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1、(10)授权公告号 CN 102093982 B (45)授权公告日 2012.10.10 CN 102093982 B *CN102093982B* (21)申请号 201010123682.7 (22)申请日 2010.02.10 CGMCC NO3526 2009.12.17 C12N 7/00(2006.01) C07K 14/11(2006.01) C07K 16/10(2006.01) C07K 16/06(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 河南农业大学 地址 450002 河南省郑州市文化路 95 号 (72)发明人 李新生 崔保安 崔沛 。
2、高文明 李双亮 陈红英 黄宗梅 (74)专利代理机构 郑州中原专利事务所有限公 司 41109 代理人 张绍琳 Choi JG et al.“An inactivated vaccine to control the current H9N2 low pathogenic avian influenza in Korea.” .J Vet Sci. .2008, 第 9 卷 ( 第 1 期 ), 王英珍 等 .“H9N2 亚型禽流感病毒 TJ_1 株 的分离与鉴定” .动物医学进展 .2007, 第 28 卷 ( 第 10 期 ), 柴丽娜. “1998-2005年H9N2亚型AIV分离株 致。
3、病力比较及其 HA 基因序列分析” . 中国优秀硕 士学位论文全文数据库 （农业科技辑） .2008,(第 9 期 ), (54) 发明名称 一种禽流感 H9N2亚型病毒毒株及其应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 禽 流 感 H9N2亚 型 病 毒 毒 株，禽 流 感 H9N2亚 型 病 毒 毒 株 (Orthomyxoviridae)， CGMCC NO ： 3526。本发明的 禽流感 H9N2亚型病毒毒株具有良好的特异性和免 疫原性， 鸡胚尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗 NDV阳性血清、 抗EDS76阳性血清、 抗M41阳性血清、 抗H5亚型禽流感病毒单因子阳性血清以及抗。
4、H7亚 型禽流感病毒单因子阳性血清所抑制， 而能被 H9 亚型禽流感病毒单因子阳性血清抑制。免疫雏鸡 能产生对 H9特异的 HI 抗体。本发明作为制造效 果良好的疫苗毒株， 预防禽类的H9亚型禽流感， 用 于病毒的鉴定和流行病学的调查。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 董桂灵 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 一 种 禽 流 感 H9N2亚 型 病 毒 毒 株，其 特 征 在 于 ： 禽 流 感 H9N2亚 型 病 毒 (Orthomyxo。
5、viridae)， CGMCC NO ： 3526。 2. 如权利要求 1 所述的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒诊断用抗原试剂 中的应用。 3. 如权利要求 1 所述的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒诊断用阳性血清 试剂中的应用。 4. 如权利要求 1 所述的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒治疗用抗血清试 剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102093982 B 2 1/6 页 3 一种禽流感 H9N2亚型病毒毒株及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物病毒领域， 涉及病毒新毒种， 具体涉及一种禽流感 H9N2亚型病 毒毒株及其应用。 背景技术。
6、 0002 2006 年 1 月河南某大型养鸡场的 180 日龄发病蛋鸡群发病， 鸡卧地不起， 精神沉 郁， 爪子干瘪。 剖检发现， 呼吸系统和消化道呈现明显的病理变化， 气管环有出血， 肺脏严重 出血、 淤血， 呈现病理性实变 ； 小肠各段均有不同程度的出血， 肌胃、 腺胃交界处有出血、 溃 疡灶， 几天后出现产蛋下降接着出现死亡， 部分鸡只发生急性死亡， 日死淘率达 2以上， 虽 使用各种抗生素， 发病无明显好转， 总死淘率在 20左右， 产蛋下降至 15。持续近 4 周才 逐步回升。上述临诊表现与近年来国内报道的其他地区发病后的 H9N2亚型禽流感大致相 似。 发明内容 0003 本发明。
7、的目的是提供一种禽流感 H9N2亚型病毒毒株， 分类命名 ： 禽流感 H9N2亚型 病毒， 拉丁文学名 ： Orthomyxoviridae， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心， 保藏单位简称 ： CGMCC， 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院， 保藏日期 ： 2009 年 12 月 17 日， 保藏编号 ： 3526。 0004 本发明的技术方案是 ： 一种禽流感 H9N2亚型病毒毒株， 禽流感 H9N2亚型病毒毒株 (Orthomyxoviridae)， CGMCC NO ： 3526。 0005 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株具有下述特点 。
8、： 0006 (1) 所述毒株为低致病力禽流感病毒株 ； 0007 (2) 所述毒株具有特异性 ； 0008 (3) 所述毒株具有免疫原性。 0009 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。 0010 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒诊断用抗原试剂中的应用。 0011 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒诊断用阳性血清试剂中的 应用。 0012 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒治疗用抗血清中试剂的应 用。 0013 本发明的有益效果是 ： 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株具有良好的特异性和免 疫原性， 鸡胚。
9、尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗 NDV 阳性血清、 抗 EDS76阳性血清、 抗 M41阳 性血清、 抗H5亚型禽流感病毒单因子阳性血清以及抗H7亚型禽流感病毒单因子阳性血清所 抑制， 而能被 H9亚型禽流感病毒单因子阳性血清抑制。免疫雏鸡能产生对 H9特异的 HI 抗 体。用 H9亚型特异抗血清中和后接种鸡胚， 鸡胚均不死亡， 而未中和的对照接种胚都死亡， 这进一步说明了本发明毒株的特异性。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株， 预防禽类的 说 明 书 CN 102093982 B 3 2/6 页 4 H9亚型禽流感， 用于病毒的鉴定和流行病学的调查。 0014 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒。
10、毒株， 保藏日期 ： 2009 年 12 月 17 日， 保藏单位 ： 中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏单位简称 ： CGMCC， 保藏编号 ： 3526。 具体实施方式 0015 实施例 0016 2006年1月， 河南某鸡场从发病蛋鸡群分离到一株A型禽流感病毒毒株。 鸡群180 日龄开始发病， 鸡卧地不起， 精神沉郁， 爪子干瘪。 剖检发现， 呼吸系统和消化道呈现明显的 病理变化， 气管环有出血， 肺脏严重出血、 淤血， 呈现病理性实变 ； 小肠各段均有不同程度的 出血， 肌胃、 腺胃交界处有出血、 溃疡灶， 以严重呼吸道症状为主， 几天后出现产蛋下降接着 出现死亡， 。
11、部分鸡只发生急性死亡， 日死淘率达 2以上， 虽使用各种抗生素， 发病无明显好 转， 总死淘率在 20左右， 产蛋下降至 15。持续近 4 周才逐步回升。上述临诊表现与近 年来国内报道的其他地区发病后的 H9N2亚型禽流感大致相似。 0017 从鸡群病例的气管、 输尿管和泄殖腔拭子中分离到一株病毒， 通过 SPF 鸡胚传代 后， 将分离的毒株和其他毒株的鸡胚尿囊液用 0.05甲醛溶液灭活后， 送国家流感中心， 做 HI 和 NI 试验， 确定病毒的亚型。结果表明分离到的毒株为 H9 亚型禽流感， 定名为 A/ Chicken/Henan/01/2006(H9N2亚型 ) 株 ( 简称 HN10。
12、6 株 )。 0018 在初次分离时， 尿囊液血凝滴度为 1 256， 凝集不被 ND 和 EDS76 抗血清抑制， 出 现全身出血、 明显水肿和肝脏坏死的病变 ； 死亡时间多集中在 72 96h 之间。 0019 尽管从致鸡胚症状看， 该毒株对禽类有一定的致病力。但根据分离病毒对鸡胚的 致死时间、 对雏鸡的致病力和鸡脑内致病指数 (ICPI) 的测定结果， 依据国际通用标准和国 际兽医局 (OIE) 推荐的鉴定标准， 判定分离的病毒株为低致病力禽流感病毒株。 0020 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。 0021 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流。
13、感病毒诊断用抗原试剂中的应用。 0022 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒诊断用阳性血清试剂中的 应用。 0023 本发明的禽流感 H9N2亚型病毒毒株在制备禽流感病毒治疗用抗血清中试剂的应 用 0024 本发明中， 毒株定名为 A/Chicken/Henan/01/2006 株， 简称 HN106 株。 0025 (1) 流行病学调查 0026 调查鸡群的发病年龄， 临床表现、 剖检病变及死亡率等情况。 2006年1月河南某大 型养鸡场的 180 日龄发病蛋鸡群发病， 鸡卧地不起， 精神沉郁， 爪子干瘪。剖检发现， 呼吸系 统和消化道呈现明显的病理变化， 气管环有出血， 。
14、肺脏严重出血、 淤血， 呈现病理性实变 ； 小 肠各段均有不同程度的出血， 肌胃、 腺胃交界处有出血、 溃疡灶。 0027 (2) 病毒分离 0028 选择临床症状典型的濒死鸡和死亡后 2h 以内的病死鸡， 无菌采集气管、 输卵管或 喉头、 泄殖腔分泌物棉拭子。 用匀浆器研磨， 按体积15的比例加入含青霉素1,000U/mL、 链霉素 1,000U/mL 灭菌的生理盐水， 制成组织悬液， 置 2 8冰箱， 抑菌 2h， 4000rpm 离心 20min， 取上清液， 无菌滤器过滤， 然后经尿囊腔接种 10 11 日龄 SPF 鸡胚， 每胚 0.2mL， 说 明 书 CN 102093982 B。
15、 4 3/6 页 5 37孵化， 每日照蛋 2 次， 将 48h 以前死亡的鸡胚弃去。48h 后， 每 4 6h 照蛋 1 次， 死亡的 鸡胚随时取出， 直至 120h， 不论死亡或存活， 取出所有鸡胚， 气室向上直立， 置 2 8冰箱 冷却 8 16h， 收获鸡胚液。 0029 按照上述方法， 从病鸡的病料中分离到有血凝性的病毒， HI 试验证明 HN106 株的 血凝性不能被 ND 抗血清抑制， 能被 AIH9亚型阳性血清抑制。结果见表 1。 0030 表 1 现场病料初次分离结果 0031 0032 0033 (3)HA 和 HI 试验 0034 按微量法在 V 型血凝试验微量板上进行，。
16、 鸡红细胞浓度为 1 (V/V)， 反应总量均 为 0.075mL。 0035 (4) 病毒继代 0036 病毒在 10 11 日龄 SPF 鸡胚中继代， 收获尿囊液。 0037 (5) 亚型的鉴定 0038 将分离的 HN106 株和其他毒株的鸡胚尿囊液用 0.05甲醛溶液灭活后， 送国家流 感中心， 做 HI 和 NI 试验， 确定病毒的亚型。经国家流感中心鉴定， HN106 株分离物为 H9N2 亚型， 命名为 A/Chicken/Henan/01/2006(H9N2亚型 ) 株， 简称 HN106 株。 0039 (6)1 日龄鸡脑内致病指数 (ICPI) 测定 0040 将第 2 代。
17、 SPF 鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水 10 倍稀释， 灭菌滤器过滤后， 对 10 只 1 日龄雏鸡脑内注射， 0.05mL/ 只， 另取 2 只以同样的方法注射稀释病毒用的灭菌生理盐水各 0.05mL。隔离饲养， 观察 8d， 记录试验结果。 0041 按照打分系数标准 ( 正常鸡， 0 分 ； 发病鸡， 1 分 ； 病死鸡， 2 分 ) 给正常、 发病和死 亡鸡打分， 试验结果如表 2。 0042 按照计算 ICPI 的公式 ： ICPI ( 发病数 + 死亡数 )/ 总观察数， 计算得 ： ICPI 11/80 0.14。 0043 根据国际通用的标准， ICPI 在 1.6 5 范围内， 。
18、可判定病毒为强致病力株。本试 验 ICPI 的结果为 1.3， 故判定分离的病毒株为低致病力禽流感病毒株。 0044 表 2 脑内致病指数测定结果 说 明 书 CN 102093982 B 5 4/6 页 6 0045 0046 (7) 鸡胚半数感染量 (EID50) 的测定 0047 将待检病毒液作10倍系列稀释， 取10-5、 10-6、 10-7、 10-84个稀释度， 分别接种910 日龄 SPF 鸡胚， 每胚 0.1mL， 每个稀释度接种 4 枚鸡胚， 另一组接种同量 PBS 作对照， 置 37 温箱中观察 120h， 24h 内死亡的弃去。记录鸡胚病变情况， 测定鸡胚尿囊液的血凝效。
19、价， 效 价在 1 16 以上判为感染。 0048 AIV H9亚型 HN106 分离株 E0 鸡胚尿囊液 EID50测定结果见表 3。 0049 表 3 各种稀释度鸡胚感染的累计百分率 0050 0051 由表 3 结果可知， HN106 分离株对鸡胚的半数感染量 EID50 10-8.0/0.1mL， 即将病 毒悬液作 10-8.0稀释后， 给鸡胚接种 0.1mL， 可以使 50的鸡胚感染。 0052 (8)HN106 株对鸡胚的毒力 0053 将 HN106 株第 1 代尿囊液毒， 用灭菌生理盐水稀释， 接种 10 11 日龄 SPF 鸡胚 30 枚， 每胚尿囊腔接种0.1mL， 363。
20、7孵育至120h， 每天两次观察记录死亡胚。 结果见表4。 0054 表 4HN106 株对鸡胚的毒力 0055 0056 (9)HN106 株对雏鸡的毒力 0057 按 “OIE” 标准用 4 周龄 SPF 鸡和按欧盟指令标准用 6 周龄 SPF 鸡进行对雏鸡的毒 说 明 书 CN 102093982 B 6 5/6 页 7 力试验。结果见表 5。 0058 表 5HN106 株对雏鸡的毒力 0059 0060 (10)HN106 株的免疫原性试验 0061 用 7 10 日龄 SPF 鸡 20 只， 其中 10 只鸡每只皮下接种 1 10 稀释的 HN106 株 尿囊液， 另 10 只皮下。
21、接种生理盐水作对照， 分别隔离饲养， 21 天后采血分离血清， 用标准 H9 抗原作 HI 试验。结果见表 6。 0062 表 6HN106 株的免疫原性 0063 0064 (11)HN106 株抗原特异性试验 0065 将 HN106 毒种分别与禽流感 H5、 H7、 H9亚型及 ND、 EDS76、 M41抗血清进行 HI 试验。 0066 将 HN106 株尿囊液用灭菌生理盐水作 1 1000 稀释， 与等量 AIV H9亚型特异抗 血清混合， 经 37中和 60min， 接种 SPF 鸡胚 10 枚， 每胚尿囊腔注射 0.2mL， 同时设 H9抗血 清中和 NDV 的对照和 HN10。
22、6 株尿囊液 1 1000 稀释未经中和的对照 ( 接种 0.1mL)。HN106 株对 H9亚型等特异抗血清的 HI 试验， 结果见表 7 ； HN106 株经 H9特异抗血清中和作用后鸡 胚接种试验的结果见表 8。 0067 表 7HN106 株对 AIV H9、 H7、 H5亚型特异的抗血清和对 ND、 EDS76、 M41抗血清的 HI 试 验结果 0068 0069 表 8HN106 株经 H9特异抗血清作用后的鸡胚接种试验 0070 说 明 书 CN 102093982 B 7 6/6 页 8 0071 * 为非正常死亡鸡胚 ； # 为 EDS76病毒接种的鸭胚。 说 明 书 CN 102093982 B 8 。