丙 磺酸盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基棕榈基铵 基)丙磺酸盐、3-(N5N--二甲基十八烷基铵基)丙磺酸盐或它们的组合。

本文公开的多肽可在分子内的随机位置或在分子内的预定位置被修饰 并且可包含一个、两个、三个或更多个所连接的化学部分。修饰多肽的方 法是本领域已知的，例如，EP0401384以及Malik等人，Exp.Hematol. (《实验血液学》)20：1028-1035，1992(报道使用三氟乙烷磺酰氯对GM- CSF进行聚乙二醇化)。

在某些实施例中，可固定化本文公开的多肽。在某些实施例中，可将 蛋白质工程化方法应用于本文的碳酸酐酶多肽以使得先前不存在于该多肽 中的一个或多个位点可被工程化进多肽中以利于固定化；或者，可将蛋白 质工程化方法用于改变多肽中的某些残基以使得多肽变得更易于或适于固 定化。固定化多肽可含有两种类型的功能：(1)被设计用来帮助分离的非催 化功能(例如，从应用环境中分离多肽、多肽的再使用、或过程控制)； 以及(2)被设计用来在所需时间和空间内转化靶标化合物(或底物)的催化 功能(Cao，Carrier-bound Immobilized Enzymes：Principles，Applications and  Design(《载体结合的固定化酶：原理、应用和设计》)，德国海姆市的 威利VCH出版社有限公司(Wiley-VCH Verlag GmbH＆Co.KGaA， Weinheim，Germany)，2005)。当多肽固定化时，使得它不溶于其帮助转化 的靶标化合物(例如，底物)，以及不溶于所用的溶剂。可将固定化多肽 产物与应用环境分离以利于其再使用，或降低所需要的多肽量，或在连续 递送底物并且从接近该多肽处连续移出产物的工艺中使用该多肽。这种方 法可例如有助于降低多肽支出的成本。此外，经常通过固定化来稳定多 肽。涉及固定化多肽的工艺往往是连续的，其有利于容易的过程控制。固 定化多肽可通过机械手段或通过包含在限定空间内而保持为非均相催化 剂。后者可通过微囊化(例如)于半透膜中或通过使用(例如)中空纤维 模块等包含在UF系统中来进行。通常还使用在多孔载体上固定化。这包 括多肽与载体的结合，例如，通过吸附、络合／离子／共价结合，或通过使 可溶性多肽简单吸收在载体上并随后移除溶剂。多肽交联还可以用作固定 化的手段。另外，多肽可通过包含进载体中而固定化(Buchholz等人， Biocatalysts and Enzyme Technology(《生物催化剂和酶技术》)，德国海 姆市的威利VCH出版社有限公司，2005)。

存在多种多肽固定化方法，包括(不限于)载体结合、交联和截留。 载体结合是多肽与水不溶性载体的结合。交联是多肽通过双官能或多官能 试剂的分子间交联。截留是多肽掺入进半透性材料的格子中。另外的固定 化多肽的方法包括(不限于)将多肽与包含多官能胺的液体介质和包含交 联剂的液体介质一起喷雾至颗粒多孔载体上，如WO2007／036235中所 述；将具有交联剂(例如，戊二醛)的多肽连接至卵白蛋白层，该卵白蛋 白层继而又附连至聚合物支撑物上的粘结层，如WO2005／114417中所 述；使多肽与二氧化硅载体偶联(如美国专利5,776,741中所述)，或与硅 烷偶联，或与CNBr活化的载体表面(例如玻璃)偶联，或使多肽与聚合 物珠上的甲基丙烯酸酯共聚，如Bhattacharya等人，Biotechnol.Appl. Biochem.(《生物技术与应用生物化学》)38：111-117，2003中所述。结合 本文所述的组合物和方法使用的具体多肽固定化方法是灵活的，只要固定 化材料(1)使多肽固定和／或在一些实施例中(2)使多肽稳定即可。在多个实 施例中，固定化材料也可渗透比多肽小的化合物。当多肽通过化学或物理 相互作用粘附于材料的表面时，其被吸附至固定化材料。此外，当多肽容 纳在固定化材料内(无论是否在材料的凹穴内)时，多肽通过截留而被固 定。

在某些实施例中，固定化材料可渗透比多肽小的各种化合物。此种渗 透性允许底物化合物移动透过材料，使得该底物化合物可接触多肽。固定 化材料可以使得其含有内部孔隙、胶束凹穴、通道、开口或它们的组合的 方式制备，这允许底物化合物在整个固定化材料内移动，但其将多肽限制 在固定化材料内基本上相同的空间。该限制使得多肽能保持其功能或催化 活性，或甚至增大其催化活性和／或稳定性。在多种实施例中，多肽被局限 于与该多肽基本上相同的尺寸和形状的空间，其中该多肽保持基本上其全 部功能或催化活性。根据有待固定化的具体多肽的尺寸和形状，这些孔 隙、胶束凹穴、通道或开口具有满足上述要求的物理尺寸。

在某些实施例中，固定化材料具有胶束或反向胶束结构。通常，构成 胶束的分子是两亲性的，意指它们含有极性亲水基团和非极性疏水基团。 这些分子可聚集形成胶束，其中极性基团位于聚集体的表面上且非极性烃 基封存在聚集体内部。反向胶束具有极性基团和非极性基团的相反取向。 构成聚集体的两亲性分子可以多种方式排列，只要极性基团彼此接近且非 极性基团彼此接近即可。此外，这些分子可形成双层，其中非极性基团指 向彼此且极性基团指向彼此远离。或者，可形成双层，其中极性基团可在 双层中指向彼此，而非极性基团指向彼此远离。胶束或反向胶束固定化材 料的例子包括(不限于)改性全氟磺酸-PTFE共聚物(或改性全氟化离子 交换聚合物)(改性或改性)膜；疏水性改性多 糖，例如壳聚糖、纤维素、几丁质、淀粉、直链淀粉、海藻酸盐、糖原以 及它们的组合；聚阳离子聚合物，例如疏水改性的壳聚糖；以及聚阴离子 聚合物，例如疏水改性的海藻酸盐。固定化材料的其他例子包括(不限 于)改性聚砜、改性聚碳酸酯、改性聚(乙烯基苄基氯)、改性聚硅氧烷以 及改性聚砜-接枝-聚乙二醇。上述固定化材料详细描述于WO2010／037109 以及美国专利申请公开No.US2010／0209968中。

在任何上述固定化材料中囊封或固定化多肽的方法是本领域已知的。 例如，WO2010／037109描述了将多肽囊封在聚砜中并且将多肽固定在海藻 酸盐、聚(乙烯基苄基氯)以及聚砜-接枝-聚乙二醇中的方法。

在某些实施例中，固定化材料可包括(不限于)聚合物、膜(包括液 膜)、基质、圆片、固体支撑物或微粒。在一些实施例中，固定化材料可 选自珠、织物、纤维、中空纤维、膜、微粒、多孔表面、棒、结构化填充 物以及管。合适的固定化材料的其他例子包括(不限于)氧化铝、膨润 土、生物聚合物、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支撑物、粘 土、胶原、玻璃、羟基磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚类聚合 物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、交联葡聚糖凝胶 (sephadex)、琼脂糖凝胶(sepharose)、硅胶、沉淀二氧化硅以及品牌PTFE。

一旦多肽已被固定在固定化材料内，固定化多肽就可沉积在支撑物 上。基材可以是提供选定用途所必要的所需机械支撑的材料。例如，当固 定化多肽用作化学转化的催化剂时，支撑物可以是滤器、丝网、多孔聚合 物、有机和无机膜等。

在一些实施例中，包含固定化多肽的组合物可为芯粒子。芯粒子是为 固定化多肽层提供支撑的任何粒子。芯粒子可被喷雾干燥。芯粒子可以是 例如聚合物粒子、碳粒子、沸石粒子、金属粒子、陶瓷粒子、金属氧化物 粒子、二氧化硅粒子或它们的组合。在一些实施例中，芯粒子是惰性芯粒 子。在一些实施例中，芯粒子不是聚合物粒子。适宜的是，芯粒子不会不 利地影响多肽的稳定性或涉及多肽的化学转化。制备芯粒子的方法是本领 域已知的。例如，WO2010／037109描述了用含有多肽和固定化材料的混合 物涂布芯粒子的方法。

在一些实施例中，本文公开的多肽可通过本领域已知的任何方法稳定 化，例如，通过加入抗氧化剂或还原剂以限制多肽的氧化或通过加入可捕 集／失活可破坏该酶的化合物的化合物来稳定组合物中的多肽，或其可通过 加入已知对固体或液体组合物中的多肽的稳定性有益的诸如PVP、PVA、 PEG、糖、寡聚物、多糖或其他合适的聚合物之类的聚合物来稳定。还可 以加入诸如ProxelTM之类的防腐剂来延长组合物的储藏期限或性能。

在某些实施例中，本公开的组合物可用于捕获二氧化碳。

本公开的组合物可根据本领域已知的方法制备，其可呈液体或固体组 合物的形式。例如，可使用配制技术酶和／或医药产品的技术领域已知的方 法将组合物配制成(例如)包衣或无包衣的颗粒剂或微颗粒剂。本公开的 重组碳酸酐酶多肽因此可以颗粒(例如无尘颗粒)、液体(尤其是稳定化 液体)、浆液或受保护的多肽的形式提供。

VI.碳酸酐酶多肽的用途

本文公开的重组碳酸酐酶多肽是热稳定性的并且可以催化二氧化碳 (CO2)与碳酸氢盐的相互转化。在某些实施例中，本公开的重组碳酸酐酶多 肽可用于以碳酸氢盐和质子的形式水合CO2，其继而可在升高的pH下转 化为碳酸盐和／或碳酸氢盐与碳酸盐的混合物。在一些实施例中，本公开的 重组碳酸酐酶多肽可用于在有利于碳酸氢盐脱水的条件下从碳酸氢盐释放 CO2。在一些实施例中，重组碳酸酐酶多肽选自Bgi CA1、Pvi CA1、Ate  CA1、Spr CA1、Bag CA1、Vsp CA1、VspE CA1和VspE CA2。

因此，在某些实施例中，本公开提供从含CO2的介质(例如气体、液 体或多相混合物)中提取CO2的方法，其通过使该含CO2的介质与任何所 公开的包含重组碳酸酐酶多肽的组合物接触来得到CO2减少的介质。在一 些实施例中，CO2被提取至与第一介质分离的另一种介质(例如气体或液 体)，但该提取也可以是在同一介质内将CO2转化为碳酸氢盐或将碳酸氢 盐转化为CO2。若含CO2的介质的温度高(例如，若可商购获得的碳酸酐 酶，例如从牛红血球分离的CA-I或CA-II不稳定时)，本文公开的碳酸酐 酶多肽是有用的。

在某些实施例中，本文公开的方法可用于从例如来自发电厂中基于碳 或基于烃的燃烧、或来自此类工厂、工业炉、电炉、烘箱或壁炉的烟道气 烟囱或来自飞机或汽车废气的CO2排放流中提取CO2。所公开的方法还可 以用于在制备包括(不限于)乙炔(C2H2)、一氧化碳(CO)、氯气(Cl2)、氢 气(H2)、甲烷(CH4)、一氧化二氮(N2O)、丙烷(C3H8)、二氧化硫(SO2)、氩气 (Ar)、氮气(N2)和氧气(O2)在内的工业气体中去除CO2。所公开的方法还可 以用于在加工成天然气期间从原天然气移除CO2。从原天然气中移除CO2将用来富集天然气中的甲烷(CH4)含量，从而增大每m3的热量单位数。原 天然气一般获自油井、气井和凝析气井。当通过常规方法从地质天然气藏 获得时，天然气含有3％至10％的CO2。

与天然气的甲烷富集类似，所公开的方法还可以用于富集沼气中的甲 烷含量。沼气含有相当大程度的CO2，因为发酵过程中所用的细菌产生甲 烷(60-70％)和CO2(30-40％)。沼气产生可使用嗜常温或嗜热微生物进行。 对于嗜常温菌株的工艺温度大约是25℃至40℃。在该温度范围内，可利 用牛源碳酸酐酶，因为该酶不需要具热稳定性。然而，耐受较高温度的碳 酸酐酶(例如所公开的重组碳酸酐酶多肽)将在与利用嗜常温菌株的沼气 工艺有关的实际使用和储存中提供改善的稳健性和保真性。嗜热菌株允许 在高温(例如，40℃至75℃)下进行发酵。在此类工艺中，热稳定性碳酸 酐酶尤其可用于从甲烷中移除CO2的方法中。在某些实施例中，本公开的 方法可用于合成气的制备中，通过去除由含碳燃料(例如，甲烷或天然 气)的气化而产生的CO2，从而富集合成气的CO和H2含量。

在本文公开的方法的某些方面中，可在基于酶的生物反应器中进行从 含CO2的介质提取CO2。在含CO2的介质于生物反应器中被加工之前，可 将其纯化以使其不含可能破坏酶反应或以其他方式(例如，通过堵塞出口 或膜)干扰生物反应器功能性的污染物。在从燃烧过程排出的气体／多相混 合物(例如，烟道气或废气)被通入到生物反应器中之前，这些气体／多相 混合物可被清除掉灰分、粒子、NOx和／或SO2。来自不同地区的原天然气 可能具有不同的组成和分离要求。在基于酶的生物反应器中提取CO2之 前，油、凝析物、水以及天然气液体，如果存在于原天然气中，也可以被 去除。可在与除硫相同的工艺中从原天然气提取CO2，或者可在完全独立 的工艺中提取CO2。如果此时气体超过本公开的碳酸酐酶多肽的热稳定性 范围，那么可能需要一定程度的冷却。另外，反应温度可在40℃至75℃ 之间。然而，由于所公开的碳酸酐酶多肽的热稳定性，如果从牛红血球分 离的CA-I或CA-II应用于生物反应器中，那么可需要冷却至少5℃。

可用于任何本文公开的组合物或方法的合适类型的生物反应器的一个 例子是基于使混合气流(例如，含有氧气、氮气和二氧化碳)与诸如碳酸 酐酶之类的酶在气-液界面接触以催化气体中所含的二氧化碳转化为碳酸氢 盐或碳酸盐的工艺。此种生物反应器中的气-液界面可例如由基于酶的中空 纤维膜生物反应器(HFMB)提供。HFMB的一个例子是中空纤维含浸液膜 (HFCLM)，如由Majumdar等人，AIChE1135-1145，1988所述。可通过将 芯液体夹于两个聚合物膜之间来制造CLM。适宜的是通过液膜溶剂储器连 续地再供应芯液体。可用于生物反应器中的替代类型的基于酶的CLM渗 透器描述于Cowan等人，Ann.NY Acad.Sci.(《(纽约科学院年刊》)984： 453-469，2003中。例如，生物反应器可含有通过将含碳酸酐酶的磷酸盐缓 冲溶液夹于两个疏水性微孔聚丙烯膜(例如，Celgard PP-2400)之间而构 造的液膜。可通过来自储器的流体静力学流体加入来维持液膜流体体积， 从而确保恒定的液膜厚度并防止聚合物膜与金属支撑物之间分离。CLM的 一侧(进料膜)可与含CO2的进料气流接触，而CLM的另一侧(清扫 膜)可与不含CO2的清扫气流(例如氩气)接触。在这种生物反应器中， 来自进料气流的CO2被转化为液相的碳酸氢盐并然后以CO2形式返回至清 扫气流，其中它可以压缩CO2形式储存。整个过程由碳酸酐酶催化。替代 性CLM渗透器可由中空纤维膜垫构成，例如，Celgard X40-200或X30- 240替代疏水性微孔聚丙烯膜。中空纤维渗透器可布置成不同设计。在一 种设计中，渗透器的布置得很像热交换器并且由正交排列的多组中空纤维 进料纤维和中空纤维清扫纤维组成，同时载流体填充进料纤维束与清扫纤 维束之间的空间(参见例如Majumdar等人，AIChE1135-1145，1988)。另 一种设计是可以顺流或逆流模式操作的螺旋形缠绕式中空纤维设计。WO 04／104160更详细地描述了这些和其他中空纤维渗透器设计。WO 04／104160还描述了使用磷酸盐缓冲液作为膜液。当将碳酸酐酶加入至膜 液中时，其溶解于磷酸盐缓冲液中或1M NaHCO3中。上述类型的生物反 应器详细描述于WO2010／014774和WO2010／151787中。

可供任何本文公开的组合物或方法使用的合适类型的生物反应器的另 一个例子是基于使气相或多相混合物与液相在呈气相的CO2被液相吸收 (其中CO2由碳酸酐酶转化成碳酸氢盐)的条件下接触的工艺。富集碳酸 氢盐的液体通过连续流从反应器移出，以确保CO2与碳酸氢盐之间的平衡 向CO2的连续转化移动。气相溶解于液相中取决于气体与液体之间的表面 接触面积。可以通过使液体和含CO2的气体通过填充柱或通过使含CO2的 气体鼓泡穿过液体从而在反应腔室中产生高压来实现大的接触面积。例 如，填充柱可由诸如拉西环(raschig ring)、贝尔鞍(berl saddle)、英特洛克斯 金属(intalox metal)、矩鞍(intalox saddle)、鲍尔环(pall ring)之类的填充物构 成。填充材料可以是诸如尼龙、聚苯乙烯、聚乙烯之类的聚合物、诸如二 氧化硅之类的陶瓷或诸如铝之类的金属。在两种反应器类型中，液体被连 续地交换，因此碳酸酐酶必须通过多种手段保留在反应器中。在填充柱 中，碳酸酐酶可固定在填充材料上。在“鼓泡”反应器中，碳酸酐酶可截 留在多孔基材(例如，不溶性凝胶粒子，例如二氧化硅、海藻酸盐、海藻 酸盐／壳聚糖、海藻酸盐／羧甲基纤维素)中，或碳酸酐酶可以液体中的悬 浮液形式固定在固体填充物上(如在填充柱中)，或可将碳酸酐酶化学连 接于白蛋白或PEG网络中。当反应器在操作中时，水性或有机溶剂在一端 (优选顶部)进入反应器，并且流向另一端(优选底部)，并且含CO2的 气流(进料气体)在一端(优选在溶剂的相反端(底部))进入反应器并 且该气体穿过液体并经由相反端(优选地，反应器的顶部)处的气体出口 离开。离开反应器的溶剂／液体富集碳酸氢盐并且出口气体与进料气体相比 CO2含量减少。可在后续反应中处理含碳酸氢盐的溶液例如以产生纯CO2或诸如CaCO3之类的碳酸盐沉淀物。出口气体还可以经受其他轮次的CO2 提取。上述类型的生物反应器详细描述于美国专利6,524,843、WO 2004／007058和WO2010／／151787中。

可供任何本文公开的组合物或方法使用的另一种合适类型的生物反应 器利用气体扩散膜，以便通过允许气态CO2穿过气体扩散膜而使得气态 CO2或来自多相混合物的CO2扩散进捕集液体中。CO2可通过扩散(压力 辅助)进入液体中或可由例如通过交联或通过将含有碳酸酐酶的凝胶或聚 合物基质附连至扩散膜上而固定在扩散膜上的碳酸酐酶(例如本文公开的 碳酸酐酶多肽)来辅助转移。因为碳酸酐酶特异性地与溶解的CO2反应， 所以其通过加速使溶解的CO2与水反应形成碳酸而有利于气态CO2移到流 体中，从而快速地移除CO2并使来自进料流的气体的CO2在比其他方式更 大的程度上溶解在水中。气体扩散膜可具有高表面积以利于大流量的气态 CO2穿过该膜。合适的膜包括(不限于)聚丙烯气体交换膜、ePTFE ()、膜、沸石、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、醋酸纤维 素以及固定化液膜。从气体扩散膜出现的富含CO2／碳酸氢盐的流体通过含 有碳酸酐酶的基质。该基质可包含在与容纳扩散膜的腔室分开的腔室中。 合适的基质的例子包括(不限于)珠、织物、纤维、膜、微粒、多孔表 面、棒和管。合适的基质的具体例子包括氧化铝、膨润土、生物聚合物、 碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支撑物、粘土、胶原、玻璃、羟 基磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚类聚合物、聚氨苯乙烯、聚 丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶 以及品牌PTFE。碳酸酐酶可以被固定至基质上或截留在其中。 一旦CO2进入液体中，就将建立碳酸、碳酸氢盐与碳酸盐离子之间的平 衡，该过程由碳酸酐酶催化。然后可加入碱(例如，OH-离子)以使平衡 向有利于形成碳酸盐离子移动。在最后步骤中，向溶液添加矿物离子以使 碳酸盐沉淀。或者，不加入碱，从而主要产生碳酸氢盐离子，其可以使用 离子交换树脂或膜进行浓缩。然后使用钠、镁或钙离子使碳酸氢盐沉淀。 上述类型的生物反应器详细描述于美国专利7,132,090中。

可供任何本文公开的组合物或方法使用的另一种合适类型的生物反应 器包括隔离膜(partition membrane)和相转化膜，相转化膜从混合流选择性 地吸收所需组分气体并将其转化成第二相，从而分离并纯化所需组分。该 隔离膜包括例如中空纤维。可官能化这些中空纤维以接受与可充当其他材 料(此处例如为诸如碳酸酐酶之类的酶)的桥联的材料的共价或其他类型 的键合。另外，相转化膜可由水性溶剂、质子溶剂、非质子溶剂、烃、芳 族烃、离子液体以及超临界流体(例如超临界二氧化碳或超临界水)构 成。此外，相转化膜可经由相转化催化剂(适宜的是，诸如碳酸酐酶之类 的酶)将气体化学转化为可溶于水性介质中的离子性物质。上述类型的生 物反应器详细描述于WO2004／104160中。

可供任何本文公开的组合物或方法使用的另一种合适类型的生物反应 器包括用于移除二氧化碳的树脂-圆片电去离子(resin-wafer  electrodeionization，RW-EDI)。该反应器包括由多个多孔固体离子交换树 脂圆片隔开的阴极和阳极电极，它们在使用中填充有水性流体。该多个圆 片可包括一个或多个堆叠布置在该阴极与该阳极之间的碱性圆片。这些圆 片、阳极和阴极可用离子交换膜交织间隔。这些碱性圆片可含有多孔碱性 离子交换介质，并且可适应于(a)将含CO2的气体引入碱性离子交换介质内 的水性流体中以将来自该气体的CO2转化成碳酸氢盐离子，以及(b)从其中 排放出CO2耗尽的气体。在使用中，CO2在碱性离子交换介质的碱性条件 下在圆片内的流体中被转化成碳酸氢盐。然后可将含碳酸氢盐的流体以浓 缩碳酸氢盐离子溶液输送出反应器。各圆片的碱性离子交换介质可含有碳 酸酐酶多肽以利于气态CO2转化成碳酸氢盐离子。另外，可通过化学方式 或生物化学方式将碳酸酐酶多肽结合至碱性离子交换介质以利于气态CO2转化成碳酸氢盐离子。可通过在阴极与阳极之间施加适于达到所需电流的 电势(例如，通常每一电池对约1至6伏特)以为质子(H+)向阴极输送以 及氢氧离子(OH-)向阳极输送穿过圆片和离子交换膜提供驱动力来维持碱性 离子交换介质的碱性pH值。质子和氢氧离子的输送可由圆片的离子交换 介质内的流体中存在的其他阳离子和阴离子的流动来平衡以维持各圆片或 部分中的pH在其碱性状态。上述类型的生物反应器详细描述于WO 2010／138792中。

上文描述的基于酶的生物反应器也具有更加非常规的应用，例如在飞 行员座舱、潜艇、水下装备、安全和消防装备以及宇航员的太空服中以保 持呼吸不含有毒CO2水平的空气。其他应用是从局限空间中去除CO2，例 如从啤酒厂和进行发酵的封闭建筑物内部去除CO2以降低有害CO2水平， 以及从如博物馆和图书馆的CO2敏感环境中去除CO2以防止过量CO2对 书籍和艺术品造成酸损伤。

本公开的重组碳酸酐酶多肽可用作独立的CO2提取催化剂或可与常规 的CO2提取技术(例如经由胺基溶剂或氨水或物理溶剂如SELEXOLTM(联 合碳化物公司(Union Carbide))或聚乙二醇醚进行化学吸收)组合。此类 组合可应用于上文描述的生物反应器中或可应用于已经存在的基于更常规 技术的CO2涤气设施。

本文公开的重组碳酸酐酶多肽也可用于将来自化石燃料发电厂的二氧 化碳排放物再循环成有用的碳酸物质的工艺。例如，二氧化碳排放物可从 利用煤或天然气的发电厂再循环。就煤而言，燃料在燃烧室中燃烧；在热 回收蒸汽发生器系统中将热量用于由水产生蒸汽。蒸汽推动涡轮和交流发 电机，产生电力。处理离开燃烧室的烟道气以移除灰分、NOx和／或SOx。 并非通过烟囱排出气体，而是将气体送至另外的热交换器和能量回收系统 以将其冷却至适合于生物过程的温度。该步骤产生能量。然后在气体处理 单元中处理冷却的气体以移除可能会危害生物过程的另外的污染物，最 后，通过容纳有游离或固定化多肽(例如碳酸酐酶，其将CO2转化为碳酸 氢盐)的生物反应器移除CO2，并将低CO2含量的气体吹到大气中。就天 然气而言，燃料在涡轮中直接燃烧，并且在主要的电力产生阶段中不存在 蒸汽产生的中间步骤，但其可用于后续的热回收阶段中。该工艺也可以与 SOx处理单元整合。从化石燃料发电厂再循环二氧化碳排放物的上述工艺 详细地描述于美国专利7,596,952中。

另外，本文公开的重组碳酸酐酶多肽可用于使用碳酸盐和生物催化剂 或含有生物催化剂的微粒从含CO2的气体中捕获二氧化碳的工艺。例如， 该工艺包括使含CO2的气体与包含水、生物催化剂(例如碳酸酐酶)和碳 酸盐化合物的吸收混合物接触以使得CO2能够溶解并转化成碳酸氢盐和氢 离子，从而产生CO2耗尽的气体和富含离子的溶液；以及使该富含离子的 溶液经受解吸，其中该碳酸盐化合物促进碳酸氢盐离子从富含离子的溶液 释放，产生CO2气流和离子耗尽的溶液。在某些实施例中，生物催化剂可 能包含在微粒中，其可以足以使吸收混合物流过填充式生物反应器且被液 体溶液携带以促进CO2溶解并转化成碳酸氢盐和氢离子的浓度提供。另 外，碳酸盐化合物可属于一种类型并且可以足够量加入以促进碳酸氢盐物 质在吸收期间沉淀。沉淀物可以是被送去解吸或单独处理以转化成CO2气 体的富含离子的溶液的一部分。另外，可选择碳酸盐化合物以允许诸如 KHCO3、NaHCO3或NH4HCO3之类的碳酸氢盐物质沉淀。因此，碳酸盐化 合物可包括(不限于)碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、活化碳酸钾溶液和活化 碳酸钠溶液或活化碳酸铵溶液或它们的混合物。从含CO2的气体中捕获二 氧化碳的上述工艺详细地描述于WO2011／014956和WO2011／01457中。

本文公开的重组碳酸酐酶多肽也可用于加速CO2在碳酸盐溶液的水相 中吸收和反应形成碳酸氢盐的速率的系统中。具体而言，该系统可用于水 合气流中的二氧化碳气体以形成碳酸氢盐离子。此类系统可利用多种生物 反应器，包括(不限于)填充床、流化床、连续搅拌槽或本文公开的任何 其他生物反应器。当使用填充床或流化床生物反应器时，进入生物反应器 中的气流和液流可以呈顺流或逆流构造。例如，在顺流系统中，气流和液 流可以气体于液流中的微泡形式进入生物反应器。此外，生物反应器的填 充物可以是含有固定化碳酸酐酶的填充材料。例如，固定化碳酸酐酶可涂 布在填充材料上。在一些实施例中，填充材料具有高的表面积。此外，生 物反应器中的构造可与托盘式蒸馏柱类似，其中填充材料包括包含固定化 碳酸酐酶的膜，被取向以使气体和液体流的接触面达到最大(例如，通过 以蛇形构造来回地折叠膜自身来实现)。

在此种系统的一个例子中，可使用双单元连续流动系统以在CO2吸收 器中水合CO2气体以形成碳酸氢盐离子并且在CO2解吸器中使碳酸氢盐离 子脱水形成CO2、水和碳酸盐离子。在一些情况下，这些单元可具有填充 柱设计。CO2气流进入吸收器的底部，而液流进入吸收器的顶部。该液流 可通过分配器分配在吸收器中间部分中的填充物的顶部。该液流润湿填充 物的表面并且向下流过吸收器，而CO2气流与液体流动呈逆流方式向上流 过填充物中的间隙。填充物可提供液相与气相之间的接触面积，并且包括 被固定在其外表面上的碳酸酐酶。气流中的CO2被液体吸收，并且经处理 的气流离开吸收器的顶部。液体在它向塔下方流动时富集CO2，形成碳酸 氢盐，并且被处理过的液流离开吸收器的底部。被处理过的液流然后可被 泵送到解吸器的顶部，并且可被分配器分配到具有固定化碳酸酐酶的填充 物上方。液流内的碳酸氢盐然后可转化为二氧化碳、水和碳酸盐。可通过 加热以及通过在低于大气压下操作而增大从解吸器去除CO2的速率来增大 这个反应产生CO2的反应速率。水和碳酸盐可被再循环并与进入吸收器的 液流合并，并且二氧化碳可以气流形式离开解吸器的顶部并且可按照需要 进一步处理。或者，吸收器可具有被固定在标准生物反应器填充材料(例 如填充柱中常用的贝尔鞍、矩鞍、拉西环或鲍尔环填充物)上的碳酸酐酶 并且可与微泡CO2气体和碳酸盐水溶液接触以允许气体与液体之间的表面 积增大从而将CO2气体输送到碳酸盐水溶液中。

在某些实施例中，系统可包括具有膜的生物反应器，其中含有CO2的 气流与该膜的第一表面接触并且碳酸盐水溶液流在该膜的第二表面上。该 膜可至少渗透CO2气体，但不可渗透碳酸盐水溶液流或第一表面不可渗透 该碳酸盐水溶液流。该膜也可支撑固定化碳酸酐酶。气流中的CO2气体可 与固定化碳酸酐酶和该碳酸盐水溶液流相互作用，并且然后转化成碳酸氢 盐。碳酸氢盐然后可被与固定化酶接触的料流吸收。膜材料可为多糖、离 子交换树脂、经处理的二氧化硅、多孔金属结构、碳棒或管、石墨纤维、 二氧化硅珠、纤维素膜或凝胶基质(例如，聚丙烯酰胺凝胶、聚(丙烯酰吗 啉)凝胶、尼龙网等)。解吸器也可以具有固定在标准生物反应器填充材料 上的碳酸酐酶以及来自吸收器的碳酸氢盐溶液进料。

另外，根据具体应用或待处理的气流，这些系统设计可以不同构造组 合。例如，系统规格可根据进料流的CO2含量和整体纯度、回收率、以及 产物流所要求的污染物水平连同两种料流的温度和压力要求进行定制。此 外，填充塔可用作吸收器，结合以膜生物反应器作为解吸器。或者，膜生 物反应器可用作吸收器，而填充柱可用作解吸器。此外，系统设计还可包 括具有标准吸收单元和汽提(反应性蒸馏)单元的碳捕集处理单元。碳捕 集系统的核心组件包括例如吸收单元操作、汽提单元操作以及这两个单元 操作之间的热交换组件。用于加速CO2的吸收和反应的速率的上述系统详 细地描述于WO2010／037109中。

本公开的另一个方面涉及使用任何本文公开的含碳酸酐酶多肽的组合 物来调节水溶液的pH。在某些实施例中，使有效量的组合物与水溶液在 合适条件下接触以调节溶液的pH，从而得到具有所需pH值的溶液。

根据前面描述和以下实例，本发明的组合物和方法的其他方面和实施 例将显而易见。

实例

提供如下实例来展示和说明本公开的某些优选的实施例和方面并且不 应理解为具限制性。

在如下实验公开内容中，如下缩写适用：M(摩尔／升)；mM(毫摩 尔／升)；μM(微摩尔／升)；nM(纳摩尔／升)；mol(摩尔)；mmol (毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g和gm(克)；mg (毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；Pg(皮克)；L(升)；ml和mL (毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微 米)；nm(纳米)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s) (分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未进 行)；rpm(转／分钟)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐 酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔 顿)；Na2SO4(硫酸钠)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；Ca (钙)；Mg(镁)；SO4(硫酸根)；SOx(硫氧化物)、NOx(氮氧化 物)、CO2(二氧化碳)；H2SO4(硫酸)；NaHCO3-(碳酸氢钠)； KHCO3-(碳酸氢钾)；HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸)；CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)；BSA (牛血清白蛋白)；w／v(重量／体积)；v／v(体积／体积)；ppm(份／百万 份)；Bgi CA1(吉氏芽孢杆菌碳酸酐酶1)；Pvi CA1(维也纳原小单孢 菌碳酸酐酶1)；Ate CA1(土曲霉碳酸酐酶1)；Spr CA1(始旋链霉菌 碳酸酐酶1)；Bag CA1(粘琼脂芽孢杆菌碳酸酐酶1)；Vsp CA1(弧菌 属物种AND4碳酸酐酶1)；以及VspE CA1(弧菌属物种Ex25碳酸酐酶 1)。

实例1

A.吉氏芽孢杆菌碳酸酐酶Bgi CA1的克隆

从吉氏芽孢杆菌DSM8722株的基因组鉴定出碳酸酐酶基因Bgi  CA1。该基因的序列在SEQ ID NO：1中描述。由Bgi CA1基因编码的蛋白 质的序列在SEQ ID NO：2中描述。该基因具有替代起始密码子(TTG)。在 N端，该蛋白质具有长度为29个氨基酸的信号肽，如通过SignalP-NN所 预测的(Emanuelsson等人，Nature Protocols(《自然实验手册》)，2：953- 971，2007)。信号序列的存在表明Bgi CA1是分泌性酶。

从吉氏芽孢杆菌分离的Bgi CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：1示 出：

TTGAAACGATCAAATCTACTTATTAAAACGACAGTAGCCGCTACCATT CTATTAACTAGTACATCCTTTTTGACAGAAGCAATGCTTGCACATGGA AATCACGTAAGTTCCTCTTCTTTAATTCATTCACCCTATGATCGTTTGA CTGCGAACGCGTCCCATGATTGGTCATATTCTGGTCCAACAGGTCCTG AGTTTTGGGGAGAGCTTGACTCTGAATTTAAAGCCTGCTCTAATGGCA CGCAGCAATCCCCAATTGCACTAGACCCAACCGATGTTGGCGATGAA AAATGGAGCTTGGACCTAGATTATGCCAAAACAGAGTTTTCCATTGAA AACAATGGTCATACCATTCAAGCCAATGTGGTTGAAAAAAAAGGACA GCCTTCCAATCAATTAACACTTGGCGACTCCACATATGAACTGGTTCA ATTTCATTTTCACTCACCGAGTGAGCATACGCTAGCAGGAGAGTCTTA TGAAATGGAAGTACACCTTGTTCATAAAGATGAGCAAGACAATCTTGC TGTGTTAGGCGTATTAATGGAAGAAGGAGAAAAAAACAAAGCTTTAA AAGATATGTGGAAGAAGATGCCGACTAGTGTCGGAACTTCAACTAAA ACCATTAAGTTAAATCCTAGTGAGCTGGTTCCTACTGATCTATCAACT TTTCAATATGACGGTTCGCTTACTACCCCGCCTTGCTCTGAAGGTGTG AAGTGGAGTGTGAGTGACTCTTCAATTACACTCTCTTCGGAACAGCTT CAAGCTTTTCAAGATTTGTACCCGAATAACTATCGCCCAATTCAAGAT TTAGGGGATCGTGAAGTTGGTTTTCATTAT

Bgi CA1前体蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO：2示出。所预测的天然 信号肽以斜体字显示。

MKRSNLLIKTTVAATILLTSTSFLTEAMLAHGNHVSSSSLIHSPYDRLTANAS HDWSYSGPTGPEFWGELDSEFKACSNGTQQSPIALDPTDVGDEKWSLDL DYAKTEFSIENNGHTIQANVVEKKGQPSNQLTLGDSTYELVQFHFHSPSE HTLAGESYEMEVHLVHKDEQDNLAVLGVLMEEGEKNKALKDMWKKM PTSVGTSTKTIKLNPSELVPTDLSTFQYDGSLTTPPCSEGVKWSVSDSSITL SSEQLQAFQDLYPNNYRPIQDLGDREVGFHY

成熟形式的Bgi CA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：3示出：

AHGNHVSSSSLIHSPYDRLTANASHDWSYSGPTGPEFWGELDSEFKACSN GTQQSPIALDPTDVGDEKWSLDLDYAKTEFSIENNGHTIQANVVEKKGQP SNQLTLGDSTYELVQFHFHSPSEHTLAGESYEMEVHLVHKDEQDNLAVL GVLMEEGEKNKALKDMWKKMPTSVGTSTKTIKLNPSELVPTDLSTFQYD GSLTTPPCSEGVKWSVSDSSITLSSEQLQAFQDLYPNNYRPIQDLGDREVG FHY

B.吉氏芽孢杆菌碳酸酐酶(Bgi CA1)的表达

通过PCR从吉氏芽孢杆菌的基因组DNA扩增Bgi CA1基因。根据制 造商的说明使用热循环仪用KOD-plus聚合酶(TOYOBA)进行PCR(退火 温度为59℃)。所用引物为：BgiCA1-Fw5′-GCGGCTAGCG  CAGCACATGG AAATCACGTA AGTT-3′(SEQ ID NO：4)和BgiCA1-Rv5′- GCGGTTAACT CATTAATAAT GAAAACCAAC TTCACG-3′(SEQ ID NO： 5)。为了移除Bgi CA1基因内的内部NheI位点，首先进行重叠PCR以在 Bgi CA1基因中引入点突变(A387突变至G387)。用于插入突变的引物 是：BgiCA1-mu-Fw5′-AGCATACGCT GGCAGGAGAG TCTTATGAAA  TGG-3′(SEQ ID NO：6)和BgiCA1-mu-Rv5′-CTCTCCTGCC AGCGTATGCT  CACTCGGTGA-3′(SEQ ID NO：7)。

将所得的成熟Bgi CA1DNA的PCR片段用NheI和HpaI消化并用T4 DNA连接酶连接进用相同限制酶消化的pHPLT载体(参见美国专利 6,566,112，含有地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)和另外的来自pUB110 (McKenzie等人，Plasmid(《质粒》)，15：93-103，1986)的元件，包括 复制酶基因(reppUB)、新霉素／卡那霉素抗性基因(neo)以及博来霉素抗性标 记(bleo))(50ng／μL)中，以获得表达质粒pHPLT02-Bgi CA1(图1)。连接 所用的反应条件是依据供应商(马萨诸塞州的纽英伦生物技术公司(New  England Biolabs，MA))的说明。pHPLT02载体含有热稳定性淀粉酶LAT 启动子(pLAT)和来自地衣芽孢杆菌菌株DSM13的信号肽用于表达Bgi  CA1。该载体可在枯草芽孢杆菌中复制。使用滚环试剂盒(新泽西州的通 用电气医疗集团生命科学部门(GE Healthcare Life Sciences，NJ))扩增连接 混合物。用扩增的连接混合物转化包括多个蛋白酶基因(包括例如基因 nprE、aprE、nprB、vpr等)缺失的多缺失枯草芽孢杆菌宿主株。将转化 的细胞涂布接种于补充有10ppm卡那霉素的Luria琼脂板上。获得约50- 100个菌落，挑取其中24个并在24孔板中培养。通过DNA测序来确定 Bgi CA1基因的序列。将来自24孔板的所选克隆在7L发酵罐中进一步培 养。

质粒pHPLT02-Bgi CA1的Bgi CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：8 示出。信号序列以斜体字显示，并且NheI限制位点以粗体显示。

ATGAAAAACATCCGCAAAACGGTCATCTTTGCGGCAATCATCCTGCTGGTC CATACAGCGGTTCCGGCAATCCCGGCTAGCGCAGCACATGGAAATCACG TAAGTTCCTCTTCTTTAATTCATTCACCCTATGATCGTTTGACTGCGAA CGCGTCCCATGATTGGTCATATTCTGGTCCAACAGGTCCTGAGTTTTG GGGAGAGCTTGACTCTGAATTTAAAGCCTGCTCTAATGGCACGCAGCA ATCCCCAATTGCACTAGACCCAACCGATGTTGGCGATGAAAAATGGA GCTTGGACCTAGATTATGCCAAAACAGAGTTTTCCATTGAAAACAATG GTCATACCATTCAAGCCAATGTGGTTGAAAAAAAAGGACAGCCTTCC AATCAATTAACACTTGGCGACTCCACATATGAACTGGTTCAATTTCAT TTTCACTCACCGAGTGAGCATACGCTGGCAGGAGAGTCTTATGAAATG GAAGTACACCTTGTTCATAAAGATGAGCAAGACAATCTTGCTGTGTTA GGCGTATTAATGGAAGAAGGAGAAAAAAACAAAGCTTTAAAAGATAT GTGGAAGAAGATGCCGACTAGTGTCGGAACTTCAACTAAAACCATTA AGTTAAATCCTAGTGAGCTGGTTCCTACTGATCTATCAACTTTTCAATA TGACGGTTCGCTTACTACCCCGCCTTGCTCTGAAGGTGTGAAGTGGAG TGTGAGTGACTCTTCAATTACACTCTCTTCGGAACAGCTTCAAGCTTTT CAAGATTTGTACCCGAATAACTATCGCCCAATTCAAGATTTAGGGGAT CGTGAAGTTGGTTTTCATTATTAA

从质粒pHPLT02-Bgi CA1表达的Bgi CA1前体蛋白的氨基酸序列以 SEQ ID NO：9示出：

MKNIRKTVIFAAIILLVHTAVPAIPASAAHGNHVSSSSLI HSPYDRLTANASHDWSYSGP TGPEFWGELDSEFKACSNGTQQSPIALDPTDVGDEKWSLDLDYAKTEFSI ENNGHTIQANVVEKKGQPSNQLTLGDSTYELVQFHFHSPSEHTLAGESYE MEVHLVHKDEQDNLAVLGVLMEEGEKNKALKDMWKKMPTSVGTSTKT IKLNPSELVPTDLSTFQYDGSLTTPPCSEGVKWSVSDSSITLSSEQLQAFQD LYPNNYRPIQDLGDREVGFHY

将若干信号序列用于表达Bgi CA1。这些序列列于表1B-1中。

表1B-1：用于表达Bgi CA1的信号序列

SEQ ID 信号序列(SS) NO：10 MKNIRKTVIFAAIILLVHTAVPAIPASA NO：11 MIKKWAVHLLFSALVLLGLSGASA NO：12 MAAEKVFSKNKIIGGKRMSYMKRSISVFIACFMVAALGISGIIAPKASA NO：13 MKKTIMSLAAAAAMSATAFGATASA NO：14 MKKFACVVIFLLLAAVIAGCAADASA NO：15 MKKRLMSLLVCILVLVPAAGASA

Bgi CA1的蛋白质纯化

使用三个色谱柱从来自7L发酵罐操作的浓缩发酵液纯化Bgi CA1蛋 白：1)用含有1M硫酸铵的20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)平衡的苯基琼脂 糖凝胶柱，以空隙体积从其中洗脱该蛋白质；2)用20mM Tris HCl缓冲液 (pH8.0)平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶柱，使用平衡／洗涤缓冲液至含有 0.5M NaCl的20mM Tris HCl(pH8.0)缓冲液的线性梯度从其中洗脱该蛋白 质；3)Superdex75凝胶过滤柱，使用含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH 7.0)从其中洗脱该蛋白质。将纯化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra- 15装置浓缩并且将浓缩的蛋白质级分用于进一步的研究。

C.Bgi CA1的碳酸酐酶活性

在冰上于含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25 ℃)中测量纯化的Bgi CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含 有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)添加至置于 冰上的50mL聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着添加 2mL冷冻CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离 子化)。在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使 用秒表记录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复测试直至至少三次空白测 量(加有缓冲液)是在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空白，平均) 在70秒至100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准 曲线。一式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(Wilbur-Anderson(W-A)单位，Wilbur和Anderson，J. Biol.Chem.(《生物化学杂志》)176，147-154，1948)定义为0.02M  Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫克蛋白质＝(单位／毫升酶)／(毫克蛋白质／毫升酶)

使用上述方法，纯化的Bgi CA1的比活性测定为4023+387单位／毫 克。Bgi CA1的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

D.Bgi CA1的温度稳定性

在0.1M Tris缓冲液(pH8.5)(在25℃下用H2SO4调节)、0.1M CHES 缓冲液(pH9.5)(在25℃下用H2SO4调节)以及0.1M CAPS缓冲液(pH10.5) (在25℃下用H2S04调节)中测定Bgi CA1的温度稳定性。向缓冲液添加 Na2SO4至终浓度为25mM。在室温(25℃)下或在40℃和50℃的水浴中温育 缓冲液(终体积为20mL)中的100ppm Bgi CA1。在不同时间点(5分钟 至24小时)，从每根管中取出0.5mL酶样品并置于冰上。如实例1C中所 述测量每份酶样品的比活性。一式三份地进行比活性测量。计算每一时间 点下以及每一pH值下的残余活性百分比。对于每一pH值，样品在时间0 时的活性定义为100％活性。如图2A-C中所示，Bgi CA1在25℃和40℃ 下历经24小时温育期仍保持90％以上的活性。在50℃下，在pH8.5和pH 9.5下的3小时温育期后保持至少70％的活性，而在pH10.5下保持25％活 性。因此，Bgi CA1在酶促CO2提取通常使用的不同pH范围内并且在超 生理温度下是稳定的。

E.Bgi CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

在1M NaHCO3溶液中测定Bgi CA1在高离子强度条件下的稳定性。 在PCR机器中，在20℃和50℃下温育Bgi CA1在1M NaHCO3中的 100ppm溶液。如实例1C中所述测量样品的比活性。在温育之前以及在不 同时间点(5分钟至3小时)，取出100μL样品，在冰上冷却并测量它们 的比活性。一式三份地进行比活性测量。计算每一时间点的残余活性百分 比。保持在冰上的样品在时间0时的活性定义为100％活性。图3显示了 Bgi CA1在1M NaHCO3中的稳定性。Bgi CA1在20℃和50℃下历经3小 时温育期仍保持大部分活性。因此，Bgi CA1在酶促CO2提取所遇到的高 浓度NaHCO3存在下是稳定的。

F.Bgi CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司(MicroCal，Inc.，Northampton，MA))测量Bgi CA1和牛碳酸 酐酶II(bCA II)的超额热容曲线。关于DSC测量的标准程序和该技术的理 论先前已有描述(Freire，Differential Scanning Calorimetry(差示扫描量热 法)，Methods Mol.Biol.(《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。研 究约500μL的每种酶的0.5mg／mL样品。在35-100℃温度范围内扫描蛋白 质。然后再次扫描相同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆性。 对于所研究的两种碳酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓冲液中研究 蛋白质：(1)0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH 10.5，以及(4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaCl。将200℃／小时的扫描速率用 于使可能由聚集引起的任何假象减至最少。使用DSC曲线的表观热中点 [Tm(app)]作为这些碳酸酐酶分子的热稳定性和解链点(melting point)的指 标。每种酶在各种缓冲液中的解链温度(Tm app)示于表1F-1中。

两种碳酸酐酶蛋白在热去折叠期间的Tm(app)值在8.5至10.5内显示 pH依赖性。牛碳酸酐酶II在pH8.5至9.5之间具有最高Tm(app)值，而 Bgi CA1在pH8.5下具有最高Tm(app)值。含2M NaCl的0.1M CHES(pH 9.5)缓冲液使牛CA II的Tm(app)降低，并且使Bgi CA1的Tm(app)升高。对 于Bgi CA1，碳酸盐缓冲液使Tm(app)显著升高，并且含2M NaCl的0.1M  CHES(pH9.5)使Tm升高约15℃。因此，Bgi CA1适于较高温度下的酶促 CO2提取，因为该酶的Tm在碳酸盐溶液中以及在酶促CO2提取典型的高离 子强度条件下升高。

表1F-1：Bgi CA1和bCAII的解链温度

还测定了在未加入NaCl以及加有多种浓度的NaCl(范围为0.1M至 1M)的1M KHCO3中bCAII和Bgi CA1的Tm(app)(表1F-2)。bCAII在 碳酸氢盐溶液中的Tm(app)相比于在缓冲液中的Tm(app)有所降低，而Bgi  CA1在碳酸氢盐溶液中以及在增加的离子强度下的Tm(app)升高。Tm(app) 的这种增加指示酶Bgi CA1在酶促CO2提取中的适宜性，尤其在高浓度的 碳酸盐溶液存在下以及在高离子强度条件下。还注意到，Bgi CA1的 Tm(app)随着KHCO3浓度增大而升高，这是出乎意料的。

表1F-2：Bgi CA1在1M KHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) bCA II Bgi CA1 0 62.1 70.9 0.1 62.8 71.4 0.5 62.5 74.1 1 62.7 76.6

G.同源性鉴定

对Bgi CA1成熟蛋白质序列(252个残基)进行BLASTP搜索，并选 择前十个蛋白质序列用于序列比对(Vector NTI，英杰公司(Invitrogen))。 表1G-1显示了如下比对序列的同一性百分比和NCBI登录号：NP_241226 (SEQ ID NO：16)、NP_767777(SEQ ID NO：17)、NP_946147(SEQ ID  NO：18)、YP_003428428(SEQ ID NO：19)、YP_003868697(SEQ ID  NO：20)、YP_003944556(SEQ ID NO：21)、YP_176677(SEQ ID NO：22)、 YP_488219(SEQ ID NO：23)、ZP_04209878(SEQ ID NO：24)和ZP_04248491 (SEQ ID NO：25)。使用程序MEGA5(参见Tamura K.等人，Molecular  Biology and Evolution(《分子生物学与进化》)，2011，待出版)，将比 对序列用于制备系统发生树。图5示出了Bgi CA1及其同源物的系统发生 树。

表1G-1：Bgi CA1和类似序列所共有的同一性百分比

实例2

A.维也纳原小单孢菌碳酸酐酶1Pvi CA1的克隆

从维也纳原小单孢菌YIM65009株的基因组鉴定出碳酸酐酶基因Pvi  CA1。该基因的序列在SEQ ID NO：26中描述。由Pvi CA1基因编码的蛋白 质在SEQ ID NO：27中描述。该基因具有替代性起始密码子(GTG)。在N 端，该蛋白质具有长度为25个氨基酸的信号肽，如通过SignalP-NN所预 测的(Emanuelsson等人，Nature Protocols(《自然实验手册》)，2：953- 971，2007)。信号序列的存在表明Pvi CA1是分泌性酶。

从维也纳原小单孢菌分离的Pvi CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO： 26示出：

GTGAAGAAGCTCGCCCTGCCCACCGTCCTGCTCCTCGCCCCGTTGCTC GCGTCCTGCGCGTCGGGCACCGCCGCCGACGGCGAGACGTCCGCACC CCCGCCGCCCGCGACCGACGAGGTGCACTGGTCCTACGAAGGGGACA CGGGCCCGGACAACTGGGGCCAGCTCTCCGACGAGTTCGTCGAGTGC TCGATCGGCGAGGCGCAGTCCCCCGTCGACCTGCCGGACCACGCCGA CGAGACGACCACCGAGCCCCCGACGGTCACGACGTGGCCCACCGTCG GCGAGTCGGTCGACACCGGCCACACGATCCAGCTCGTGCCCGACGGC GACGCGTCCGAGGTCGAGTGGCAGGACACCACGTTCGACCTCGCCCA GGTGCACTTCCACATGCCCTCGGAGCACACGATCGAGGGTGAGGCGC TCGACGCCGAGTTCCACTTCGTCCACACCACGGAGGAAGGACAGGCG CTCGTCATCGGGGTCCTCGCGCGGGAGAGCAGCACCGAGAACGAGGC CTGGCAGCCGTTCATCGATGGTGCGGCCGAGCCGGGCACCGAGGACC TGCCGCTCGACGTCGCCGCGATGCTACCGACGGACCCGACGTTCGAG GAGTACACGGGCAGCCTCACGACCCCGCCGTGCACCGAGGGCGTCGA GTGGGTCGTCTACCACGAGCCCATCGAGCTGTCGGCGGAGCAGATCG CCGTGCTCAGGGACGCGTACGACAACACCGCGCGCCCGACCCAGCTC CTGGGCGACCGCGTCGTGTACGAGGGCACCATCGACGTGGAGGCGGA GGAGGCGCAC

Pvi CA1前体蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO：27示出。预测的信号 肽以斜体字显示。

MKKLALPTVLLLAPLLASCASGTAADGETSAPPPPATDEVHWSYEGDTGPD NWGQLSDEFVECSIGEAQSPVDLPDHADETTTEPPTVTTWPTVGESVDTG HTIQLVPDGDASEVEWQDTTFDLAQVHFHMPSEHTIEGEALDAEFHFVHT TEEGQALVIGVLARESSTENEAWQPFIDGAAEPGTEDLPLDVAAMLPTDP TFEEYTGSLTTPPCTEGVEWVVYHEPIELSAEQIAVLRDAYDNTARPTQLL GDRVVYEGTIDVEAEEAH

成熟形式的Pvi CA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：28示出：

DGETSAPPPPATDEVHWSYEGDTGPDNWGQLSDEFVECSIGEAQSPVDLP DHADETTTEPPTVTTWPTVGESVDTGHTIQLVPDGDASEVEWQDTTFDL AQVHFHMPSEHTIEGEALDAEFHFVHTTEEGQALVIGVLARESSTENEAW QPFIDGAAEPGTEDLPLDVAAMLPTDPTFEEYTGSLTTPPCTEGVEWVVY HEPIELSAEQIAVLRDAYDNTARPTQLLGDRVVYEGTIDVEAEEAH

B.维也纳原小单孢菌碳酸酐酶1(Pvi CA1)的表达

通过PCR从维也纳原小单孢菌的基因组DNA扩增Pvi CA1基因。根 据制造商的说明使用热循环仪利用KOD-plus聚合酶(TOYOBA)进行PCR (退火温度为59℃)。所用引物为：PviCA1-Fw5′-AGCGCTAGCC  GGCCCCCCGG CACAGGCCGA CGGCGAGACG TCCGCACCCC-3′(SEQ  ID NO：29)和PviCA1-RV5′-TCCGGATCCT TAGTGCGCCT  CCTCCGCCTCCACGT-3′(SEQ ID NO：30)。

将所得的成熟Pvi CA1DNA的PCR片段用NheI和BamHI消化，并连 接进pKB128载体中，然后用相同限制酶消化，以获得表达质粒pJG183 (图6)。pKB128质粒是pKB105质粒的衍生物(如美国专利申请公开 No.2006/0154843中所述)并且是A4启动子-CelA信号序列的来源。遵循 制造商的方案将连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(英 杰公司)。将转化的细胞涂布接种于补充有50ppm氨苄青霉素的Luria琼 脂板上并在37℃下温育过夜。从平板挑取三个转化株并接种进补充有 50ppm氨苄青霉素的5mL Luria肉汤中。将培养物在37℃下培养过夜，提 取质粒DNA并通过DNA测序确定Pvi CA1基因的正确序列。然后将 pJG183质粒用于转化变铅青链霉菌TK23衍生的原生质体(如美国专利申 请公开No.2006／0154843中所述)。所用转化技术描述于Kieser等人， Practical Streptomyces Genetics(《实用链霉菌遗传学》)，英国诺维奇市 的约翰英纳斯基金会(The John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom)， 2000中。将转化的细胞涂布接种于R5选择板上并在30℃下温育3天。在 28℃下将来自链霉菌转化板的一个克隆接种在摇瓶中的TSG培养基中3 天。然后将培养物转移至链霉菌2改性培养基(如美国专利申请公开No. 2006/0154843中所述)并在28℃下再温育4天。

使用如下成分制备TSG培养基：16g BD Difco胰蛋白胨、4g BD细菌 用大豆蛋白胨、20g Sigma酪蛋白(水解产物)以及10g磷酸氢二钾，补足 至1L。高压灭菌后，加入50％葡萄糖至终浓度为1.5％。

使用如下成分制备R5板：添加206g蔗糖、0.5g K2SO4、20.24g  MgCl2、20g葡萄糖、0.2g Difco酪蛋白氨基酸、10g Difco酵母提取物、 11.46g TES、4g L-Asp、4mL痕量元素、44g Difco琼脂、20mL5％ K2HPO4、8mL5M CaCl2·2H2O和14mL1N NaOH至在高压灭菌后终体积为 1L。20小时后，将一层硫链丝菌素(50μg／mL终浓度)涂布接种于板的顶 部。

质粒pJG183(A4-celA-PviCA1)的Pvi CA1基因的核苷酸序列以SEQ  ID NO：31示出：

GACGGCGAGACGTCCGCACCCCCGCCGCCCGCGACCGACGAGGTGCA CTGGTCCTACGAAGGGGACACGGGCCCGGACAACTGGGGCCAGCTCT CCGACGAGTTCGTCGAGTGCTCGATCGGCGAGGCGCAGTCCCCCGTCG ACCTGCCGGACCACGCCGACGAGACGACCACCGAGCCCCCGACGGTC ACGACGTGGCCCACCGTCGGCGAGTCGGTCGACACCGGCCACACGAT CCAGCTCGTGCCCGACGGCGACGCGTCCGAGGTCGAGTGGCAGGACA CCACGTTCGACCTCGCCCAGGTGCACTTCCACATGCCCTCGGAGCACA CGATCGAGGGTGAGGCGCTCGACGCCGAGTTCCACTTCGTCCACACCA CGGAGGAAGGACAGGCGCTCGTCATCGGGGTCCTCGCGCGGGAGAGC AGCACCGAGAACGAGGCCTGGCAGCCGTTCATCGATGGTGCGGCCGA GCCGGGCACCGAGGACCTGCCGCTCGACGTCGCCGCGATGCTACCGA CGGACCCGACGTTCGAGGAGTACACGGGCAGCCTCACGACCCCGCCG TGCACCGAGGGCGTCGAGTGGGTCGTCTACCACGAGCCCATCGAGCT GTCGGCGGAGCAGATCGCCGTGCTCAGGGACGCGTACGACAACACCG CGCGCCCGACCCAGCTCCTGGGCGACCGCGTCGTGTACGAGGGCACC ATCGACGTGGAGGCGGAGGAGGCGCAC

Pvi CA1的蛋白质纯化

在标准条件下在摇瓶中培养表达Pvi CA1的变铅青链霉菌细胞。使用 如下两个色谱柱从发酵液纯化Pvi CA1:1)用20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0) 平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶柱，使用平衡／洗涤缓冲液至含有0.5M  NaCl的20mM Tris HCl(pH8.0)缓冲液的线性梯度从其中洗脱出该蛋白；2) Superdex75凝胶过滤柱，使用含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)从 其中洗脱出该蛋白。将纯化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装 置浓缩并且将浓缩的蛋白质级分用于进一步的研究。

C.Pvi CA1的碳酸酐酶活性

在冰上于含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25 ℃)中测量纯化的Pvi CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含 有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)添加至置于 冰上的50mL聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着添加 2mL冷冻CO2饱和水(使用密理博公司(Millipore)的Milli-Q Integral系统纯 化并去离子化)。在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶 液中并使用秒表记录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复测试直至至少三 次空白测量(加有缓冲液)是在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T 空白，平均)在70秒至100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522) 制备标准曲线。一式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(Wilbur-Anderson或W-A单位，Wilbur和Anderson， Journal ofBiological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫克蛋白质＝(单位／毫升酶)／(毫克蛋白质／毫升酶)

使用上述方法，纯化的Pvi CA1的比活性测定为937±65单位／毫克。 Pvi CA1的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

D.Pvi CA1的温度稳定性

在0.1M Tris缓冲液(pH8.5)(在25℃下用H2SO4调节)、0.1M CHES 缓冲液(pH9.5)(在25℃下用H2SO4调节)以及0.1M CAPS缓冲液(pH10.5) (在25℃下用H2SO4调节)中测定Pvi CA1的温度稳定性。向缓冲液添加 Na2SO4至终浓度为25mM。在40℃和50℃的水浴中温育于缓冲液(终体 积为20mL)中的100ppm Pvi CA1。还在室温(25℃)下温育一份样品。在 不同时间点(5分钟至24小时)，从每根管中取出0.5mL酶样品并置于冰 上。如实例2C中所述测量每份酶样品的比活性。一式三份地进行比活性 测量。计算每一时间点下、每一pH值下的残余活性百分比。对于每一 pH，保持在0℃的样品在时间0时的活性定义为100％活性。Pvi CA1在25 ℃下在pH8.5和pH9.5下保持80％活性。在40℃下，该酶在pH8.5和pH 9.5下27小时仍保持70％以上的活性，并且在pH10.5下3小时仍保持 30％活性。因此，Pvi CA1的稳定性适于在不同pH下的酶促CO2封存工 艺。如图7A-C中所示，Pvi CA1在酶促CO2提取通常使用的不同pH范围 内并且在超生理温度下是稳定的。

E.Pvi CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

评估Pvi CA1在高离子强度条件下的稳定性。在PCR机器中，在20 ℃和50℃下温育Pvi CA1在1M NaHCO3中的100ppm溶液。如实例2C中 所述在温育之前测量样品的比活性。在不同时间点(5分钟至3小时)， 取出100μL样品，在冰上冷却并如实例2C中所述测量它们的比活性。计 算每一时间点的残余活性百分比。保持在冰上的样品在时间0时的活性定 义为100％活性。图8显示了Pvi CA1在1M NaHCO3中的稳定性。Pvi CA1 在20℃和50℃下历经3小时温育期仍保持大部分活性。因此，Pvi CA1在 酶促CO2提取所遇到的高浓度NaHCO3存在下是稳定的。

F.Pvi CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量Pvi CA1和牛碳酸酐酶II(bCA II)的超额热容曲 线。关于差示扫描量热法(DSC)测量的标准程序和该技术的理论先前已有 描述(Freire，Methods Mol Biol，(《分子生物学方法》)，41：191-218， 1995)。研究约500μL的每种酶的0.5mg／mL样品。在35-100℃温度范围 内扫描蛋白质。然后再次扫描相同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程 的可逆性。对于所研究的两种碳酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓 冲液中研究蛋白质：(1)0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3) 0.1M CAPS，pH10.5，以及(4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaC1。将200℃／小 时的扫描速率用于使可能由聚集引起的任何假象减至最少。使用DSC曲线 的表观热中点[Tm(app)]作为这些碳酸酐酶分子的热稳定性和解链温度的指 标。每种酶在各种缓冲液中的解链温度(Tm app)示于表2F-1中。

两种碳酸酐酶蛋白质在热去折叠期间的Tm(app)值在pH8.5至pH10.5 的范围内显示pH依赖性。牛碳酸酐酶II在pH8.5与pH9.5之间具有最高 Tm(app)值，而Pvi CA1在pH8.5下具有最高Tm(app)值。含2M NaCl的 0.1M CHES(pH9.5)缓冲液使牛CA II的Tm(app)降低，并且使Pvi CA1的 Tm(app)升高。对于Pvi CA1，与不含添加剂的0.1M CHES缓冲液(pH9.5) 相比，含2M NaCl的0.1M CHES(pH9.5)缓冲液使Tm(app)升高约6℃。因 此，Pvi CA1适合于较高温度下的酶促CO2提取，因为该酶的Tm在碳酸盐 溶液中以及在酶促CO2提取典型的高离子强度条件下升高。

表2F-1：Pvi CA1和bCAII的解链点温度

还测定了bCAII和Pvi CA1在1M KHCO3中在未加入NaCl、在加有多 种浓度的NaCl(范围为0.1M至1M)的情况下的Tm(app)(表2F-2)。 bCAII在碳酸氢盐溶液中的Tm(app)相比于在缓冲液中的Tm(app)有所降 低，而Pvi CA1在碳酸氢盐溶液中以及在增大的离子强度下的Tm(app)升 高。Tm(app)的这种增加指示酶Pvi CA1在酶促CO2提取中的适宜性，尤其 在高浓度的碳酸盐溶液存在下以及在高离子强度条件下。在较高离子强度 下Tm(app)较高的这种观测结果是出乎意料的。

表2F-2：Pvi CA1在1M KHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) bCA II Pvi CA1 0 62.1 72.1 0.1 62.8 73.3 0.5 62.5 74.6 1 627 75.8

G.同源性鉴定

对Pvi CA1成熟蛋白质序列(245个残基)进行BLASTP搜索，并选 择前十个蛋白质序列用于序列比对(Vector NTI，英杰公司)。图9显示 了Pvi CA1与类似碳酸酐酶序列的比对。表2G-1显示了如下比对序列的同 一性百分比和NCBI登录号：NP_241226(SEQ ID NO：16)、YP_003166850 (SEQ ID NO：32)、YP_003610599(SEQ ID NO：33)、YP_003868697(SEQ  ID NO：20)、YP_003944556(SEQ ID NO：21)、YP_287120(SEQ ID NO： 34)、YP_419944(SEQ ID NO：35)、ZP_00056365(SEQ ID NO：36)、 ZP_05029585(SEQ ID NO：37)以及ZP_08017465(SEQ ID NO：38)。使用程 序MEGA5(参见Tamura K.等人，Molecular Biology and Evolution(《分 子生物学与进化)》)，2011，待出版)，将比对序列用于制备系统发生 树。图10示出了Pvi CA1及其同源物的系统发生树。

表2G-1：Pvi CA1和类似序列所共有的同一性百分比

实例3

A.土曲霉碳酸酐酶1(Ate CA1)的序列

土曲霉NIH2624的基因组DNA购自密苏里州堪萨斯城的真菌遗传资 源中心(Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，MO)(FGSC A1156)。Ate  CA1基因的核酸序列(NCBI参考序列(NCBI Reference Sequence) NT_165972.1)以及由Ate CA1基因编码的假想蛋白的氨基酸序列可见于 NCBI数据库中(NCBI登录号为XP_001210252)。

B.土曲霉碳酸酐酶1(Ate CA1)的表达

通过PCR从土曲霉NIH2624的基因组DNA扩增Ate CA1基因。根据 制造商的说明使用热循环仪利用KOD-plus聚合酶(TOYOBA)进行PCR (退火温度为59℃)。引物设计是基于Ate CA1基因组DNA的序列。将 如下引物用于扩增Ate CA1基因：AteCA1-Fw5′-GCGGCGGCCG  CACCATGAAG CTCACTGCTG CCGTT-3′(SEQ ID NO：39)；和AteCA1- Rv5′-CCGGCGCGCC CTTACTAGTT GAGGCTCTTG GCCG-3′(SEQ ID  NO：40)。正向引物含有NotI限制位点，且反向引物含有AscI限制位点。

将PCR产物纯化，用NotI和AscI消化，连接进质粒载体pTTT(衍生 自载体pTTT，如US2011／0020899A1中所述)中，并用相同限制酶消化以 获得pTTT-Ate CA1。pTTT-Ate CA1的质粒图谱示于图11中。遵循制造商 的方案将连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(英杰公 司)。将转化的细胞涂布接种于补充有50ppm氨苄青霉素的Luria琼脂板 上并在37℃下温育过夜。从平板挑取三个转化株，接种进补充有50ppm氨 苄青霉素的5mL Luria肉汤中，并培养过夜。将从这些培养物提取的质粒 DNA送去进行序列确定。

在序列确定之后，使用PEG原生质体方法(Penttila等人，Gene (《基因》)，61：155-164，1987)用表达质粒pTTT-Ate CA1转化四重缺失 型里氏木霉菌株的原生质体(如WO05／001036中所述)。对于原生质体 制备，将孢子在24℃下在木霉(Trichoderma)基本培养基MM(20g／L葡萄 糖、15g／L KH2PO4(pH4.5)、5g／L(NH4)2SO4、0.6g／L MgSO4X7H2O、0.6g／L  CaCl2x2H2O、1mL1000X里氏木霉痕量元素溶液(175g／L无水柠檬酸、 200g／L FeSO4x7H2O、16g／L ZnSO4x7H2O、3.2g／L CuSO4、1.4g／L  MnSO4xH2O以及0.8g／L硼酸))中培养约10小时。在30℃下以100rpm 通过离心收获萌发的孢子并用30mg／mL Vinoflow FCE(瑞士诺维信公司 (Novozymes，AG Switzerland))溶液处理7小时至过夜以溶解真菌细胞壁。 将原生质体在含有0.6M山梨醇的0.1M Tris HCl缓冲液(pH7)中洗涤并再 次悬浮于含有1.2M山梨醇和10mM氯化钙的10mM Tris HCl缓冲液(pH 7.5)中。对于PEG转化，将总体积为200μL的大约1μgDNA和1-5×107个 原生质体用2mL的25％PEG溶液处理，用2体积的1.2M山梨醇／10mM  Tris(pH7.5)／10mM CaCl2溶液稀释。在含有乙酰胺作为唯一氮源的培养基 (乙酰胺0.6g／L；氯化铯1.68g／L；葡萄糖20g／L；磷酸二氢钾15g／L；七 水合硫酸镁0.6g／L；二水合氯化钙0.6g／L；硫酸铁(II)5mg／L；硫酸锌 1.4mg／L；氯化钴(II)1mg／L；硫酸镁(II)1.6mg／L；琼脂20g／L；pH4.25)上 选择转化株。约1个星期内出现转化菌落(约50-100个)。在乙酰胺板上 培养后，收集孢子并在乙酰胺板上再次选择。5天后，用10％甘油收集孢 子，并将1×108个孢子接种于含30ml葡萄糖／槐糖确定成分培养基的 250mL摇瓶中用于蛋白质表达。通过SDS-PAGE确定蛋白质表达。随后将 孢子悬浮液在7L发酵罐中于含有60％葡萄糖-槐糖进料的确定成分培养基 中培养。葡萄糖／槐糖确定成分培养基(每升)由如下组成：(NH4)2SO45g、PIPPS缓冲液33g、酪蛋白氨基酸9g、KH2PO44.5g、CaCl2(无水) 1g、MgSO4.7H2O1g，用50％NaOH调节pH至5.5，用Milli-Q H2O补足至 966.5mL。灭菌后，添加如下：26mL60％葡萄糖／槐糖以及400X里氏木霉 微量金属2.5mL。

pTTT-Ate CA1的Ate CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：41示出。 (内含子序列加有下划线)。

ATGAAGCTCACTGCTGCCGTTCTCTCCCTGGCTGTGGCCGCCTCGGCC TCTTGCATCCGCCATGCCCGTCGGGCTGACGGCGTCGTTGAGACCAAC TCCTATAACTACACCGAGATGGGCGGTCCGCTGAACTGGTACGGCCTG GACCCCGAGGCCAACTCTGCCTGCGCCACGGGCAAGCACCAGTCCCC CATCGTCATCCACTCCGAGGACATCGACTATGTCTCCCCGGGATCCCT GAAGTTCGACATCCCCAAGGCCGACTACGCCAAGTTTGAGAACCTTG GGTCCGGCCTCGAGGTCGTTCTGACCAACGGATCTCTCACTGTGGGCA ACAAGAGCCTTCCCCTGGCCCAGTTCCACTTCCATACCCCCAGCGAGC ACCGCGTCAACGACGAGTACTATCCCATGGAGGTTCACTTTGTGTTCC AAAACAAGGGTATGCAGCGTCCCATGCACTCTACAAGTATCAACCCTAACATCGTATAGCCAAAGACACCGCCGTCGTCGGCTTCTTCTTCCAGC TCTCCGAGCTCGGATACTCCGTCCCCCTGTTCGACACCATCTTCGACC ACGTTCTCGAGATCGAGGAGCCTGGTGCCTTCACCCACACCGGGGAG ATGGACTTCGCCGGCCTGACCCACCACCTCTACATGCATGGCATCTAC CAGTACTCTGGCTCCCTGACCACCCCTCCCTGCTCCGAGGACGTCGCC TGGTACCTGAGCACCGAGCCCCTGCCCCTGACCGTCCAGGACTACAAC AAGGTCAAGAAGGTGCTCAAGTACAACGCGCGCTACACACAGAACGC CCTGGGCGAGGACAACCTCCTCGAGGTGGCGGCCAAGAGCCTCAACT AG

Ate CA1前体的氨基酸序列以SEQ ID NO：42示出。预测的信号肽序 列以斜体字显示。

MKLTAAVLSLAVAASASCIRHARRADGVVETNSYNYTEMGGPLNWYGLDP EANSACATGKHQSPIVIHSEDIDYVSPGSLKFDIPKADYAKFENLGSGLEV VLTNGSLTVGNKSLPLAQFHFHTPSEHRVNDEYYPMEVHFVFQNKAKDT AVVGFFFQLSELGYSVPLFDTIFDHVLEIEEPGAFTHTGEMDFAGLTHHLY MHGIYQYSGSLTTPPCSEDVAWYLSTEPLPLTVQDYNKVKKVLKYNARY TQNALGEDNLLEVAAKSLN

成熟形式的Ate CA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：43示出。

SCIRHARRADGVVETNSYNYTEMGGPLNWYGLDPEANSACATGKHQSPI VIHSEDIDYVSPGSLKFDIPKADYAKFENLGSGLEVVLTNGSLTVGNKSLP LAQFHFHTPSEHRVNDEYYPMEVHFVFQNKAKDTAVVGFFFQLSELGYS VPLFDTIFDHVLEIEEPGAFTHTGEMDFAGLTHHLYMHGIYQYSGSLTTPP CSEDVAWYLSTEPLPLTVQDYNKVKKVLKYNARYTQNALGEDNLLEVA AKSLN

不具有内含子序列的pTTT-Ate CA1的Ate CA1基因的核苷酸序列以 SEQ ID NO：44示出。

atgaagctcactgctgccgttctctccctggctgtggccgcctcggcctcttgcatccgccatgcccgtcgggctga cggcgtcgttgagaccaactcctataactacaccgagatgggcggtccgctgaactggtacggcctggaccccga ggccaactctgcctgcgccacgggcaagcaccagtcccccatcgtcatccactccgaggacatcgactatgtctcc ccgggatccctgaagttcgacatccccaaggccgactacgccaagtttgagaaccttgggtccggcctcgaggtc gttctgaccaacggatctctcactgtgggcaacaagagccttcccctggcccagttccacttccatacccccagcga gcaccgcgtcaacgacgagtactatcccatggaggttcactttgtgttccaaaacaaggccaaagacaccgccgtc gtcggcttcttcttccagctctccgagctcggatactccgtccccctgttcgacaccatcttcgaccacgttctcgagat cgaggagcctggtgccttcacccacaccggggagatggacttcgccggcctgacccaccacctctacatgcatgg catctaccagtactctggctccctgaccacccctccctgctccgaggacgtcgcctggtacctgagcaccgagccc ctgcccctgaccgtccaggactacaacaaggtcaagaaggtgctcaagtacaacgcgcgctacacacagaacgc cctgggcgaggacaacctcctcgaggtggcggccaagagcctcaactag

Ate CA1的纯化

使用如下三个色谱柱从7L发酵罐的浓缩发酵液纯化Ate CA1：1)用含 有1M硫酸铵的20mM Tris HCl(pH8.0)平衡的苯基琼脂糖凝胶柱，使用平 衡／洗涤缓冲液至20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)的线性梯度从其中洗脱出 该蛋白；2)用20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)平衡的DEAE琼脂糖凝胶柱， 使用平衡／洗涤缓冲液至20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)、0.5M NaCl的线性 梯度从其中洗脱出该蛋白；以及3)Superdex75凝胶过滤柱，使用含有 0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)从其中洗脱出该蛋白。将纯化的蛋白 质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装置浓缩，并且将浓缩的蛋白质级分 用于进一步的研究。

C.Ate CA1的碳酸酐酶活性

在冰上于含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25 ℃)中测量纯化的Ate CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含 有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)添加至置于 冰上的50mL聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着添加 2mL冷冻CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离 子化)。在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使 用秒表记录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复测试直至至少三次空白测 量(加有缓冲液)是在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空白，平均) 在70秒至100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准 曲线。一式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(Wilbur-Anderson(W-A)单位，Wilbur和Anderson， Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫克蛋白质＝(单位／毫升酶)／(毫克蛋白质／毫升酶)

使用上述方法，纯化的Ate CA1的比活性测定为1,327±285单位／毫 克。因此，Ate CA1的碳酸酐酶活性足以用于酶促CO2封存工艺。

D.Ate CA1的温度稳定性

在0.1M Tris缓冲液(pH8.5)(在25℃下用H2SO4调节)、0.1M CHES 缓冲液(pH9.5)(在25℃下用H2SO4调节)以及0.1M CAPS缓冲液(pH10.5) (在25℃下用H2SO4调节)中测定Ate CA1的温度稳定性。向缓冲液添加 Na2SO4至终浓度为25mM。在40℃和50℃的水浴中温育于缓冲液(终体 积为20mL)中的100ppm Ate CA1。还在室温(25℃)下温育一份样品。在 不同时间点(5分钟至24小时)，从每根管中取出0.5mL酶样品并置于冰 上。如实例3C中所述测量每份酶样品的比活性。一式三份地进行比活性 测量。计算每一时间点下以及每一pH值下的残余活性百分比。对于每一 pH，保持在0℃的样品在时间0时的活性定义为100％活性。Ate CA1在 25℃和40℃下在所有pH条件下27小时仍保持大部分活性。此外，Ate  CA1在50℃、pH8.5下27小时仍保持至少60％活性，并且在pH9.5下3 小时仍保持约50％活性。如图12A-C中所示，Ate CA1在酶促CO2提取通 常使用的不同pH范围内并且在超生理温度下是稳定的。

E.Ate CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

评估Ate CA1在碳酸氢盐存在下在高离子强度条件下的稳定性。在 PCR机器中，在20℃和50℃下温育Ate CA1稀释于1M NaHCO3中的 100ppm溶液。如实例3C中所述测量样品的比活性。在温育之前以及在不 同时间点(5分钟至3小时)，取出100μL样品，在冰上冷却并一式三份 地测量它们的比活性。计算每一时间点的残余活性百分比。保持在冰上的 样品在时间0时的活性定义为100％活性。图13显示了Ate CA1在1M  NaHCO3中的稳定性。Ate CA1在20℃和50℃下历经3小时温育期仍保持 大部分活性。因此，Ate CA1在酶促CO2提取所遇到的高浓度NaHCO3存 在下是稳定的。

F.Ate CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量Ate CA1和牛CAII(bCAII)的超额热容曲线。关于 差示扫描量热法(DSC)测量的标准程序和该技术的理论先前已有描述 (Freire，Methods Mol Biol，(《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。 研究约500μL的0.5mg／mL的每一种酶。在35-100℃温度范围内扫描蛋白 质。然后再次扫描相同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆性。 对于所研究的两种碳酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓冲液中研究 蛋白质：(1)0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH 10.5，以及(4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaCl。将200℃／小时的扫描速率用 于使可能由聚集引起的任何假象减至最少。使用DSC曲线的表观热中点 [Tm(app)]作为热稳定性的指标。Ate CA1和bCAII的解链点示于表3F-1 中。

这些碳酸酐酶蛋白质的热去折叠Tm(app)值在8.5至10.5的范围内显示 pH依赖性。牛碳酸酐酶II在pH8.5至pH9.5之间具有最高Tm(app)值； Ate CA1在pH8.5下具有最高Tm(app)值。含2M NaCl的0.1M CHES缓冲 液(pH9.5)使bCA II的Tm(app)降低。对于Ate CA1，与不含添加剂的0.1M  CHES缓冲液(pH9.5)的作用相比，含2M NaCl的0.1M CHES(pH9.5)缓冲 液使Tm(app)升高约7℃。因此，Ate CA1适于较高温度下的酶促CO2提 取，因为该酶的Tm在酶促CO2提取典型的高离子强度条件下升高。

表3F-1：Ate CA1和bCAII的解链点温度

还测定了bCAII和Ate CA1在1M KHCO3中在未加入NaCl、在加有 多种浓度的NaCl(范围为0.1M至1M)的情况下的Tm(app)。如表3F-2中 所示，bCAII在碳酸氢盐溶液中的Tm(app)相比于在缓冲液中的Tm(app)有 所降低，而Ate CA1在碳酸氢盐溶液中以及在增大的离子强度下的Tm(app) 升高。Tm(app)的这种增加指示酶Ate CA1对于酶促CO2提取的适宜性，尤 其在高离子强度下以及在高浓度的碳酸盐溶液存在下。观测到Ate CA1在 较高碳酸氢盐浓度下的Tm(app)相比于在较低碳酸氢盐浓度下的Tm(app)要 高，这是出乎意料的。

表3F-2：Ate CA1在1M KHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) 牛CA II Ate CA1 0 62.1 70.4 0.1 62.8 71.8 0.5 62.5 73.1 1 62.7 74.3

G.同源性鉴定

对Ate CA1成熟蛋白质序列(267个残基)进行BLASTP搜索，并鉴 定出四个蛋白质序列具有50％或更大的同一性。图14显示了用Vector NTI (英杰公司)生成的Ate CA1与类似碳酸酐酶序列的比对。表3G-1显示 了如下比对序列的同一性百分比和NCBI登录号：XP_001827551(SEQ ID  NO：45)、XP_002148277(SEQ ID NO：46)、XP_002152231(SEQ ID NO：47) 以及XP_002384772(SEQ ID NO：48)。使用程序MEGA5将比对序列用于 制备系统发生树。图15示出来Ate CA1及其同源物的系统发生树。

表3G-1：Ate CA1和类似序列所共有的同一性百分比

实例4

A.始旋链霉菌碳酸酐酶1(Spr CA1)的序列

始旋链霉菌购自ATCC(ATCC编号25486)，并且如Kieser等人， Practical Streptomyces Genetics(《实用链霉菌遗传学》)，英国诺维奇市 的约翰英纳斯基金会(2000)中所述分离基因组DNA。Spr CA1基因的核酸 序列(NCBI参考序列P_06907409.1)以及由Spr CA1基因编码的假想蛋白 的氨基酸序列可见于NCBI数据库中(NCBI登录号为ZP_06907409.1)。

B.始旋链霉菌碳酸酐酶1(Spr CA1)的表达

Spr CA1基因通过基因组注释鉴定并通过PCR从始旋链霉菌的基因组 DNA扩增。引物是基于公用数据库中的Spr CA1基因序列进行设计的。所 用引物为：SprCA1-Fw5′-AGCGCTAGCC GGCCCCCCGG CACAGGCCTC  CCCCGGTCCC GCGACGGCCC-3′(SEQ ID NO：49)和SprCA1-RV5′- TCCGGATCCT TATCAGGCGA CGGTGTGCACCAGC-3′(SEQ ID NO： 50)。

将所得的成熟Spr CA1DNA的PCR片段用NheI和BamHI消化并连接 进pKB128载体中，然后用相同限制酶消化以获得表达质粒pJG187(图 16)。pKB128质粒是pKB105质粒的衍生物(如美国专利申请公开No. 2006／0154843中所述)并且是A4启动子-CelA信号序列的来源。遵循制造 商的方案将连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(英杰公 司)。将转化的细胞涂布接种于补充有50ppm氨苄青霉素的Luria琼脂板 上并且在37℃下温育过夜。从平板挑取三个转化株并接种进补充有50ppm 氨苄青霉素的5mL Luria肉汤中。将培养物在37℃下培养过夜，提取质粒 DNA并通过DNA测序确定Spr CA1基因的正确序列。然后将pJG187质粒 用于转化变铅青链霉菌TK23衍生的原生质体(如美国专利申请公开No. 2006／0154843中所述)。所用转化技术描述于Kieser等人，Practical  Streptomyces Genetics(《实用链霉菌遗传学》)，英国诺维奇市的约翰英 纳斯基金会(The John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom)(2000) 中。将转化的细胞涂布接种于R5选择板上并在30℃下温育3天。在28℃ 下将来自链霉菌转化板的一个克隆接种在摇瓶中的TSG培养基中3天。然 后将培养物转移至链霉菌2改性培养基(如美国专利申请公开No. 2006／0154843中所述)并在28℃下再温育4天。

TSG培养基：16g BD Difco胰蛋白胨、4g BD细菌用大豆蛋白胨、20g  Sigma酪蛋白(水解产物)以及10g磷酸氢二钾，补足至1L。高压灭菌 后，加入50％葡萄糖至终浓度为1.5％。

用如下制备R5板：添加206g蔗糖、0.5g K2SO4、20.24g MgCl2、20g 葡萄糖、0.2g Difco酪蛋白氨基酸、10g Difco酵母提取物、11.46g TES、4g  L-Asp、4mL痕量元素、44g Difco琼脂、20mL5％K2HPO4、8mL5M  CaCl2·2H2O和14mL1N NaOH至在高压灭菌后终体积为1L。20小时后， 将一层硫链丝菌素(50μg／mL终浓度)涂布接种于板的顶部。

质粒pJG187(A4-celA-SprCA1)的Spr CA1基因的核苷酸序列以SEQ  ID NO：51示出：

TCCCCCGGTCCCGCGACGGCCCGCCGCCCCCGGCCGGGCACTCCCGCG CAGGCCCTGCGCGAGCTGGCGGCCGGCAACCGCCGCTGGCGCACCTT CCGGCAGCAGCATCCGCACGAGAACTCGGCCGTGCGCGAGGAACTGA TATCCGGTCAGGAACCCTTCGCCGTGGTCCTCGGCTGCATCGACTCGC GGGTGCCGCCGGAACTGGTCTTCGATCAGGGCCTCGGCGACCTGATG ACCGTGCGCTCCGCCGGTGAGGTGCTCGACGAGGCGGTCCTCGGCAG CGTCGCGTACGGGGTACTGGAGCTGGACATCCCCCTGGTCATGGTGCT CGGTCACCAGTCCTGCGGAGCGGTGACGGCGGCGGTGCACGCGGAGG AGACCGGCGAGGAACTCCCCGCCCACATCCAGTACATCGCCGACCGC ATACGGCCGGCCATAGACCACTCCCAGGAGGGCGCGGCGCGCGTCGA CTCCACGATCACCCGCAATGTCCAGATGGTCACGCGGCTCCTCGCGCA GGAGCCCGACCTCGCGGCGAGGATCGCGGCCGGGAAGCTCGCGGTCG TCGGCGCACGCTACGAACTGAGCTCGCAGCTGGTGCACACCGTCGCCT GA

Spr CA1前体的氨基酸序列以SEQ ID NO：52示出。预测的天然信号 肽以斜体字显示。

MKNTPRTNSSVGGSRRTLLRAAVAGGALASGGLVWAGTPASASPGPATARRP RPGTPAQALRELAAGNRRWRTFRQQHPHENSAVREELISGQEPFAVVLG CIDSRVPPELVFDQGLGDLMTVRSAGEVLDEAVLGSVAYGVLELDIPLV MVLGHQSCGAVTAAVHAEETGEELPAHIQYIADRIRPAIDHSQEGAARVD STITRNVQMVTRLLAQEPDLAARIAAGKLAVVGARYELSSQLVHTVA

成熟形式的Spr CA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：53示出：

SPGPATARRPRPGTPAQALRELAAGNRRWRTFRQQHPHENSAVREELISG QEPFAVVLGCIDSRVPPELVFDQGLGDLMTVRSAGEVLDEAVLGSVAYG VLELDIPLVMVLGHQSCGAVTAAVHAEETGEELPAHIQYIADRIRPAIDHS QEGAARVDSTITRNVQMVTRLLAQEPDLAARIAAGKLAVVGARYELSSQ LVHTVA

Spr CA1的蛋白质纯化

在标准条件下在摇瓶中培养表达Spr CA1蛋白的变铅青链霉菌细胞。 使用用20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)、1M硫酸铵平衡的苯基琼脂糖凝胶 柱(用Milli-Q水从其中洗脱出该蛋白)从发酵液纯化Spr CA1蛋白。将纯 化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装置浓缩并且将浓缩的蛋白 质级分用于进一步的研究。

C.Spr CA1的碳酸酐酶活性

在冰上于含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25 ℃)中测量纯化的Spr CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含 有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)添加至置于 冰上的50mL聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着添加 2mL冷冻CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离 子化)。在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使 用秒表记录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复测试直至至少三次空白测 量(加有缓冲液)是在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空白，平均) 在70秒至100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准 曲线。一式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(Wilbur-Anderson或W-A单位，Wilbur和Anderson， Journal ofBiological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫克蛋白质＝(单位／毫升酶)／(毫克蛋白质／毫升酶)

使用上述方法，纯化的Spr CA1的比活性测定为2,433±412单位／毫 克。Spr CA1的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

D.Spr CA1的温度稳定性

在0.1M Tris缓冲液(pH8.5)(在25℃下用H2SO4调节)、0.1M CHES 缓冲液(pH9.5)(在25℃下用H2SO4调节)以及0.1M CAPS缓冲液(pH10.5) (在25℃下用H2SO4调节)中测定Spr CA1的温度稳定性。向缓冲液添加 Na2SO4至终浓度为25mM。在40℃和50℃的水浴中温育于20mL缓冲液中 的100ppm Spr CA1。还在室温(25℃)下温育一份样品。在不同时间点(5 分钟至72小时)，从每根管中取出0.5mL酶样品并置于冰上。如实例4C 中所述测量酶样品的比活性。一式三份地进行比活性测量。计算每一时间 点下以及每一pH值下的残余活性百分比。对于每一pH，保持在0℃的样 品在时间0时的活性定义为100％活性。Spr CA1在25℃至40℃之间在pH 8.5和pH9.5下历经27小时温育期仍保持60％以上的活性。如图17A-C中 所示，Spr CA1在酶促CO2提取通常使用的不同pH范围内并且在超生理温 度下是稳定的。

E.Spr CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

评估Spr CA1在碳酸氢盐存在下在高离子强度条件下的稳定性。在 PCR机器中，在20℃和50℃下温育Spr CA1在1M NaHCO3中的100ppm 溶液。如实例4C中所述在温育之前测量样品的比活性。在不同时间点(5 分钟至3小时)，取出100μL样品，在冰上冷却并且测量它们的比活性。 计算每一时间点的残余活性百分比。保持在冰上的样品在时间0时的活性 定义为100％活性。图18显示了Spr CA1在1M NaHCO3中的稳定性。Spr  CA1在20℃和50℃下历经2小时温育期仍保持60％以上的活性。因此， Spr CA1在酶促CO2提取所遇到的高浓度NaHCO3存在下是稳定的。

F.Spr CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量Spr CA1和牛CAII(bCAII)的超额热容曲线。关于 差示扫描量热法(DSC)测量的标准程序和该技术的理论先前已有描述 (Freire，Methods Mol Biol，(《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。 研究大约500μL的0.5mg／mL的每一种酶。在35-100℃温度范围内扫描蛋 白质。然后再次扫描相同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆 性。在如下缓冲液中研究蛋白质：(1)0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES， pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH10.5，以及(4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaCl。 将200℃／小时的扫描速率用于使可能由聚集引起的任何假象减至最少。使 用DSC曲线的表观热中点[Tm(app)]作为热稳定性的指标。

G.同源性鉴定

对Spr CA1成熟蛋白质序列(216个残基)进行BLASTP搜索，并选 择前八个蛋白质序列用于序列比对(Vector NTI，英杰公司)。图19显示 了Spr CA1与类似碳酸酐酶序列的比对。表4G-1显示了如下比对序列的同 一性百分比和NCBI登录号：YP_003487983(SEQ ID NO：54)、 ZP_04697556(SEQ ID NO：55)、ZP_04996739(SEQ ID NO：56)、 ZP_05006186(SEQ ID NO：57)、ZP_06588467(SEQ ID NO：58)、 ZP_06769567(SEQ ID NO：59)、ZP_07290742(SEQ ID NO：60)以及 ZP_07308563(SEQ ID NO：61)。使用程序MEGA5(参见Tamura K.等人， Molecular Biology and Evolution(《分子生物学与进化》)(2011，待出 版)，将比对序列用于制备系统发生树。图20示出了Spr CA1及其同源物 的系统发生树。

表4G-1：Spr CA1和类似序列所共有的同一性百分比

实例5

A.粘琼脂芽孢杆菌碳酸酐酶Bag CA1的克隆

选择粘琼脂芽孢杆菌菌株作为可用于工业应用的多种酶的潜在来源。 使用Illumina的新一代测序技术对粘琼脂芽孢杆菌菌株的整个基因组进行 测序。通过首先在37℃下在心浸液琼脂板(Difco)上培养粘琼脂芽孢杆菌24 小时来获得用于测序的基因组DNA。从板上刮取细胞物质并用于用来自天 漠公司(Zymo)的ZF真菌／细菌DNA小量提取试剂盒(目录号为D6005)制 备基因组DNA。将该基因组DNA用于基因组测序并扩增Bag CA1基因用 于表达克隆。由BaseClear(荷兰莱顿(Leiden，The Netherlands))进行基因 组测序和序列数据的组装。由BioXpr(比利时那慕尔(Namur，Belgium)) 注释重叠群(Contigs)。在粘琼脂芽孢杆菌中以该方式鉴定的基因其中一个 编码与多种生物体的碳酸酐酶显示同源性的碳酸酐酶。该基因(称为 BagCA1基因)的序列以SEQ ID NO：62描述。由Bag CA1基因编码的蛋白 质以SEQ ID NO：63描述。该基因具有替代性起始密码子(GTG)。在N 端，该蛋白质具有长度为39个氨基酸的信号肽，如通过SignalP-NN所预 测的(Emanuelsson等人，Nature Protocols(《自然实验手册》)，2：953- 971，2007)。信号序列的存在表明BagCA1是分泌性酶。

从粘琼脂芽孢杆菌分离的Bag CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO： 62示出。编码预测的天然信号肽的序列以斜体字显示：

GTGAAAAATGACGTCATGAAAGAAGGAACAAACATGAAAAGAAGAGTAGGG TGGGGAAGC

GTTGTAGTCGTTTTAGTGTCAAGTGTCGTCATAACGGCCTGTTCTACAGCG CAATCAGGA

GACGAAGAAGTTAACTCATTAAATGGCAGTGGCACTCATGAAGAGGC AATAAAAGACGAA

CATGAGGGGCATTGGTCATATACTGGAGAAACTGGACCGACGCATTG GGGATCGTTAGAC

GCCTCTTATGAATTATGTGAACAAGAGCAGGAACAATCGCCGATCAA CATTGAGACAGAT

GAGGTGACAACTACTGATACTCATATCAGCATCGCGTATCAACCGAGC CCGTTTGCGATC

GAAAATAACGGTCATACGATTCAAGCCAATGCCCTAACAGAGGATAA TACTATCTCGATA

GAGGGTGAGAATTATCAATTAATTCAATTTCACTTCCATGTCCCTTCTG AACATCAAAAA

AATGGAGAACACTTAGACATGGAGCTTCATTTTGTCCATCAAAATCAA GAGGGGGAGTTG

GCAGTGCTGGGTGTCCTAATGGAAGAAGGGGAGGTGAACGACGCATT AGCAGAGCTATGG

GCTGAAATGCCACAAGAAGAGATGGATGAAACGATTGAATTAACGGA TGCTATCGATCTT

AACGCATTATTGCCAAGCAGCCATGAAGGCTTTCATTATGGTGGTTCT CTTACAACGCCT

CCTTGTACTGAAGGTGTAAAATGGGTCGTCCTCGAAAAAACAATTTCC GTCTCGCAAGAA

CAAATTGACACATTCGCAGAGATCTTTCCAACCAATAATCGGCCTGTC CAACCGTGGAAT

GACCGGCATGTATATGAAGTGGCTATTGAT

Bag CA1前体蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO：63示出。预测的天然 信号肽以斜体字显示。

VKNDVMKEGTNMKRRVGWGSVVVVLVSSVVITACSTAQSGDEEVNSLNGSG THEEAIKDE

HEGHWSYTGETGPTHWGSLDASYELCEQEQEQSPINIETDEVTTTDTHISI AYQPSPFAI

ENNGHTIQANALTEDNTISIEGENYQLIQFHFHVPSEHQKNGEHLDMELHF VHQNQEGEL

AVLGVLMEEGEVNDALAELWAEMPQEEMDETIELTDAIDLNALLPSSHE GFHYGGSLTTP

PCTEGVKWVVLEKTISVSQEQIDTFAEIFPTNNRPVQPVNDRHVYEVAID

成熟形式的BagCA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：64示出：

GDEEVNSLNGSGTHEEAIKDEHEGHWSYTGETGPTHWGSLDASYELCEQ EQEQSPINIET

DEVTTTDTHISIAYQPSPFAIENNGHTIQANALTEDNTISIEGENYQLIQFHF HVPSEHQ

KNGEHLDMELHFVHQNQEGELAVLGVLMEEGEVNDALAELWAEMPQE EMDETIELTDAID

LNALLPSSHEGFHYGGSLTTPPCTEGVKWVVLEKTISVSQEQIDTFAEIFPT NNRPVQPW

NDRHVYEVAID

B.粘琼脂芽孢杆菌碳酸酐酶(Bag CA1)的表达

通过PCR从粘琼脂芽孢杆菌的基因组DNA扩增Bag CA1基因。根据 制造商的说明使用热循环仪用KOD-plus聚合酶(TOYOBA)进行PCR(退 火温度为59℃)。所用引物为：Bag CA1-Fw5’-GCG GCTAGC GCA  GGAGACGAAGAAGTTAACTCAT-3’(SEQ ID NO：65)和Bag CA1-Rv5’- TCA tta ATCAATAGCCACTTCATATACATG-3’(SEQ ID NO：66)。

将所得的成熟Bag CA1DNA的PCR片段用NheI(来自KOD-plus的 产物是平端)消化并用T4DNA连接酶连接进用NheI和HpaI(平端)消 化的pHPLT02载体(50ng／μL)中，以获得表达质粒pHPLT02-Bag CA1(图 21)。连接所用的反应条件是依据供应商(马萨诸塞州的纽英伦生物技术 公司)的说明。pHPLT02载体含有热稳定性淀粉酶LAT启动子(pLAT)和 来自地衣芽孢杆菌菌株DSM13的信号肽(SEQ ID NO：73)用于表达Bag  CA1。该载体可在枯草芽孢杆菌中复制。使用滚环试剂盒(新泽西州的通 用电气医疗集团生命科学部门)扩增该连接混合物并用扩增的连接混合物 转化枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr， ΔispA，Δbpr)。将转化的细胞涂布接种于补充有10ppm卡那霉素的Luria琼 脂板上。获得约50-100个菌落，挑取其中24个并在24孔板中培养。通过 DNA测序来确定Bag CA1基因的序列。将来自24孔板的所选克隆在7L发 酵罐中进一步培养。

质粒pHPLT02-Bag CA1中的Bag CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID  NO：67示出。信号序列以斜体字显示：

ATGGTCTTTAAAAAACCGAAAGTCTTTATCGCAGCGGTCATCCTGGCGCTG AGCAGCTTT

GCGGGAACGGCAGCTAGCGCAGGAGACGAAGAAGTTAACTCATTAAAT GGCAGTGGCACT

CATGAAGAGGCAATAAAAGACGAACATGAGGGGCATTGGTCATATAC TGGAGAAACTGGA

CCGACGCATTGGGGATCGTTAGACGCCTCTTATGAATTATGTGAACAA GAGCAGGAACAA

TCGCCGATCAACATTGAGACAGATGAGGTGACAACTACTGATACTCAT ATCAGCATCGCG

TATCAACCGAGCCCGTTTGCGATCGAAAATAACGGTCATACGATTCAA GCCAATGCCCTA

ACAGAGGATAATACTATCTCGATAGAGGGTGAGAATTATCAATTAATT CAATTTCACTTC

CATGTCCCTTCTGAACATCAAAAAAATGGAGAACACTTAGACATGGA GCTTCATTTTGTC

CATCAAAATCAAGAGGGGGAGTTGGCAGTGCTGGGTGTCCTAATGGA AGAAGGGGAGGTG

AACGACGCATTAGCAGAGCTATGGGCTGAAATGCCACAAGAAGAGAT GGATGAAACGATT

GAATTAACGGATGCTATCGATCTTAACGCATTATTGCCAAGCAGCCAT GAAGGCTTTCAT

TATGGTGGTTCTCTTACAACGCCTCCTTGTACTGAAGGTGTAAAATGG GTCGTCCTCGAA

AAAACAATTTCCGTCTCGCAAGAACAAATTGACACATTCGCAGAGAT CTTTCCAACCAAT

AATCGGCCTGTCCAACCGTGGAATGACCGGCATGTATATGAAGTGGCT ATTGAT

从质粒pHPLT02-Bag CA1表达的Bag CA1前体蛋白的氨基酸序列以 SEQ ID NO：68示出。信号序列以斜体字显示：

MVFKKPKVFIAAVILALSSFAGTAASAGDEEVNSLNGSGTHEEAIKDEHEGH WSYTGETGPTHWGSLDASYELCEQEQEQSPINIETDEVTTTDTHISIAYQP SPFAIENNGHTIQANALTEDNTISIEGENYQLIQFHFHVPSEHQKNGEHLD MELHFVHQNQEGELAVLGVLMEEGEVNDALAELWAEMPQEEMDETIEL TDAIDLNALLPSSHEGFHYGGSLTTPPCTEGVKWVVLEKTISVSQEQIDTF AEIFPTNNRPVQPWNDRHVYEVAID

将来自地衣芽孢杆菌的若干种信号序列用于表达Bag CA1。这些序列 列于表5B-1中。

表5B-1：用于表达Bag CA1的信号序列

SEQ ID 信号序列(SS) 69 MKMWMRKALVALFTIATFGLVSPPAAASA 70 MNIKNIAKKASALTVAAALLAGGAPQASA 71 MKRKLMTLGLTAVLG S SAVLIPLKSNHASA 72 MKQQKRLYARLLPLLFALIFLLPHSAASA 73 MVFKKPKVFIAAVILALS SFAGTAASA

Bag CA1的蛋白质纯化

使用两个色谱柱从来自7L发酵罐操作的浓缩发酵液纯化Bag CA1蛋 白。1)用20mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶 柱，使用平衡／洗涤缓冲液至含有0.5M NaCl的20mM Tris-HCl(pH7.0)缓 冲液的线性梯度从其中洗脱出该蛋白。2)用含有1M硫酸铵的20mM磷酸 钠(pH6.0)平衡的苯基琼脂糖凝胶柱，以空隙体积从其中洗脱出该蛋白。将 纯化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装置浓缩并且将浓缩的蛋 白质级分用于进一步的研究。

C.Bag CA1的碳酸酐酶活性

在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)中 测量纯化的Bag CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含有 20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3)添加至置于冰上的50mL 聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着加入2mL冷冻 CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离子化)。 在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使用秒表记 录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复试验直到至少三次空白测量(加有 缓冲液)在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空白，平均)在70-100秒 之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准曲线。一式三份 地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(一Wilbur-Anderson(W-A)单位，Wilbur和Anderson， Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫升蛋白质＝单位／毫升酶／毫克蛋白质／毫升酶

使用上述方法，纯化的Bag CA1的比活性测定为3715±274单位／毫 克。Bag CA1的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

D.Bag CA1的温度稳定性

在0.05M Tris缓冲液(pH8.5)(用H2SO4调节)、0.05M CHES缓冲液 (pH9.5)(用H2SO4调节)以及0.05M CAPS缓冲液(pH10.5)(用H2SO4调 节)中测定Bag CA1的温度稳定性。向缓冲液添加终浓度为1mg／mL的 BSA以及最终浓度为25mM的Na2SO4。在40℃和50℃的水浴中温育稀释 于1M NaHCO3中的一百(100)ppm Bag CA1。还在室温(25℃)下以及在冰(0 ℃)上各温育一份样品。在不同时间点(5分钟至24小时)，从每根管中 取出0.1mL酶样品并置于冰上。如实例5C中所述测量酶样品的比活性。 计算每一时间点下、每一pH值下的残余活性百分比。对于每一pH，保持 在0℃的样品在时间0时的活性定义为100％活性。如图22A-C中所示， Bag CA1在25℃下经历24小时温育期对于所测试的所有pH范围都保持 90％以上的活性。在较高pH水平下，例如在pH9.5下，在50℃下温育约 2小时后，该酶几乎失去它全部的碳酸酐酶活性。另一方面，可以看到 Bag CA1在宽泛pH范围内适宜地稳定以允许其用于典型的酶促CO2提取 操作中以及在超生理温度下使用。

E.Bag CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

在1M NaHCO3存在下在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲 液(pH8.3)中测量Bag CA1的稳定性。在PCR机器中在20℃和50℃下温育 稀释于1M NaHCO3中的一百(100)ppm Bag CA1。如实例5C中所述在温育 之前测量样品的比活性。在不同时间点(5分钟至3小时)，取出100μL 样品，在冰上冷却并如实例5C中所述测量它们的比活性。计算每一时间 点的残余活性百分比。保持在冰上的样品在时间0时的活性定义为100％ 活性。图23显示了Bag CA1在1M NaHCO3中的稳定性。Bag CA1在20℃ 下历经3小时温育期仍保持大部分活性。然而，当在50℃下温育时，观测 到稍微更迅速的活性降低，在该温度下温育3小时后保留约45％的初始活 性。

F.Bag CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量Bag CA1和牛碳酸酐酶II(bCA II)的超额热容曲 线。关于DSC测量的标准程序和该技术的理论先前已有描述(Freire， Differential Scanning Calorimetry(差示扫描量热法)，Methods Mol Biol (《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。研究大约500tL的每种酶 的0.5mg／mL样品。在35-100℃温度范围内扫描蛋白质。然后再次扫描相 同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆性。对于所研究的两种碳 酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓冲液中研究蛋白质：(1)0.1M Tris， pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH10.5，以及(4)0.1M  CHES，pH9.5+2M NaCl。将200℃／小时的扫描速率用于使可能由聚集引 起的任何假象减至最少。使用DSC曲线的表观热中点[Tm(app)]作为这些碳 酸酐酶分子的热稳定性和解链点(melting point)的指标。两种酶在各种缓冲 液中的解链点示于表5F-1中。

两种碳酸酐酶多肽在热去折叠期间的Tm(app)值在8.5至10.5的范围内 显示pH依赖性。牛碳酸酐酶II在pH8.5至pH9.5之间具有最高值，而 Bag CA1在pH8.5下具有最高值。含2M NaCl的0.1M CHES(pH9.5)缓冲 液使牛CA II的Tm(app)降低，但使Bag CA1的Tm(app)升高。对于Bag  CA1，还观测到包含碳酸盐缓冲液使Tm(app)显著升高，并且含2M NaCl 的0.1M CHES(pH9.5)使Tm升高大约16℃。此外，已经观测到碳酸酐酶 多肽在较高离子强度条件下具有升高的解链温度，这是令人惊讶的。因 此，Bag CA1十分适于在较高温度下的酶促CO2提取，因为该酶的Tm在碳 酸盐溶液中以及在酶促CO2提取典型的高离子强度条件下升高。

还测定了bCAII和Bag CA1在1M KHCO3中在存在和不存在1M  NaCl情况下的Tm(app)(表5F-2)。

表5F-1.Bag CA1知bCAII的解链温度

表5F-2：Bag CA1在1M KHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) bCA II Bag CA1 0 62.1 70.3 1 62.7 80.1

G.同源性鉴定

对Bag CA1成熟蛋白质序列(251个残基)进行BLASTP搜索，并选 择前十个蛋白质序列用于序列比对(Vector NTI，英杰公司)。表5G-1显 示了如下比对序列的同一性百分比和GENBANK登录号：NP_241226 (SEQ ID NO：16)、YP_004645315(SEQ ID NO：74)、ZP_04248491(SEQ ID  NO：25)、YP_003428428(SEQ ID NO：19)、ZP_04209878(SEQ ID NO：24)、 BAK17997(SEQ ID NO：75)、YP_176677(SEQ ID NO：22)、YP_419944 (SEQ ID NO：35)、ZP_08403178(SEQ ID NO：76)和YP_003944556(SEQ ID  NO：21)。利用程序MEGA5将比对序列用于制备系统发生树(图24)。在 图25示出了Bag CA1及其同源物的系统发生树。

表5G-1.Bag CA1和类似序列所共有的同一性百公比

实例6

A.弧菌属物种AND4碳酸酐酶1(Vsp CA1)的鉴定和表达

通过Generay(上海捷瑞生物工程有限公司(Shanghai Generay Biotech  Co.，Ltd))合成编码来自弧菌属物种AND4的碳酸酐酶(Vsp CA1)的基因 (如通过BLAST分析所测定的)。Vsp CA1基因的核酸序列测定为在位置 66128至66847(弧菌属物种AND41103602000595，全基因组鸟枪序列， NCBI参考序列NZ_ABGR01000001.1)并且由Vsp CA1基因编码的蛋白质 的氨基酸序列可见于NCBI数据库中(NCBI登录号为ZP_02194066， (／locus_tag＝“AND4_05779”))。

所合成的Vsp CA11基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：77示出：

GCAAACTGGGGATACAAAGGCGATCATGGCCCGGAAAATTGGGGCGA ATTTGCATCAGAATGCGCAAAAGGCCAAAACCAAAGCCCGATTGATA TCCAGTCAGTTACGGAGGCAAAACTGGATAAACTGAATTTCGATTATG AAGGCAAAGTTATTAGCCTGCTGAATAACGGCCATACACTGCAAACG AAACTGGAAGGCAAAAATACGCTGATGGTTGATGGCACAGAATTCAC ACTGAAACAGTTTCATTTTCATACGCCGTCAGAAAATCATGTCAACGG CAAAGAGTATCCGCTGGAAGCACATTTTGTGCATGCAGACAAAGCAG GCCATCTGGCAGTTGTTGCAGTTTTCTTTAAACTTGGCGGCGAAAATC CGGAACTGGCGAAACTGCTGGCAAATATCCCGAAAAAAGATCAAGTT GTGGCAATTAAAGTTCCGTTTGATGCAGATAGCCTTCTGCCGAACAAT AAAGATTATTATAGATTCGACGGCAGCCTGACAACGCCGCCGTGCAG CGAAGGCGTTAGATGGCTGGTTATCAAAGAAACGCAGACAATCAGCC CGGAACAAGTTACAGCATTCACGAAAGCAATGGGCCATAATAACAGA CCGATTCAGCCGCTTAATTCAAGAATGATTAGAACACTTCAA

将Vsp CA1基因用NheI和HpaI消化并用T4DNA连接酶连接进用相 同限制酶消化的pHPLT02载体(50ng／μL)中以获得表达质粒pHPLT02-Vsp  CA1(图26)。连接所用的反应条件是依据供应商(马萨诸塞州的纽英伦 生物技术公司)的说明。pHPLT02载体含有热稳定性淀粉酶LAT启动子 (pLAT)和来自地衣芽孢杆菌菌株DSMl3的信号肽(SEQ ID NO：83)用于表 达Vsp CA1。该载体可在枯草芽孢杆菌中复制。使用滚环试剂盒(新泽西 州的通用电气医疗集团生命科学部门)扩增该连接混合物并用扩增的连接 混合物转化枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA， Δmpr，ΔispA，Δbpr)。将转化的细胞涂布接种于补充有10ppm卡那霉素的 Luria琼脂板上。获得约50-100个菌落，挑取其中24个并在24孔板中培 养。通过DNA测序来确定Vsp CA1基因的序列。将来自24孔板的所选克 隆在7L发酵罐中进一步培养。

质粒pHPLT02-Vsp CA1的Vsp CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO： 78示出。信号序列呈斜体字形式：

ATGCTGATCAACAAAAGCAAAAAATTTTTCGTCTTTAGCTTTATCTTTGTCAT GATGCTGAGCCTGAGCTTTGTCAACGGCGAAGTCGCTAGCGCAGCAAACT GGGGATACAAAGGCGATCATGGCCCGGAAAATTGGGGCGAATTTGCA TCAGAATGCGCAAAAGGCCAAAACCAAAGCCCGATTGATATCCAGTC AGTTACGGAGGCAAAACTGGATAAACTGAATTTCGATTATGAAGGCA AAGTTATTAGCCTGCTGAATAACGGCCATACACTGCAAACGAAACTG GAAGGCAAAAATACGCTGATGGTTGATGGCACAGAATTCACACTGAA ACAGTTTCATTTTCATACGCCGTCAGAAAATCATGTCAACGGCAAAGA GTATCCGCTGGAAGCACATTTTGTGCATGCAGACAAAGCAGGCCATCT GGCAGTTGTTGCAGTTTTCTTTAAACTTGGCGGCGAAAATCCGGAACT GGCGAAACTGCTGGCAAATATCCCGAAAAAAGATCAAGTTGTGGCAA TTAAAGTTCCGTTTGATGCAGATAGCCTTCTGCCGAACAATAAAGATT ATTATAGATTCGACGGCAGCCTGACAACGCCGCCGTGCAGCGAAGGC GTTAGATGGCTGGTTATCAAAGAAACGCAGACAATCAGCCCGGAACA AGTTACAGCATTCACGAAAGCAATGGGCCATAATAACAGACCGATTC AGCCGCTTAATTCAAGAATGATTAGAACACTTCAA

从质粒pHPLT02-Vsp CA1表达的Vsp CA1前体蛋白的氨基酸序列以 SEQ ID NO：79示出。信号序列呈斜体字形式：

MLINKSKKFFVFSFIFVMMLSLSFVNGEVASAANWGYKGDHGPENWGEFAS ECAKGQNQSPIDIQSVTEAKLDKLNFDYEGKVISLLNNGHTLQTKLEGKN TLMVDGTEFTLKQFHFHTPSENHVNGKEYPLEAHFVHADKAGHLAVVA VFFKLGGENPELAKLLANIPKKDQVVAIKVPFDADSLLPNNKDYYRFDGS LTTPPCSEGVRWLVIKETQTISPEQVTAFTKAMGHNNRPIQPLNSRMIRTL Q

成熟形式的Vsp CA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：80示出：

ANWGYKGDHGPENWGEFASECAKGQNQSPIDIQSVTEAKLDKLNFDYE GKVISLLNNGHTLQTKLEGKNTLMVDGTEFTLKQFHFHTPSENHVNGKE YPLEAHFVHADKAGHLAVVAVFFKLGGENPELAKLLANIPKKDQVVAIK VPFDADSLLPNNKDYYRFDGSLTTPPCSEGVRWLVIKETQTISPEQVTAFT KAMGHNNRPIQPLNSRMIRTLQ

将来自地衣芽孢杆菌的若干种信号序列用于表达Vsp CA1。这些序列 列于表6A-1中。

表6A-1：用于表达Vsp CA1的信号序列

SEQ ID 信号序列(SS) NO：81 MKKKPLFRTFMCAALIGSLLAPVAASA NO：82 MKNVLAVFVVLIFVLGAFGTSGPASA NO：83 MLINKSKKFFVFSFIFVMMLSLSFVNGEVASA

Vsp CA1的蛋白质纯化

使用三个色谱柱从来自7L发酵罐操作的浓缩发酵液纯化Vsp CA1蛋 白。1)用20mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶 柱，以空隙体积从其中洗脱出该蛋白。2)用含有1M硫酸铵的20mM磷酸 钠(pH6.0)平衡的苯基琼脂糖凝胶柱，使用平衡／洗涤缓冲液至20mM磷酸 钠(pH6.0)的线性梯度从其中洗脱出该蛋白。3)Superdex75凝胶过滤柱， 使用含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)从其中洗脱出该蛋白。将纯 化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装置浓缩并且将浓缩的蛋白 质级分用于进一步的研究。

B.Vsp CA1的碳酸酐酶活性

在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)中 测量纯化的Vsp CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含有 20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3)添加至置于冰上的50mL 聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着加入2mL冷冻 CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离子化)。 在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使用秒表记 录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复试验直到至少三次空白测量(加有 缓冲液)在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空自，平均)在70秒至 100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准曲线。一 式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(一Wilbur-Anderson(W-A)单位，Wilbur和Anderson， Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫升蛋白质＝单位／毫升酶／毫克蛋白质／毫升酶

使用上述方法，纯化的Vsp CA1的比活性测定为10028±551单位／毫 克。Vsp CA1的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

C.VspCA1的温度稳定性

在0.05M Tris缓冲液(pH8.5)(用H2SO4调节)、0.05M CHES缓冲液 (pH9.5)(用H2SO4调节)以及0.05M CAPS缓冲液(pH10.5)(用H2SO4调 节)中测定Vsp CA1的温度稳定性。向缓冲液添加终浓度为1mg／mL的 BSA以及最终浓度为25mM的Na2SO4。在PCR机器中在25℃、40℃和50 ℃下温育稀释于1M NaHCO3中的100ppm Vsp CA1。如实例6B中所述在 温育之前测量样品的比活性。在不同时间点(5分钟至24小时)，取出 100μL样品，在冰上冷却并且如实例6B中所述测量它们的比活性。计算 每一时间点下、每一pH值下的残余活性百分比。对于每一pH，保持在0 ℃的样品在时间0时的活性定义为100％活性。如图27A-C中所示，Vsp  CA1在25℃下历经24小时温育期对于pH8.5和pH9.5仍保留50％以上的 活性。在40℃和50℃温育时，显示活性随着pH增加更剧烈地降低。在50 ℃下，Vsp CA1在pH8.5下4小时内完全失去其活性。

D.Vsp CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

在1M NaHCO3存在下在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲 液(pH8.3)中测量Vsp CA1的稳定性。将一百(100)ppm的该蛋白质稀释于 1M NaHCO3中并在PCR机器中于20℃和50℃下温育。如实例6B中所述 在温育之前测量样品的比活性。在不同时间点(5分钟至3小时)，取出 100μL样品，在冰上冷却并如实例6B中所述测量它们的比活性。计算每 一时间点的残余活性百分比。保持在冰上的样品在时间0时的活性定义为 100％活性。图28显示了Vsp CA1在1M NaHCO3中的稳定性。Vsp CA1在 20℃下历经1至3小时温育期保持50％活性。在50℃下，活性损失更迅 速，但即使在该高温下，该酶在约30分钟后仍保持至少50％的活性。

E.Vsp CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量Vsp CA1和牛碳酸酐酶II(bCA II)的超额热容曲 线。关于DSC测量的标准程序和该技术的理论先前已有描述(Freire， Differential Scanning Calorimetry(差示扫描量热法)，Methods Mol Biol (《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。研究大约500μL的每种酶 的0.5mg／mL样品。在35-100℃温度范围内扫描蛋白质。然后再次扫描相 同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆性。对于所研究的Vsp  CA1碳酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓冲液中研究蛋白质：(1) 0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH10.5，以及 (4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaCl。将200℃／小时的扫描速率用于使可能由 聚集引起的任何假象减至最少。使用DSC曲线的表观热中点[Tm(app)]作为 这些碳酸酐酶分子的热稳定性和解链点(melting point)的指标。两种酶在各 种缓冲液中的解链点示于表6E-1中。

Vsp CA1碳酸酐酶蛋白在热去折叠期间的Tm(app)值在8.5至10.5的范 围内显示pH依赖性。与bCAII类似，Vsp CA1在pH8.5至pH9.5之间显 示最高值。含2M NaCl的0.1M CHES(pH9.5)缓冲液使牛CA II的Tm(app) 降低，但不影响Vsp CA1的Tm(app)。碳酸盐缓冲液降低了Vsp CA1的 Tm(app)。

还测定了bCAII和Vsp CA1在1M KHCO3中在存在和不存在1M NaCl 情况下的Tm(app)(表6E-2)。令人惊讶地注意到，随着离子强度增大， Vsp CA1的Tm(app)升高。

表6E-1.Vsp CA1知bCAII的解链温度

表6E-2：VspCA1在1MKHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) bCA II Vsp CA1 0 62.1 68.5 1 62.7 72.7

F.同源性鉴定

对Vsp CA1成熟蛋白质序列(219个残基)进行BLASTP搜索，并选 择所得到的43个蛋白质序列用于序列比对(Vector NTI，英杰公司)以及 系统发生树生成(不包括彼此具有99％-100％同一性的蛋白质序列)。表 6F-1显示了比对序列的同一性百分比和NCBI登录号。利用程序MEGA5 将比对序列用于制备系统发生树。图29示出了Vsp CA1及其同源物的系 统发生树。

表6F-1：Vsp CA1和类似序列所共有的同一性百分比

实例7

A.弧菌属物种Ex25碳酸酐酶1(VspE CA1)的鉴定和表达

通过BLAST分析，来自弧菌属物种Ex25的推定碳酸酐酶(VspE CA1) 的氨基酸序列可见于NCBI数据库中(NCBI登录号为ZP_04922188， ／locus_tag＝“VEx25_A1217”)。发现来自弧菌属物种Ex25 scf_1101759099903基因组支架(genomic scaffoId)的VspE CA1基因的核酸 序列，即全基因组鸟枪序列(NCBI参考序列：NZ_DS267817.1)的位置为 79099至79818。通过Generay(上海捷瑞生物工程有限公司)合成编码来 自弧菌属物种Ex25的VspE CA1的基因。

所合成的VspE CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：127示出：

GCATCATGGGGCTATGAAGGCTCACATGGCCCGGAACACTGGGGCGA ATTTGCAAGCGAA

TGCAGCAAAGGACAAAATCAGTCACCGATTAACATCGTTTCAGCAGC GGAAGCCAAACTT

GACAAACTGCAGTTCGATTACCATGGCAAGGCGATTAGCCTGCTGAA CAATGGCCATACA

CTGCAAACGTCACTGGAGGGAGATAATACGCTTCTGATCGATGGCAA TGCGTTCACGCTG

AAACAGTTCCATTTCCATACGCCGAGCGAAAACCATGTGGATGGAAA AGAGTATCCGCTG

GAAGCGCATTTCGTTCATGCAGATACAACAGGCCATCTGGCAGTCGTT GCAGTTTTCTTC

CAAAGCGGCAAAGCAAATCCTGATCTGGCGAAACTTCTTGCGAACAT TCCGAGCAAGGAT

CAGGCAGTCGAAATTAAACTGCCGTTCGAAGCGGATGCGCTGCTGCC GAAGGACAAAGCA

TATTACAGATTCAATGGCTCACTGACGACACCGCCGTGCTCAGAAGGC GTGAGATGGCTG

GTCATGAAAGAAGCACAGACGATCAGCCCTGAACAGATTAAAGCGTT CACGAAGGTCATG

GGCGAGAACAACAGACCGATCCAACCGCTTAATGCAAGAATGGTTCT GATGCAACAT

将VspE CA1基因用NheI和HpaI消化并用T4DNA连接酶连接进用相 同限制酶消化的pHPLT02载体(50ng／μL)中以获得表达质粒pHPLT02-VspE  CA1(图30)。连接所用的反应条件是依据供应商(马萨诸塞州的纽英伦 生物技术公司)的说明。pHPLT02载体含有热稳定性淀粉酶LAT启动子 (pLAT)和来自地衣芽孢杆菌菌株DSM13的信号肽(SEQ ID NO：132)用于表 达VspE CA1。该载体可在枯草芽孢杆菌中复制。使用滚环试剂盒(新泽 西州的通用电气医疗集团生命科学部门)扩增该连接混合物并用扩增的连 接混合物转化枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC， ΔWprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)。将转化的细胞涂布接种于补充有10ppm卡那 霉素的Luria琼脂板上。获得约50-100个菌落，挑取其中24个并在24孔 板中培养。通过DNA测序来确定VspE CA1基因的序列。将来自24孔板 的所选克隆在7L发酵罐中进一步培养。

质粒pHPLT02-VspE CA1的VspE CA1基因的核苷酸序列以SEQ ID  NO：128示出。信号序列以斜体字显示：

ATGAAACAACAAAAACGCCTGTATGCGAGACTGCTGCCGCTGCTGTTTGCG CTGATCTTTCTCCTGCCGCACAGCGCAGCTAGCGCAGCATCATGGGGCT ATGAAGGCTCACATGGCCCGGAACACTGGGGCGAATTTGCAAGCGAA TGCAGCAAAGGACAAAATCAGTCACCGATTAACATCGTTTCAGCAGC GGAAGCCAAACTTGACAAACTGCAGTTCGATTACCATGGCAAGGCGA TTAGCCTGCTGAACAATGGCCATACACTGCAAACGTCACTGGAGGGA GATAATACGCTTCTGATCGATGGCAATGCGTTCACGCTGAAACAGTTC CATTTCCATACGCCGAGCGAAAACCATGTGGATGGAAAAGAGTATCC GCTGGAAGCGCATTTCGTTCATGCAGATACAACAGGCCATCTGGCAGT CGTTGCAGTTTTCTTCCAAAGCGGCAAAGCAAATCCTGATCTGGCGAA ACTTCTTGCGAACATTCCGAGCAAGGATCAGGCAGTCGAAATTAAACT GCCGTTCGAAGCGGATGCGCTGCTGCCGAAGGACAAAGCATATTACA GATTCAATGGCTCACTGACGACACCGCCGTGCTCAGAAGGCGTGAGA TGGCTGGTCATGAAAGAAGCACAGACGATCAGCCCTGAACAGATTAA AGCGTTCACGAAGGTCATGGGCGAGAACAACAGACCGATCCAACCGC TTAATGCAAGAATGGTTCTGATGCAACAT

从质粒pHPLT02-VspE CA1表达的VspE CA1前体蛋白的氨基酸序列 以SEQ ID NO：129示出。信号序列以斜体字显示：

MKQQKRLYARLLPLLFALIFLLPHSAASAASWGYEGSHGPEHWGEFASECS KGQNQSPINIVSAAEAKLDKLQFDYHGKAISLLNNGHTLQTSLEGDNTLLI DGNAFTLKQFHFHTPSENHVDGKEYPLEAHFVHADTTGHLAVVAVFFQS GKANPDLAKLLANIPSKDQAVEIKLPFEADALLPKDKAYYRFNGSLTTPP CSEGVRWLVMKEAQTISPEQIKAFTKVMGENNRPIQPLNARMVLMQH

成熟形式的VspE CA1的氨基酸序列以SEQ ID NO：130示出：

ASWGYEGSHGPEHWGEFASECSKGQNQSPINIVSAAEAKLDKLQFDYHG KAISLLNNGHTLQTSLEGDNTLLIDGNAFTLKQFHFHTPSENHVDGKEYP LEAHFVHADTTGHLAVVAVFFQSGKANPDLAKLLANIPSKDQAVEIKLPF EADALLPKDKAYYRFNGSLTTPPCSEGVRWLVMKEAQTISPEQIKAFTKV MGENNRPIQPLNARMVLMQH

将来自地衣芽孢杆菌的若干种信号序列用于表达VspE CA1。这些序 列列于表7A-1中。

表7A-1：用于表达VspE CA1的信号序列

SEQ ID 信号序列(SS) 131 MKRHTVNLSLAMLVLGFLLSFSYASA 132 MKQQKRLYARLLPLLFALIFLLPHSAASA

VspECA1的蛋白质纯化

使用三个色谱柱从来自7L发酵罐操作的浓缩发酵液纯化VspE CA1蛋 白。1)用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶 柱，以空隙体积从其中洗脱出该蛋白。2)用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液 平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶柱，使用平衡／洗涤缓冲液至含有0.25M  NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)的线性梯度从其中洗脱出该蛋白。3) Superdex75凝胶过滤柱，使用含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)从 其中洗脱出该蛋白。将纯化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装 置浓缩并且将浓缩的蛋白质级分用于进一步的研究。

B.VspE CA1的碳酸酐酶活性

在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)中 测量纯化的VspE CA1的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含有 20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3)添加至置于冰上的50mL 聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着加入2mL冷冻 CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离子化)。 在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使用秒表记 录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复试验直到至少三次空白测量(加有 缓冲液)在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空白，平均)在70秒至 100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准曲线。一 式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(一Wilbur-Anderson(W-A)单位，Wilbur和Anderson， Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫升蛋白质＝单位／毫升酶／毫克蛋白质／毫升酶

使用上述方法，纯化的VspE CA1的比活性测定为4621±431单位／毫 克。VspE CA1的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

C.VspE CA1在1M NaHCO 3 中的稳定性

在1M NaHCO3存在下在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲 液(pH8.3)中测量VspE CA1的稳定性。将一百(100)ppm的该蛋白质稀释 于1M NaHCO3中并在PCR机器中于20℃和50℃下温育。如实例7B中所 述在温育之前测量样品的比活性。在不同时间点(5分钟至3小时)，取 出100μL样品，在冰上冷却并如实例7B中所述测量它们的比活性。计算 每一时间点的残余活性百分比。保持在冰上的样品在时间0时的活性定义 为100％活性。图31显示了VspE CA1在1M NaHCO3中的稳定性。VspE  CA1在25℃下历经3小时温育期仍保持大部分活性并因此将有可能超过这 个时间点仍具有很好活性。碳酸酐酶活性在高很多的温度50℃下更迅速地 降低，但即使在此高温下，大部分碳酸酐酶活性在第一小时温育期内得以 保持。

D.VspE CA1的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量VspE CA1和牛碳酸酐酶II(bCA II)的超额热容曲 线。关于DSC测量的标准程序和该技术的理论先前已有描述(Freire， Differential Scanning Calorimetry(差示扫描量热法)，Methods Mol Biol (《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。研究大约500μL的每种酶 的0.5mg／mL样品。在35-100℃温度范围内扫描蛋白质。然后再次扫描相 同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆性。对于所研究的VspE  CA1碳酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓冲液中研究蛋白质：(1) 0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH10.5，以及 (4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaCl。将200℃／小时的扫描速率用于使可能由 聚集引起的任何假象减至最少。使用DSC曲线的表观热中点[Tm(app)]作为 这些碳酸酐酶分子的热稳定性和解链点的指标。两种酶在各种缓冲液中的 解链点示于表7D-1中。

VspE CA1碳酸酐酶蛋白在热去折叠期间的Tm(app)值在8.5至10.5的 范围内显示pH依赖性。与bCAII类似，VspE CA1在pH8.5至9.5之间显 示最高值。含2M NaCl的0.1M CHES(pH9.5)缓冲液使牛CA II的Tm(app) 降低，但不影响VspE CA1的Tm(app)。碳酸盐使VspE CA1的Tm(app)显著 升高。还测定了bCAII和VspE CA1在1M KHCO3中在存在和不存在1M  NaCl情况下的Tm(app)(表7D-2)。据观察，VspE CA1在1M盐下的 Tm(app)相比于0M盐下的Tm(app)更高。

表7D-1.VspE CA1和bCAII的解链温度

表7D-2：VspE CA1在1M KHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) bCA II VspE CA1 0 62.1 49.6 1 62.7 57.9

实例8

A.弧菌属物种Ex25碳酸酐酶2(VspE CA2)的鉴定和表达

通过BLAST分析，来自弧菌属物种Ex25的另一推定碳酸酐酶(VspE  CA2)的氨基酸序列可见于NCBI数据库中(NCBI登录号为ZP_04921370， ／locus_tag＝“VEx25_A0096”)。发现来自弧菌属物种Ex25 scf_1101759099880基因组支架的VspE CA2基因的核酸序列，即全基因组 鸟枪序列(NCBI参考序列：NZ_DS267810.1)的位置为94584至95303。 通过Generay(上海捷瑞生物工程有限公司)合成编码来自弧菌属物种 Ex25的VspE CA2的基因。

所合成的VspECA2基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：133示出：

TCAGAGTGGGGCTATGGCAATGATAAACATGGCCCGGAACATTGGGG CGAAATTGCAAAGGATTGCGCGACAACGAAAAACCAATCACCGATTA ACATTGACAATCCGGCCGACGCCAAGCTGGAAGCCCTTAATCTGTCAT ATACAGGCCAGGTTATTGGCCTGACGAACAATGGCCATACACTGCAA GCTCAAGTGAACGGCAGAAACAGCTTCACAATCGATAGCGAAACGTT TGAGCTTCAGCAGTTTCACTTTCATACACCGAGCGAGAACCAGATCAA AGGCAGACAGTATCCGCTTGAAGCGCACTTTGTTCATGCAAATGCCGA CGGCGAACTGGCAGTGATTTCAGTTATGTTTGATGCAGGCGATCAGAA TGCAGCACTGAGCAAGCTGATCAATGCAATTCCGCAGGAGAACCAAA CGACGTTCTTTAAGGACACGTTTGAGATCAACGACCTGCTGCCGAAGA CGGCAAATTATTACAGATTCAACGGCTCACTGACAACGCCGCCGTGTA GCGAAGGCGTCAGATGGTTCGTTCTGAAAGACACACAAACACTGTCA AAGGACCAGGCAGCCAAACTGATGGAAGTTATGGGCCAAAATAACAG ACCGCTGCAACCGCTGAATGCGAGAGTTGTGCTTAGCAAT

将VspE CA2基因用NheI和HpaI消化并用T4DNA连接酶连接进用相 同限制酶消化的pHPLT02载体(50ng／μL)中以获得表达质粒pHPLT02-VspE CA2(图32)。连接所用的反应条件是依据供应商(马萨诸塞州的纽英伦 生物技术公司)的说明。pHPLT02载体含有热稳定性淀粉酶LAT启动子 (pLAT)和来自地衣芽孢杆菌菌株DSM13的信号肽(例如，作为SEQ ID  NO：135的一部分的信号肽)用于表达VspE CA2。该载体可在枯草芽孢杆 菌中复制。使用滚环试剂盒(新泽西州的通用电气医疗集团生命科学部 门)扩增该连接混合物并用扩增的连接混合物转化枯草芽孢杆菌细胞 (degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)。将转化 的细胞涂布接种于补充有10ppm卡那霉素的Luria琼脂板上。获得约50- 100个菌落，挑取其中24个并在24孔板中培养。通过DNA测序来确定 VspE CA2基因的序列。将来自24孔板的所选克隆在7L发酵罐中进一步培 养。

质粒pHPLT02-VspE CA2的VspECA2基因的核苷酸序列以SEQ ID  NO：134示出。信号序列以斜体字显示。

ATGGTCTTTAAAAAACCGAAAGTCTTTATCGCAGCGGTCATCCTGGCGCTG AGCAGCTTTGCGGGAACGGCAGCTAGCGCATCAGAGTGGGGCTATGGC AATGATAAACATGGCCCGGAACATTGGGGCGAAATTGCAAAGGATTG CGCGACAACGAAAAACCAATCACCGATTAACATTGACAATCCGGCCG ACGCCAAGCTGGAAGCCCTTAATCTGTCATATACAGGCCAGGTTATTG GCCTGACGAACAATGGCCATACACTGCAAGCTCAAGTGAACGGCAGA AACAGCTTCACAATCGATAGCGAAACGTTTGAGCTTCAGCAGTTTCAC TTTCATACACCGAGCGAGAACCAGATCAAAGGCAGACAGTATCCGCT TGAAGCGCACTTTGTTCATGCAAATGCCGACGGCGAACTGGCAGTGAT TTCAGTTATGTTTGATGCAGGCGATCAGAATGCAGCACTGAGCAAGCT GATCAATGCAATTCCGCAGGAGAACCAAACGACGTTCTTTAAGGACA CGTTTGAGATCAACGACCTGCTGCCGAAGACGGCAAATTATTACAGAT TCAACGGCTCACTGACAACGCCGCCGTGTAGCGAAGGCGTCAGATGG TTCGTTCTGAAAGACACACAAACACTGTCAAAGGACCAGGCAGCCAA ACTGATGGAAGTTATGGGCCAAAATAACAGACCGCTGCAACCGCTGA ATGCGAGAGTTGTGCTTAGCAAT

从质粒pHPLT02-VspE CA2表达的VspE CA2前体蛋白的氨基酸序列 以SEQ ID NO：135示出。信号序列以斜体字显示。

MVFKKPKVFIAAVILALSSFAGTAASASEWGYGNDKHGPEHWGEIAKDCAT TKNQ SPINIDNPADAKLEALNLSYTGQVIGLTNNGHTLQAQVNGRNSFTI DSETFELQQFHFHTPSENQIKGRQYPLEAHFVHANADGELAVISVMFDAG DQNAALSKLINAIPQENQTTFFKDTFEINDLLPKTANYYRFNGSLTTPPCS EGVRWFVLKDTQTLSKDQAAKLMEVMGQNNRPLQPLNARVVLSN

成熟形式的VspE CA2的氨基酸序列以SEQ ID NO：136示出：

SEWGYGNDKHGPEHWGEIAKDCATTKNQSPINIDNPADAKLEALNLSYT GQVIGLTNNGHTLQAQVNGRNSFTIDSETFELQQFHFHTPSENQIKGRQYP LEAHFVHANADGELAVISVMFDAGDQNAALSKLINAIPQENQTTFFKDTF EINDLLPKTANYYRFNGSLTTPPCSEGVRWFVLKDTQTLSKDQAAKLME VMGQNNRPLQPLNARVVLSN

VspE CA2的蛋白质纯化

使用三个色谱柱从来自7L发酵罐操作的浓缩发酵液纯化VspE CA2蛋 白。1)用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡的阴离子交换Q琼脂糖凝胶 柱，使用平衡／洗涤缓冲液至含有0.25M NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)的 线性梯度从其中洗脱出该蛋白。2)用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡的 阴离子交换Q琼脂糖凝胶柱，使用平衡／洗涤缓冲液至含有0.3M NaCl的 20mM Tris-HCl(pH8.0)的线性梯度从其中洗脱出该蛋白。3)Superdex75 凝胶过滤柱，使用含有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH7.0)从其中洗脱出 该蛋白。将纯化的蛋白质级分汇集并用3K Amicon Ultra-15装置浓缩并且 将浓缩的蛋白质级分用于进一步的研究。

B.VspE CA2的碳酸酐酶活性

在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3，25℃)中 测量纯化的VspE CA2的碳酸酐酶活性。简而言之，将3mL冷冻的含有 20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲液(pH8.3)添加至置于冰上的50mL 聚丙烯锥形管。向该管添加20μL酶样品或缓冲液，接着加入2mL冷冻 CO2饱和水(使用密理博公司的Milli-Q Integral系统纯化并去离子化)。 在混合内含物后，立即将标准化的pH计探针插入该溶液中并使用秒表记 录pH从8.3降至6.3所需的时间。重复试验直到至少三次空白测量(加有 缓冲液)在15秒时间窗内并且三次测定的平均值(T空白，平均)在70秒至 100秒之间。使用牛碳酸酐酶II(bCAII，Sigma C2522)制备标准曲线。一 式三份地进行用于测定活性的测试测量，获得T酶，平均。

一个单位的活性(一Wilbur-Anderson(W-A)单位，Wilbur和Anderson， Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)176，147-154，1948) 定义为0.02M Trizma缓冲液在0℃下每分钟pH从8.3降至6.3所需的时 间：

单位／毫升酶＝(T空白，平均-T酶，平均)*DF／(T酶，平均*V)

其中DF＝酶样品的稀释因子，V＝所用酶的体积(毫升)，T空白，平均＝空白 测量的平均时间值，T酶，平均＝测试测量的平均时间值。

单位／毫升蛋白质＝单位／毫升酶／毫克蛋白质／毫升酶

使用上述方法，纯化的VspE CA2的比活性测定为3189±112单位／毫 克。VspE CA2的碳酸酐酶活性适于基于酶的CO2提取。

C.VspE CA2在1M NaHCO 3中的稳定性

在1M NaHCO3存在下在含有20mM Na2SO4的20mM Tris硫酸盐缓冲 夜(pH8.3)中测量VspE CA2的稳定性。将一百(100)ppm的该蛋白质稀释 于1M NaHCO3中并在PCR机器中于20℃和50℃下温育。如实例8B中所 述在温育之前测量样品的比活性。在不同时间点(5分钟至3小时)，取 出100μL样品，在冰上冷却并如实例8B中所述测量它们的比活性。计算 每一时间点的残余活性百分比。保持在冰上的样品在时间0时的活性定义 为100％活性。图33显示了VspE CA2在1M NaHCO3中的稳定性。VspE CA2在25℃下历经3小时温育仍保持大部分活性，并且可预计持续更长温 育期仍保持大部分活性。在50℃下，活性损失更突出并且速率更高。然 而，在该高温下温育30分钟后仍保持至少40％的活性，从而表明该酶具 有相当大的热稳定性。

D.VspE CA2的热容测量

使用超灵敏扫描高通量微量热计VP-Cap DSC(马萨诸塞州北安普顿 市的微凯尔公司)测量VspE CA2和牛碳酸酐酶II(bCA II)的超额热容曲 线。关于DSC测量的标准程序和该技术的理论先前已有描述(Freire， Differential Scanning Calorimetry(差示扫描量热法)，Methods Mol Biol (《分子生物学方法》)，41：191-218，1995)。研究大约500μaL的每种酶 的0.5mg／mL样品。在35-100℃温度范围内扫描蛋白质。然后再次扫描相 同样品(在冷却后)以检查热去折叠过程的可逆性。对于所研究的VspE  CA2碳酸酐酶，热去折叠是不可逆的。在如下缓冲液中研究蛋白质：(1) 0.1M Tris，pH8.5、(2)0.1M CHES，pH9.5、(3)0.1M CAPS，pH10.5，以及 (4)0.1M CHES，pH9.5+2M NaCl。将200℃／小时的扫描速率用于使可能由 聚集引起的任何假象减至最少。使用DSC曲线的表观热中点[Tm(app)]作为 这些碳酸酐酶分子的热稳定性和解链点(melting point)的指标。两种酶在各 种缓冲液中的解链点示于表8D-1中。

VspE CA2碳酸酐酶蛋白在热去折叠期间的Tm(app)值在8.5至10.5的 范围内显示pH依赖性。VspE CA2在pH8.5下显示最高值。含2M NaCl 的0.1M CHES(pH9.5)缓冲液使牛CA II的Tm(app)降低，但使VspE CA2 的Tm(app)升高7℃。碳酸盐使VspE CA2的Tm(app)稍微升高。还测定了 bCAII和VspE CA2在1M KHCO3中在存在和不存在1M NaCl情况下的 Tm(app)(表8D-2)。令人惊讶的是，VspE CA2在1M碳酸氢盐下相比于 0M碳酸氢盐下看起来具有更高的Tm(app)。

表8D-1.VspE CA2和bCAII的解链温度

表8D-2：VspE CA2在1M KHCO 3 中的T m (app)[℃]

[盐](M) bCA II VspE CA2 0 62.1 74.1 1 62.7 79.7

虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施例，但对于本领域的技 术人员来说，显然这些实施例只是用来举例说明。本领域的技术人员现在 应想到不会偏离本发明的众多变型、改变和取代。应了解，在实施本发明 中可使用本文所述发明的实施例的各种替代方案。意图是，如下权利要求 书限定本发明的范围并且由此涵盖在这些权利要求和它们的等同形式范围 内的方法和结构。