技术领域
本发明涉及分子标记领域，具体涉及辣椒杂交种纯度检测 EST-SSR分子标记及其应用。
背景技术
辣椒属于茄科辣椒属一年或多年生草本植物。辣椒以其果实特有 的辣味、色泽和营养成分成为一种重要的世界性蔬菜作物。大量研究 表明辣椒果实中含有的抗氧化类物质可以保护生物有机体免受氧化 伤害和提高机体免疫力。另外，辣椒中辣椒素类物质能够加速能量和 脂类的新陈代谢及降低癌症细胞的发生率。随着大众对辣椒营养成分 和药用成分的充分认识，栽培面积逐年增加。
种子是主要的农业生产资料，种子纯度是种子质量的核心指标， 直接影响农产品质量和优良品种的增产潜力，开展作物种子纯度检测 对保证种子质量具有重要意义。作物品种纯度鉴定的常用方法主要包 括种子形态鉴定、田间种植形态鉴定和同工酶电泳技术鉴定等。种子 形态易受环境条件影响，鉴定结果准确性较差；田间种植形态鉴定存 在周期较长，成本较高，工作量较大，并且表型易受栽培措施和环境 条件的影响，严重影响品种纯度鉴定的效率及准确性，越来越不能满 足育种工作和生产经营的需要；利用同工酶技术鉴定作物品种纯度虽 然准确、可靠，但同工酶标记具有组织和器官特异性，信息量非常有 限，多态性不够丰富。
随着辣椒新品种数量的不断增加，传统的鉴定方法难以有效区分 遗传关系较近的杂交种。分子标记技术能够从DNA水平上揭示子代与 亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官 及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多 态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。DNA分子标记技术的 迅速发展，使得从基因组水平上检测辣椒杂交种纯度成为可能。
‘热辣1号’是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所经 多年研究选育出的微辣丰产青皮尖椒。该杂交组合播种至开花约59 天，至大量收获约105天。始收时株高55～60cm，生长势极强，分 枝能力强，枝叶茂盛。每亩鲜椒产量4000～5000kg，单果重62.0g 左右，果长21.0～26.0cm，果宽3.3～3.7cm，果肉厚0.3～0.4cm， 辣度指数4352SHU，红熟果维生素C含量1.62mg g-1。抗黄瓜花叶 病毒病，田间表现耐热、较耐涝，较抗青枯病和枯萎病，耐疫病、炭 疽病。本品种适宜的栽培区域为全国各个辣椒主产区，最适宜为两广、 海南等不嗜辣地区。
EST-SSR（expressed sequence tag-simple sequence repeat） 标记，是根据EST序列中的简单串联重复序列开发的一种标记类型， 是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，根据串联重复 单位数目的差异检测多态性。辣椒EST-SSR标记具有多态性丰富、共 显性遗传、稳定性和重复性较好、对DNA质量要求不高、操作简单易 行、不受环境因素影响等优点，与基因组SSR标记相比，EST-SSR标 记不仅降低了开发成本、提高了开发效率，而且节省了开发时间，显 著提高了其利用价值。近年来，随着辣椒基因组工程的发展，辣椒丰 富的EST序列资源为EST-SSR标记的开发提供了便利条件。目前辣椒 杂交种纯度的EST-SSR鉴定方法尚未见报道。
发明内容
针对传统作物杂交种纯度检验方法易受环境条件和栽培措施的 影响，鉴定周期较长，成本较高，鉴定结果准确性较差，费时费力等 缺点。
本发明的一个目的，是提供一种辣椒杂交种纯度检测的EST-SSR 分子标记，其对应的核苷酸序列如下：
引物名称 正向引物 反向引物 HE4 5’-AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3’ 5’-TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3’
所述的EST-SSR分子标记可应用于辣椒杂交种纯度的检测。
利用该分子标记检测‘热辣1号’杂交种纯度的方法，包括如下 步骤：
（1）采用改良的CTAB法（AllenGC,Flores-VergaraMA, Krasynanski S,Kumar S,Thompson WF.Amodified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide. Nat Protoc,2006,1:2320–2325）提取辣椒叶片基因组DNA，以母本材 料04Ca125（母本04Ca125是广西玉林羊角椒在连续病圃条件下，经 6代单花自交选育而成的自交系）和父本材料03Ca21（父本03Ca21 是1998年从热带蔬菜种质圃内发现的一株天然杂交株后经6代单花 自交选育而成的粗牛角椒自交系）基因组DNA为模板，利用开发的辣 椒EST-SSR引物进行PCR扩增，筛选在亲本间表现多态性的EST-SSR 标记，其中1对EST-SSR引物（HE4）在‘热辣1号’杂交种和亲本 间能扩增出明显的多态性，带型为双亲互补带型，可用于‘热辣1号’ 种子纯度鉴定。
（2）用于鉴定‘热辣1号’（以04Ca125为母本，03Ca21为父 本杂交产生的F1代）辣椒杂交种纯度的EST-SSR引物序列包括正向引 物序列HE4F：5’-AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3’，反向引物序列 HE4R：5’-TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3’。
（3）以‘热辣1号’单株DNA为模板加入EST-SSR引物HE4进 行PCR扩增，根据特异谱带的扩增结果鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种 的纯度。
检测‘热辣1号’辣椒杂交种纯度的方法，包括如下步骤：
(1)将‘热辣1号’播种于营养钵中，待植株长至5～6片真叶时 利用改良的CTAB法（Allen GC,Flores-Vergara MA,Krasynanski S, Kumar S,Thompson WF.A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide.Nat Protoc, 2006,1:2320–2325）提取‘热辣1号’单株叶片的基因组DNA。
(2)PCR扩增反应体系及程序为：PCR反应体系为10μL，其中 包括10×PCR Buffer1μL，0.2mM dNTPs，引物（HE4）50ng，0.5 U Taq DNA聚合酶，热辣1号基因组DNA20ng，无菌超纯水补齐至 10μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火 45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物保 存于10℃。
(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合经12% 非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1）电泳， 220v恒定电压电泳4h，银染显色进行带型统计。
(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种的纯 度。‘热辣1号’品种纯度（%）=（1-n/N）×100%，其中N为待测‘热 辣1号’种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带 特征或既不同于‘热辣1号’谱带特征也不同于父母本谱带特征的植 株数目。
传统田间种植形态鉴定所需时间较长，易受环境条件影响，不能 完全满足杂交种经营的需要。DNA分子标记技术的发展，为辣椒品种 纯度鉴定提供了更为准确、快速的方法。本发明利用在‘热辣1号’ 亲本材料间表现多态性的EST-SSR标记HE4，以‘热辣1号’单株DNA 为模板进行扩增，根据特异谱带的扩增结果检测杂交种的纯度。共显 性的EST-SSR标记HE4扩增出的特异谱带能够将杂交种与母本自交 种、父本自交种区分开来；具有双亲特异谱带的植株属于真实的杂交 种，缺少父本特异谱带，与母本扩增图谱一致的为母本自交株。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：（1）不受栽培措施和环 境条件的影响。（2）无器官、组织及发育特异性：该方法在植株生长 的任何时期均可进行鉴定。（3）多态性丰富、共显性遗传：能够将杂 交种与母本自交种、父本自交种区分开来。（4）对DNA质量要求不高 且需要量少。（5）成本较低、操作简单：该方法在苗期即可进行鉴定， 节省大量人力、物力和土地资源。（6）重复性和稳定性较好。（7）快 速高效：6h之内即可完成种子纯度鉴定工作。（8）准确性高：该方 法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴 定带来的误差。（9）应用推广前景广阔：可以快速、准确检测‘热辣 1号’杂交种纯度，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据， 有广阔的应用前景。
附图说明
图1：EST-SSR标记HE4在亲本材料及部分‘热辣1号’单株中 的扩增结果。其中M代表DL1000DNA Marker，1为‘热辣1号’母 本材料04Ca125，2为‘热辣1号’父本材料03Ca21，3-24为：‘热 辣1号’单株。检测结果表明，22号为母本自交株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明：
以下如无特殊说明，本发明所述设备及材料均为市售设备及材 料。
本发明所需主要仪器设备为：高速冷冻离心机，水浴锅，PCR仪， 电泳仪，垂直电泳槽。
本发明所需主要试剂为：苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、CTAB、 PCR Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、超纯水、丙烯酰胺、甲叉双丙 烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯腈、EDTA、Tris、 硼酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠、无水碳酸钠。
实施例1：
(1)将186粒‘热辣1号’种子播种于营养钵中，待植株长至 5～6片真叶时利用改良的CTAB法（Allen GC,Flores-Vergara MA, Krasynanski S,Kumar S,Thompson WF.A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide. Nat Protoc,2006,1:2320–2325）提取单株叶片的基因组DNA。
(2)PCR扩增反应体系及程序为：PCR反应体系为10μL，其中 包括10×PCR Buffer1μL，0.2mM dNTPs，引物（HE4）50ng，0.5 U Taq DNA聚合酶，‘热辣1号’基因组DNA20ng，无菌超纯水补齐 至10μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退 火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min。PCR产 物保存于10℃。
(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合经12% 非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1）电泳， 220v恒定电压电泳4h，银染显色进行带型统计。
(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种的纯 度。其中，185个‘热辣1号’单株既具有母本特异谱带也具有父本 特异谱带，属于真实的杂交种，22号单株缺少父本特异带，与母本 带型一致（附图1），说明22号单株为母本自交株，‘热辣1号’辣 椒杂交种的纯度为99.46%。
(5)鉴定效果检验
将取材后的‘热辣1号’幼苗按照顺序移栽到地势平坦、土质肥 沃的田块，采用常规栽培措施进行管理，在成株期依据品种的特征特 性逐株进行鉴定，其中，22号植株与母本性状一样，果形为细羊角 椒，果色浅绿色，其余植株均具有‘热辣1号’辣椒品种的典型特征， 生长一致，叶片较母本材料大些，果形为粗牛角椒，果色深绿色。田 间种植形态学鉴定结果与EST-SSR标记HE4检测结果一致，该结果说 明EST-SSR标记HE4可以快速、准确地鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种 纯度。
其中，（1）中采用改良的CTAB法提取辣椒叶片的基因组DNA具 体步骤如下：
配制CTAB提取液（0.1mol L-1Tris pH7.5，0.05mol L-1EDTA pH8.0，0.7mol L-1NaCl，2%CTAB），高温灭菌后，添加2%巯基乙 醇，65℃预热；
利用液氮将辣椒叶片研磨成粉末装入2.0mL离心管中，样品达 到1/3处为宜，每管加入预热的CTAB提取液700μL置于65℃恒温 水浴箱中45min（每隔8min轻轻摇动一次）；
加入苯酚/氯仿/异戊醇（苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）700μ L充分混匀16min，动作缓慢，4℃12000rpm离心6min；
吸取上清液转入1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（氯 仿：异戊醇=24:1）充分混匀16min，动作缓慢，4℃12000rpm离 心6min；
吸取上清液转入1.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙 醇，轻轻混匀，置-20℃冰箱沉淀15min；
将絮状DNA沉淀置于1.5mL离心管中，采用70%乙醇漂洗两遍， 晾干；
加入120μL灭菌超纯水，4℃冰箱溶解，溶解后母液贮于-20 ℃冰箱备用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书 所限定的保护范围为准。