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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810184849.7 (22)申请日 2018.03.07 (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450001 河南省郑州市二七区建设东 路50号 (72)发明人 李红张震张毅 (74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务 所(普通合伙) 32231 代理人 高姗 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 SFN联合IL-15和IL-21制备记。
2、忆性T细胞的 方法及应用 (57)摘要 本发明涉及临床免疫细胞技术领域， 尤其是 一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的 方法及应用， 包括以下步骤： (1)采集人外周血， 采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞； (2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞； (3)将分选的 CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、 细胞 因子IL-15、 IL-21和SFN的培养基中培养； (4)扩 增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细 胞表型的CD8+T细胞。 本方法可使记忆性T细胞在 体外培养中获得大量扩增， 解决目前临床培养技 术瓶颈， 增强免疫细胞持久高效的抗肿瘤活。
3、性 力， 为细胞免疫治疗进一步临床应用提供可行性 治疗手段。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 108192866 A 2018.06.22 CN 108192866 A 1.一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)采集人外周血， 采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞； (2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞； (3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28 beads、 细胞因子IL-15、 IL-21和SFN 的培养基中培养； (4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。 2.根。
4、据权利要求1所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于： 所述步骤(1)中获得人外周血单个核细胞具体的方法为， 在无菌条件下采集人外周血， 先在 1500rpm， 10min条件下离心， 将血清转移至无菌的离心管中56灭活25min， 再4000rpm， 20min离心血清， 用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞， 然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分 离液上， 2500rpm， 25min条件下离心， 最后吸取白膜层， 并用PBS缓冲液清洗， 1500rpm， 10min 离心， 弃上清后采用PBS缓冲液清洗， 1500rpm， 5min离心， 即获得人外周血单个核细。
5、胞。 3.根据权利要求2所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于： 用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞时， 采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释， 所述淋巴分离 液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。 4.根据权利要求3所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于： 所述步骤(2)中用磁分选仪分选CD8+T细胞的方法为， 按照每1107个单个核细胞避光加入 20 L human CD8 microbeads和70 L autoMACS Running Buffer， 进行磁分选CD8+T细胞。 5.根据权利要求4所述。
6、的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中刺激剂CD3/CD28 beads与CD8+T细胞比例为1:3， 细胞因子IL-7的浓度为 10ng/mL， IL-15的浓度为10ng/mL； SFN的浓度为20 M/mL。 6.根据权利要求5所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中的培养基为Takara GT-551培养基， 培养条件为37、 5CO2环境。 7.根据权利要求6所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中的培养基中还包括5体积量的自。
7、体血清、 青霉素和链霉素， 培养基中T细胞 密度为2106/mL。 8.根据权利要求1-7所述的任一方法获得的记忆性T细胞。 9.权利要求8所述的记忆性T细胞应用于制备治疗肿瘤患者的制剂中。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108192866 A 2 SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及临床免疫细胞技术领域， 具体领域为一种记忆性T细胞的制备方法。 背景技术 0002 T细胞作为参与适应性免疫的主力军， 在机体免疫反应中扮演着重要的角色， 是目 前癌症免疫治疗的研究热点。 作为细胞治疗的重要组成部分， 过继性免疫细胞治疗是指将 体外培养。
8、的免疫效应细胞输注给患者， 以杀伤患者体内的肿瘤细胞。 研究发现： 记忆性T细 胞在体内的增殖能力和抗肿瘤活性， 均优于效应记忆性T细胞和效应性T细胞， 此外， 记忆性 T细胞对维持机体免疫内环境的稳态及重建具有重大意义。 这意味着， 记忆性T细胞在体内 存活的时间越长， 其抗肿瘤的临床效果越强。 然而细胞的体外培养面临着巨大的挑战即体 外培养的免疫细胞处于终末分化状态， 这提示T细胞在体内存活时间短、 抗肿瘤效果差等问 题。 基于此点， 如何在体外诱导培养并获得更多的分化程度低、 抗肿瘤活性强的免疫细胞， 是目前免疫治疗研究关注的热点。 细胞因子的不同生物学特性及可能对T细胞分化的影响， 成。
9、为细胞特异性的体外诱导及增强T细胞杀伤活性的突破点。 0003 IL-15由单核-巨噬细胞分泌的细胞因子， 具有强大的抗病毒、 抗细菌感染作用。 其 功能和IL-2相似， 在免疫反应中起着重要的作用。 有文献报道， IL-15对CD8+T细胞的生存和 分化有影响， 在细胞contraction期与IL-2的协同作用可延长KLRG1hi CD8+T细胞的生存时 间， 并增强其向记忆性前体细胞的分化。 Angela M等报道了CD127影响T细胞分化命运和功 能。 记忆性前体细胞均高表达CD127， 而效应性T细胞及终末分化T细胞表型为CD127-。 已有 文献报道记忆性前体T细胞表达较高水平的C。
10、D127和较低水平的KLRG1。 IL-21通过诱导T细 胞早期分化的表型对记忆性T细胞的维持和发育起到重要作用。 同时， IL-21诱导记忆性T细 胞产生的方法， 已经应用于临床免疫细胞培养体系中。 此外， T细胞的分化受到一些关键信 号通路的调控， 已有文献报道抑制mTOR及其下游信号通路能够促进记忆T细胞分化。 在T细 胞分化的研究中我们发现， SFN能够下调哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin， mTOR)及其下游通路p-S6， 促进低分化记忆性T细胞的形成， 同时抑制抗凋亡基 因BcL2的分泌及降低T细胞表面抑制性标志物PD-1的表达。 综。
11、上所述， 多种细胞因子的组合 应用为ACT治疗提供更多的分化低、 抗瘤活性强的T细胞。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应 用， ， 获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗， 以解决现有技术中 临床培养T细胞的技术瓶颈。 0005 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法， 包括以下步骤： 0007 (1)采集人外周血， 采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞； 0008 (2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞； 说明书 1/6 页 3 。
12、CN 108192866 A 3 0009 (3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、 细胞因子IL-15、 IL-21和 SFN的培养基中培养； 0010 (4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。 0011 优选的， 步骤(1)中获得人外周血单个核细胞具体的方法为， 在无菌条件下采集人 外周血， 先在1500rpm， 10min条件下离心， 将血清转移至无菌的离心管中56灭活25min， 再 4000rpm， 20min离心血清， 用缓冲液稀释沉淀的血细胞， 然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋 巴分离液上， 2500rpm， 25mi。
13、n条件下离心， 最后吸取白膜层， 并用PBS缓冲液清洗， 1500rpm， 10min离心， 弃上清后采用PBS缓冲液清洗， 1500rpm， 5min离心， 即获得人外周血单个核细 胞。 0012 优选的， 所述用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞时， 采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲 液稀释， 所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。 优选的， 步骤(2)中用 磁分选仪分选CD8+T细胞的方法为， 按照每1107个单个核细胞避光加入20L human CD8microbeads和70 L autoMACS Running Buffer， 进行磁分选CD8+T细胞。 00。
14、13 优选的， 步骤(3)中刺激剂CD3/CD28beads与CD8+T细胞比例为1:3， 细胞因子IL-7 的浓度为10ng/mL， IL-15的浓度为10ng/mL。 SFN的浓度为20 M/mL。 0014 优选的， 步骤(3)中所述培养基为Takara GT-551培养基， 培养条件为37、 5CO2 环境。 0015 优选的， 步骤(3)中所述培养基中还包括5体积量的自体血清、 青霉素和链霉素， 培养基中T细胞密度为2106/mL。 0016 本发明采用上述任一方法获得的人记忆性CD8+T细胞。 0017 本发明所述的人记忆性CD8+T细胞应用于制备治疗肿瘤疾病的制剂中。 0018 。
15、与现有技术相比， 采用本发明的方法制备人记忆性CD8+T细胞， 具有以下优点： 0019 (1)在体外实验中， 从外周血中获得CD8+T细胞， 加入CD3/CD28beads活化， 并采用 IL-15、 IL-21和SFN处理。 发现其促进记忆性前体的产生， 同时下调Bcl2基因的表达， 增强T 细胞的抗凋亡能力。 T细胞表面抑制性标志物PD-1分泌显著减低。 0020 (2)通过本方法可以获得大量具有记忆特性且分化状态低的记忆性T细胞， 从而获 得抗肿瘤活性高、 体内存活时间长的T细胞用于临床过继性细胞免疫治疗。 0021 (3)本方法可使记忆性T细胞在体外培养中获得大量扩增， 解决目前临床。
16、培养技术 瓶颈， 增强免疫细胞持久高效的抗肿瘤活性力， 为细胞免疫治疗进一步临床应用提供可行 性治疗手段。 附图说明 0022 图1为对比例1、 对比例2和对比例3与实施例1制备的流式检测外周血记忆性T细胞 标志物CD127流式图； 0023 图2为对比例1、 对比例2和对比例3与实施例1制备的流式检测外周血记忆性T细胞 标志物KLRG1流式图； 0024 图3为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞标志物CD127细胞比例统计图； 0025 图4为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞标志物KLRG1细胞比例统计图； 0026 图5为RT-PCR检测外周血记忆性T细胞抗凋亡基因BcL2统计图； 说明。
17、书 2/6 页 4 CN 108192866 A 4 0027 图6对比例与实施例1制备的记忆性T细胞表面抑制性标志物PD-1比例统计图。 具体实施方式 0028 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0029 实施例1 0030 无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞 PBMCs， 具体步骤如下： 先1500rpm， 1。
18、0min离心， 其升速和减速的加速度均为9m/s2， 将血清转 移至无菌的50mL离心管中， 56灭活25min， 再4000rpm， 20min离心血清， 其升速和减速的加 速度均为9m/s2。 采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:3的比例稀释沉淀的血细胞， 然后将血细 胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上， 所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/ 3。 最后2500rpm， 25min离心， 其升速和减速的加速度均为5m/s2， 小心吸取白膜层， 用PBS缓 冲液清洗两遍， 1500rpm， 10min离心， 其升速和减速的加速度均为9m/s2， 即可获得外周血单 个核细胞。 0031 。
19、将上述分离的PBMCs计数， 按照每1107个细胞避光加入20L human CD8 microbeads和70 L autoMACS Running Buffer， 进行磁分选CD8+T细胞。 0032 将分选的CD8+T细胞置于含有刺激剂CD3/CD28beads(3:1)、 10ng/mL IL-15、 10ng/ mL IL-15和20 M SFN的GT551培养基中， 同时加入5自体血清、 青霉素和链霉素， 调整细胞 密度为2106/mL。 在37， 5CO2培养箱中培养。 每隔2d观察细胞生长状态， 半量换液并补 加全量的细胞因子IL-15和IL-21。 0033 收集细胞至1.5。
20、mL EP管中计数， 离心： 1500rpm， 5min， 取1106细胞， 避光加入抗 体： CD8-APC-cy7、 CD45RA-APC、 CD127-Percp、 KLRG1-APC、 PD-1-FITC。 上机检测。 0034 收集SFN处理的CD8+T细胞。 采用TRizol法提取细胞总RNA， 并反转录成CDNA。 qPT- PCR检测SFN对抗凋亡基因Bcl2表达的影响 0035 以上所用试剂中， 所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公 司， GT-551培养基选自Takara公司， IL-15和IL-21为德国美天旎公司生产， SFN购自sigma公 司， C。
21、D3/CD28beads为Life technology公司生产， human CD8microbeads购自德国美天旎公 司。 Bcl2的引物合成是生工合成生工生物工程(上海)有限公司， 流式抗体均购自美国 Biologend公司。 0036 实施例2 0037 无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞 PBMCs， 具体步骤如下： 先1500rpm， 10min离心， 其升速和减速的加速度均为9m/s2， 将血清转 移至无菌的50mL离心管中， 56灭活25min， 再4000rpm， 20min离心血清， 其升速和减速的加 速度均为9m/s2。 采用PBS缓冲。
22、液按照与血细胞量1:2的比例稀释沉淀的血细胞， 然后将血细 胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上， 所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/ 2。 最后2500rpm， 25min离心， 其升速和减速的加速度均为5m/s2， 小心吸取白膜层， 用PBS缓 冲液清洗两遍， 1500rpm， 10min离心， 其升速和减速的加速度均为9m/s2， 即可获得外周血单 说明书 3/6 页 5 CN 108192866 A 5 个核细胞。 0038 将上述分离的 PBMCs计数 ， 按照每110 7 细胞避光 加入20L human CD8microbeads和70 L autoMACS Runnin。
23、g Buffer， 进行磁分选CD8+T细胞。 0039 将分选的CD8+T细胞置于含有刺激剂CD3/CD28beads(3:1)、 20ng/mL IL-15、 20ng/ mL IL-21和10 M SFN的GT551培养基中， 同时加入5自体血清、 青霉素和链霉素， 调整细胞 密度为2106/mL。 在37， 5CO2培养箱中培养。 每隔2d观察细胞生长状态， 半量换液并补 加全量的细胞因子IL-15和IL-21。 0040 收集细胞至1.5mL EP管中计数， 离心： 1500rpm， 5min， 取1106细胞， 避光加入抗 体： CD8-APC-cy7、 CD45RA-APC、 C。
24、D127-Percp、 KLRG1-APC、 PD-1-FITC。 上机检测。 0041 收集SFN处理的CD8+T细胞。 采用TRizol法提取细胞总RNA， 并反转录成CDNA。 qPT- PCR检测SFN对抗凋亡基因Bcl2表达的影响 0042 以上所用试剂中， 所述淋巴细胞分离液选自天津市灏洋生物制品科技有限责任公 司， GT-551培养基选自Takara公司， IL-15和IL-21为德国美天旎公司生产， SFN购自sigma公 司， CD3/CD28beads为Life technology公司生产， human CD8microbeads购自德国美天旎公 司。 Bcl2的引物由生。
25、工合成生工生物工程(上海)有限公司合成， 流式抗体均购自美国 Biologend公司。 0043 实施例3 0044 无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞 PBMCs， 具体步骤如下： 先1500rpm， 10min离心， 其升速和减速的加速度均为9m/s2， 将血清转 移至无菌的50mL离心管中， 56灭活25min， 再4000rpm， 20min离心血清， 其升速和减速的加 速度均为9m/s2。 采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:4的比例稀释沉淀的血细胞， 然后将血细 胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上， 所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/ 4。。
26、 最后2500rpm， 25min离心， 其升速和减速的加速度均为5m/s2， 小心吸取白膜层， 用PBS缓 冲液清洗两遍， 1500rpm， 10min离心， 其升速和减速的加速度均为9m/s2， 即可获得外周血单 个核细胞。 0045 将上述分离的PBMCs计数， 按照每1107个细胞避光加入20L human CD8 microbeads和70 L autoMACS Running Buffer， 进行磁分选CD8+T细胞。 0046 将分选的CD8+T细胞置于含有刺激剂CD3/CD28beads(3:1)、 15ng/mL IL-15、 15ng/ mL IL-21和5 M SFN的G。
27、T551培养基中， 同时加入5自体血清、 青霉素和链霉素， 调整细胞 密度为2106/mL。 在37， 5CO2培养箱中培养。 每隔2d观察细胞生长状态， 半量换液并补 加全量的细胞因子IL-15和IL-21。 0047 收集细胞至1.5mL EP管中计数， 离心： 1500rpm， 5min， 取1106细胞， 避光加入抗 体： CD8-APC-cy7、 CD45RA-APC、 CD127-Percp、 KLRG1-APC、 PD-1-FITC。 上机检测。 0048 收集SFN处理的CD8+T细胞。 采用TRizol法提取细胞总RNA， 并反转录成CDNA。 qPT- PCR检测SFN对抗。
28、凋亡基因Bcl2表达的影响。 0049 以上所用试剂中， 所述淋巴细胞分离液选自天津灏洋生物制品科技有限责任公 司， GT-551培养基选自Takara公司， IL-15和IL-21为德国美天旎公司生产， SFN购自sigma公 司， CD3/CD28 beads为Life technology公司生产， human CD8 microbeads购自德国美天旎 公司。 Bcl2的引物合成是生工合成生工生物工程(上海)有限公司， 流式抗体均购自美国 说明书 4/6 页 6 CN 108192866 A 6 Biologend公司。 0050 为突出本发明的有益效果， 还进行了以下对比例试验。 0。
29、051 对比例1 0052 本对比例与实施例1的区别在于， 不添加细胞因子IL-15、 IL-21及小分子化合物 SFN， 其他培养条件一致。 0053 对比例2 0054 本对比例与实施例1的区别在于， 不添加细胞因子SFN， 其他培养条件一致。 0055 对比例3 0056 本对比例与实施例1的区别在于， 不添加IL-15、 IL-21， 其他培养条件一致。 0057 检测及结果： 0058 IL-15、 IL-21联合SFN对记忆性T细胞的表型、 凋亡蛋白Bcl2、 T细胞表面抑制性标 志物PD-1的表达进行检测， 以实施例1中的试样为研究对象。 具体操作步骤如下： 0059 (1)记忆。
30、性T细胞表型检测： 收集培养至第7d细胞1106个， 重悬于200 L含1FBS (胎牛血清)的PBS中， 避光加入流式抗体： CD8-APC-cy7、 CD45RA-APC、 CD127-Percp、 KLRG1- APC 4避光孵育15min， 流式检测记忆性T细胞的表型。 采用Diva软件分析培养获得的细胞 表型结果显示CD127表达达到80.1， KLRG1表达低至到6。 0060 (2)记忆性T细胞抑制性标记物检测： 收集培养至第7d细胞,， 流式细胞术检测T细 胞的抑制性表面标志物。 收集1106个细胞， 重悬于200 L含1FBS(胎牛血清)的PBS中， 避 光加入流式抗体： C。
31、D8-APC-cy7、 PD-1-FITC， 4避光孵育15min。 采用Diva软件分析培养获 得的T细胞PD-1的表达水平， 结果显示CD8+T细胞PD-1表达水平5.6， 较对照组诱导培养获 得的CD8+T细胞PD-1比例降低15以上。 0061 (3)记忆性T细胞抗凋亡基因Bcl2表达的检测： 收集培养至第7d细胞,qRT-PCR检测 凋亡基因Bcl2的表达。 收集SFN处理的CD8+T细胞。 采用TRizol法提取细胞总RNA， 并反转录 成cDNA。 将2 L DNA和10 L SYBER Green、 10uM的上游和下游引物各0.8 L及无酶水加入到 荧光定量板中， 每孔20 。
32、L体系。 0062 设置程序： 9510min； 9510s， 6010s， 7210s， 40个循环； 溶解曲线； 以GAPDH 作为内参， 记录每个反应的Ct值。 以Folds2-Ct公式计算基因相对倍比关系。 0063 (4)流式检测实施例1制备的记忆性T细胞与对比例1、 2和3制备的记忆性T细胞比 例， 结果如图1-4所示， 其中图1为对比例1、 对比例2和对比例3制备的记忆性T细胞表达 CD127比例的流式图， 图2为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞表达KLRG1比例的流式图， 图3为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞CD127比例的统计图， 图4为对比例与实施例1制 备的记忆性T。
33、细胞KLRG1比例的统计图。 由结果可知， 采用实施例1方法制备记忆性T细胞比 例高， 利于记忆性T细胞的诱导及分化。 0064 (5)流式检测实施例1制备的T细胞与对比例制备的T细胞抗凋亡基因Bcl2的表达。 结果如图5所示， 实施例制备T细胞中抗凋亡能力显著优于对比例1、 2和3中T细胞抗凋亡能 力。 结果表明了实施例1制备的T细胞更加有利于维持记忆性T细胞的生存。 0065 (6)流式检测实施例1制备的T细胞与对比例制备的T细胞表面抑制性表面标志物 PD-1的表达水平。 结果如图6所示， 实施例1制备T细胞PD-1的表达水平低于对比例1、 2和3中 PD-1的表达水平。 结果表明了实施例。
34、1制备的T细胞具有维持记忆性T细胞的活性。 说明书 5/6 页 7 CN 108192866 A 7 0066 对于实施例2-3制备的记忆性T细胞， 在做上述检测后其结果与实施例1的检测结 果相似， 在此不做赘述。 0067 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 对于本领域的普通技术人员而言， 可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换 和变型， 本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 说明书 6/6 页 8 CN 108192866 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 9 CN 108192866 A 9 图4 图5 说明书附图 2/3 页 10 CN 108192866 A 10 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 108192866 A 11 。