技术领域
本发明涉及一种来源于罗汉果的SgCAS基因的突变体及其在生产罗汉果甜苷V中 的用途。
背景技术
罗汉果(Siraitigrosvenorii)中含有多种皂苷成分，目前已报道分离到了20多 种罗汉果葫芦烷型四环三萜型皂苷成分，其中罗汉果苷IV、苷V和赛门苷I是迄今为止报道 的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分，分别为蔗糖甜度的392，425和563倍。在所有甜苷中， 罗汉果苷V的含量最高，约占总皂苷含量的20％；同时作为主要的活性成分，罗汉果苷V具有 镇咳、祛痰，解痉活性，具有抗癌，抗炎，降血糖等作用，使之成为为数不多的从中药中发掘 出来的具有治疗功能的新型甜味剂。罗汉果甜苷具有甜度高，热量低，无毒，口感好，没有甜 菊苷的特殊苦味，2008年美国可口可乐公司新推出的饮料中添加了罗汉果苷V，2011年中国 2家公司的罗汉果提取物也通过了通过美国FDA的GRAS认证，成功打入美国市场。但是由于 市场上罗汉果苷提取物的价格居高不下，因此在食品、保健品、日用健康用品方面无法与蔗 糖竞争。
然而，罗汉果苷V的分布具有组织特异性，只存在果实中，而且含量很低仅占果实 干重的1％左右，占鲜果含量的3-4‰。常规杂交育种的手段来提高罗汉果苷V的含量难度 大，周期长。首先，野生的罗汉果资源目前几乎灭绝，而栽培品种单一化严重，遗传背景狭窄 (遗传相似系数在0.9以上)；其次，异花授粉的罗汉果从遗传角度来看是高度杂合的，近交 后代性状衰退明显，培育纯合型的品系难度极大；第三，罗汉果的品质属于数量性状，受微 效的多基因控制，如果将多个亲本上的优良性状集中于某一个品种的培育周期过长；再者， 作为雌雄异株的罗汉果，其实生苗的后代雌雄比例约为3:7，利用目前的手段无法在开花前 判定其性别分化，每株植株在种植时占地面积约为4.5cm2，大量组合高品质形状来筛选单 株实生苗将极大浪费土地和资金；最后，采用多倍体育种的方法出现果实明显变小的问题。 近年来，提高罗汉果苷含量的研究成为热门的研究方向。据统计，每提高1‰果实中罗汉果 苷V含量可降低10％的提取成本。因此，我们认为从罗汉果苷V生物合成的相关酶入手，通过 研究相关酶的基因功能，来调控解决罗汉果苷含量低的难题，将是一条更为直接、更加有效 的新途径。
现有的报道一定程度预测了罗汉果甜苷生物合成途径，首先经甲羟戊酸(MVA)和 甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)，IPP和DAMPP之间可以相互转化，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。这 是三萜皂苷生物合成共有的途径，其中在MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还 原酶(HMG-CoAreductase,HMGR)催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲羟 戊酸(mevalonate,MVA)，这一步反应是需要依赖于NADP的不可逆转的过程，HMGR是该途径 中的关键限速酶，可以受洛伐他汀的专一性抑制。IPP和DMAPP能够被牻牛儿基焦磷酸合酶 (GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下 进而形成法呢基焦磷酸酯(FPP)，然后再经角鲨烯合酶(squalenesynthase,SQS)的催化形 成角鲨烯(Squalene)，SQS是异戊二烯途径中的限速酶,是一类与膜结合的蛋白，是具有两 种功能的酶，首先能够催化2分子的法尼基焦磷酸(FPP)缩合生成前角鲨烯二磷酸 (presqualenediphosphate,PSPP)，接着在NADPH和Mg2+存在的情况下将PSPP转化成角鲨 烯，作为植物中甾醇和三萜化合物的第一个前体。SQS是三萜类物质生物合成途径中的关键 酶，其表达高低及活性强弱直接决定了下游产物的含量高低，目前已经在细菌、酵母、灵芝、 动物、人类和植物中得到克隆分离。角鲨烯环氧化酶的继续作用形成2,3-氧化角鲨烯，该物 质是植物甾醇和三萜皂苷合成的共同前体物质，氧化角鲨烯的环化一步决定了下游的走 向，是植物甾醇还是三萜皂苷。在罗汉果中，葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienolsynthase， CS)和环阿乔醇合酶(cycloartenolsynthase，CAS)基因同属于角鲨烯环化酶基因家族，其 中CS能够环化成葫芦二烯醇，经过一系列的加羟基、加糖基反应生成罗汉果苷，是甜苷合成 中的关键一步；而CAS能够环化成环阿乔醇，在此基础上经过基部修饰得到植物甾醇，CAS是 植物甾醇及甾体类化合物合成的第一个关键酶。
异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，葫芦二烯醇合酶基因最初在 西葫芦(Cucurbitapepo)中报道，能够以2,3-氧化角鲨烯作为底物，催化生成葫芦二烯醇， 同时证明葫芦二烯醇合酶催化的反应是独立于环阿乔醇合酶环化形成甾醇的另一途径，因 此提高其催化功能潜力很大。目前已经报道的CS基因只在西葫芦、黄瓜和罗汉果中，在黄瓜 中也已经证明CS具有角鲨烯环化酶的功能。
至少从上述已知的通路来看，SgCAS竞争SgCS的底物，争夺其碳骨架，朝着植物甾 醇的方向发展，间接影响了罗汉果苷的合成，因此，可以预期的是，CAS基因和CS基因将是罗 汉果苷V生物合成的关键节点。
罗汉果在分子生物学方面的研究多见于通过分子标记的方法来研究遗传多样性、 亲缘关系等，相对于其他药用植物的研究稍显缓慢，目前对于罗汉果功能基因的研究鲜有 报道，虽然GENEBANK中已经可以检索到罗汉果葫芦二烯醇合酶(SgCS)、罗汉果环阿乔醇合 酶(SgCAS)的序列结构，但是，发明人通过分子生物学的手段以该现有的基因对原核和真核 宿主进行改造时，发现该基因转入宿主后，无法产生有活性的蛋白，因此，需要通过一定的 分子生物学功能改进或分子进化方法，对该基因序列进行改进和优化，以克服罗汉果苷V生 物合成途径中的关键难点。
发明内容
本发明首先涉及一种来源于罗汉果的SgCAS基因突变体蛋白，及其功能片段或活 性结构域，所述的SgCAS基因突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
本发明还涉及所述的SgCAS基因的突变体的蛋白的编码序列，及其功能片段，所述 的编码核苷酸序列优选的如SEQIDNo.1所示。
本发明还涉及所述的罗汉果SgCAS基因的突变体在催化角鲨烯底物合成环阿乔醇 中的应用，所述的应用包括，将所述的突变体基因通过基因工程手段转入真核酵母宿主、植 物宿主，使所述的突变体高表达，以催化鲨烯底物合成环阿乔醇。所述的酵母宿主优选为酵 母菌株IVF，所述的植物宿主优选为烟草、拟南芥或罗汉果。
本发明还进一步涉及所述的突变体基因在合成罗汉果甜苷V中的应用，所述的应 用包括，以所述的突变体基因模板，构建植物干扰载体，下调宿主中SgCAS基因的表达量，从 而增加罗汉果甜苷V的生物合成，所述的宿主为能够通过特定的生物合成途径合成罗汉果 甜苷V的酵母或植物宿主，优选为酵母、烟草、拟南芥或罗汉果。所述的植物干扰载体中含有 的干扰序列优选如SEQIDNo.3所示。所述的植物干扰载体优选为pBI121载体。
附图说明
图1，重组质粒pYES2-SgCAS的双酶切电泳检测。
图2，GC-MS方法检测含有pYES2-SgCAS重组质粒的酵母的次生代谢产物：2A：阴性 对照；2B：环阿乔醇标准品；2C：含有重组质粒的酵母次生代谢产物。
图3，GC-MS方法检测含有未突变SgCAS重组质粒的酵母的次生代谢产物：3A：阴性 对照；3B：含有未突变蛋白编码序列的酵母次生代谢产物。
图3，SgCAS正向干扰片段的PCR扩增：M：DNA标记；1-6：SgCAS正向干扰片段。
图4，SgCAS反向干扰片段的PCR扩增：1,2：SgCAS正向干扰片段；M：DNA标记。
图5，SgCAS基因在野生型和转基因烟草中的表达变化。
图6，干扰载体对烟草中CAS基因表达的影响。
具体实施方式
实施例1，SgCAS基因的生物信息学分析及突变体序列的获得
以SgCAS-ORF序列作为分析材料，利用ExPAEyProteomicsServer的在线软件 Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)对SgCAS基因编码的蛋白进行理化性质 的预测，Interproscan在线软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)预测蛋白 的保守结构域，利用SOPMA在线软件(http://www.ibcp.fr/predict.html)对SgCAS编码的 蛋白进行二级结构的预测，经在线软件SWISSMODEL(http://swissmodel.expasy.org/)进 行三级结构的预测，通过SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)，PSORT(http://wolfpsort.org/)和TMHMMServerv.2.0软件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)来预测该蛋白的信号肽，亚细胞定位及跨膜区的位置。 利用NCBI的BLAST来分析该基因编码的蛋白与其他物种中该蛋白的同源性，并通过MEGA6软 件构建Neighbor-joining系统进化树。通过与化学修饰法结合的对蛋白结构进行突变预测 的方法(例如可使用SIFT(SortingIntolerantFromTolerant)程序来评价和预测点突变 对蛋白质功能的影响等)，获得了经程序预测的功能优化的突变蛋白序列，方法如下：
利用改良Trizol法提取罗汉果幼果中RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性 和质量的鉴定，Nanodrop对RNA的得率和纯度进行检测。以RNA为模板，用PrimeScriptTMFirstStrandcDNASynthesisKit(大连宝生物公司)反转录成cDNA第一链，反应体系如 下：
总RNA≤5μg
Oligo(dT)1μL
dNTPMix1μL
ddH2O补齐至10μL
Total10μL
震荡离心，65℃反应5min。在上述反应体系中加入以下成分：
5XBuffer4μL
PrimeScriptRTase1μL
RNaseInhibitor0.5μL
ddH2O4.5μL
Total20μL
震荡离心，42℃60min，70℃15min，得到cDNA第一链分装，于-20℃冰箱中冷冻保存 以备用，然后以总的cDNA为模板，PCR克隆得到与GenBank中序列相同的cDNA。
以cDNA为模板设计引物(如下表1，小写的碱基表示设计的点突变)，以SgCAS-F1， SgCAS-R1和SgCAS-F2，SgCAS-R2分别进行第一轮PCR反应，获得2种PCR片段，经胶回收后混 合作为第二轮的PCR模板。然后以SgCAS-F1和SgCAS-R2作为引物，扩增全长片段得到977和 991位碱基突变的基因序列，经测序验证。
表1突变引物的设计
突变1SgCAS-F15’-ATGTGGCATCTCAAGATTGG-3’326和331处氨基酸突变977bp 和991bp碱基的突变
SgCAS-R15’-GAAgtcCACAGAACATCCcgaA-3’
SgCAS-F25’-cagGATGTTCTGTGGgctTCGCT-3’
SgCAS-R25’-TTAAGGGGCTCGCAGTACC-3’
突变2SgCAS-F15’-ATGTGGCATCTCAAGATTGG-3’538处氨基酸突变1613bp碱 基的突变
SgCAS-R15’-GTCGTTCATAAGTgacAAAGC-3’
SgCAS-F25’-TGATGGTGGCTTTgtcACTTAT-3’
SgCAS-R25’-TTAAGGGGCTCGCAGTACC-3’
突变3SgCAS-F15’-ATGTGGCATCTCAAGATTGG-3’718处氨基酸突变2153bp碱基 突变
SgCAS-R15’-CTCCATCGTCCATCTGagaATT-3’
SgCAS-F25’-TtctCAGATGGACGATGGAG-3’
SgCAS-R25’-TTAAGGGGCTCGCAGTACC-3’
突变4SgCAS-R15’-AACTTTGATTTGTGGTAGATTtAC-3’---249bp碱基优化
SgCAS-F25’-CTCATCCTTTGTaAATCTACC-3’
同样的方法进行1613位碱基、2153为碱基和249位碱基的突变，最后得到最终的突 变序列，经测序验证。最后得到的突变SgCAS基因的核苷酸序列如下：
该序列结构如SEQIDNO.1所示：
ATGTGGCATCTCAAGATTGGGGCCGATACCGTGCCTGCCGATCCTTCTAACGCCGGCGGATGGCTCTCAACTCTCAA CAACCACGTGGGTCGCCAAGTTTGGCATTTTCATCCCGAACTCGGCACCCCGGAAGATCTTCAGCAAATACAACATG CTCACCAGCGCTTCTCGGACCACAGGTTCGAGAAGAAGCATAGTGCCGATCTCCTCATGCGGATGCAGTTTGCAAAG GAGAACTCATCCTTTGTAAATCTACCACAAATCAAAGTTAAAGATAAAGAAGACGTGAAAGAGGAGGCAGTAACTGG CACTCTAAGAAGGGCTATCAATTTTTATTCAACAATCCAGGCAGATGATGGTCACTGGCCTGGAGATTATGGTGGTC CAATGTTTCTAATTCCTGGTTTGGTCATTACTCTTTCCATTACTGGCGCTTTGAATGCCGTCTTATCTACAGAGCAT CAGCATGAGATTTGCAGATATCTTTACAATCATCAGAATAAAGATGGGGGATGGGGTTTACATATTGAAGGCCCAAG CACAATGTTCGGTTCTGTGCTGAATTATGTTACTTTGAGGTTGCTTGGTGAAGAAGCTGAAGATGGACAGGGGGCTG TGGACAAAGCACGTAAATGGATCTTGGACCATGGTGGTGCAACTGCGATTACTTCTTGGGGGAAAATGTGGCTCTCA GTACTTGGAGTATATGAATGGACTGGAAATAATCCGCTTCCTCCAGAATTATGGCTATGGCCTTATCTTCTCCCTTG TCATCCAGGAAGGATGTGGTGTCACTGTCGAATGGTATACTTGCCCATGTGTTATCTGTATGGGAAGAGATTTGTTG GTCCTATAACGCCTATAATTAGATCTTTAAGGAAGGAACTTTATCTTGTCCCTTATCATGAAATTGATTGGAATAAG GCTCGCAATCAGTGTGCAAAGGAAGATCTGTATTACCCACATCCGCTGGTTCAGGATGTTCTGTGGGCTTCGCTGCA CTATGTCTATGAGCCTCTTTTTATGCGTTGGCCTGCAAAAAGACTGAGGGAAAAGGCTTTGCAGAGTGTAATGCAGC ATATCCACTATGAAGATGAAAATACTCGGTATATATGCATTGGGCCTGTCAACAAGGTACTAAATATGCTTTGCTGT TGGGTGGAGGATCCACATTCAGAGGCATTCAAATTGCATATTCCAAGAATCTATGATTATTTGTGGATTGCTGAAGA TGGCATGAAAATGCAGGGTTATAATGGAAGTCAATTATGGGATACTGCATTTGCTGTTCAAGCCATCATGTCAACTA AGCTTGCTGAAGAATATGGAACAACTTTAAGAAAGGCGCACAAGTATATAAAAGACTCCCAGGTCGTAGAAGATTGC CCTGGGGATTTACAAATTTGGTACCGTCATATTTCAAAAGGTGCATGGCCATTTTCAACTGCAGATCATGGATGGCC CATCTCTGACTGCACTGCTGAAGGTTTGAAGGCTGTCCTTTTATTATCAAAGCTTCCATCTGAATTAGTAGGGAAGT CAATTGATGAAGAACGGATATACGATGCTGTAAATGTCATCCTGTCCTTACAGAATACTGATGGTGGCTTTGCCACT TATGAACTGACCAGATCATACCGGTGGCTGGAGCTAATGAACCCTGCTGAAACTTTCGGCGATATTGTCATTGACTA CCCATATGTCGAGTGTACCTCAGCGGCAATTCAAGCACTTGCAATGTTCAAGAAATTATATCCTGGTCATAGAAGGG ATGAAATTGATAATTGTATTGCTAAAGCTGCGGACTTCCTTGAAAGCATACAAGCAACTGATGGATCTTGGTATGGA TCTTGGGGAGTCTGCTTCACCTATGGCGGTTGGTTTGGGATAAGGGGTCTGGTTGCTGCTGGAAGGAGATACGATAA CTGCTCTAGCCTTCGTAAAGCTTGTGATTTCCTGTTGTCTAAAGAGCTTGCAGCAGGTGGTTGGGGAGAAAGTTATC TTTCCTGCCAGAATAAGGTGTACACAAATCTTAAAGATGATAGGCCACATATCGTCAATACAGGTTGGGCTATGTTA TCCCTCATCGATGCTGGGCAGTCTGAGAGAGATCCAACACCATTACACCGTGCAGCAAGGGTATTAATTAATTCTCA GATGGACGATGGAGATTTTCCTCAAGAGGAGATCATGGGAGTGTTCAACAAGAACTGTATGATTAGTTATGCTGCTT ACCGCAACATTTTCCCTATATGGGCCCTTGGGGAATATCGCTGTCGGGTACTGCGAGCCCCTTAA
其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：
MWHLKIGADTVPADPSNAGGWLSTLNNHVGRQVWHFHPELGTPEDLQQIQHAHQRFSDHRFEKKHSADLLMRMQFAK ENSSFVNLPQIKVKDKEDVKEEAVTGTLRRAINFYSTIQADDGHWPGDYGGPMFLIPGLVITLSITGALNAVLSTEH QHEICRYLYNHQNKDGGWGLHIEGPSTMFGSVLNYVTLRLLGEEAEDGQGAVDKARKWILDHGGATAITSWGKMWLS VLGVYEWTGNNPLPPELWLWPYLLPCHPGRMWCHCRMVYLPMCYLYGKRFVGPITPIIRSLRKELYLVPYHEIDWNK ARNQCAKEDLYYPHPLVQDVLWASLHYVYEPLFMRWPAKRLREKALQSVMQHIHYEDENTRYICIGPVNKVLNMLCC WVEDPHSEAFKLHIPRIYDYLWIAEDGMKMQGYNGSQLWDTAFAVQAIMSTKLAEEYGTTLRKAHKYIKDSQVVEDC PGDLQIWYRHISKGAWPFSTADHGWPISDCTAEGLKAVLLLSKLPSELVGKSIDEERIYDAVNVILSLQNTDGGFAT YELTRSYRWLELMNPAETFGDIVIDYPYVECTSAAIQALAMFKKLYPGHRRDEIDNCIAKAADFLESIQATDGSWYG SWGVCFTYGGWFGIRGLVAAGRRYDNCSSLRKACDFLLSKELAAGGWGESYLSCQNKVYTNLKDDRPHIVNTGWAML SLIDAGQSERDPTPLHRAARVLINSQMDDGDFPQEEIMGVFNKNCMISYAAYRNIFPIWALGEYRCRVLRAP
实施例2，利用酵母表达SgCAS突变基因生产环阿乔醇
酵母表达载体pYES2，酵母菌株IVF购自Invitrogen公司；酵母提取物，蛋白胨，琼 脂粉购自Sigma公司；其他常规药品均为进口或国产的分析纯试剂。
YPD固体培养基配方：1％酵母提取物，1％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉
酵母提取缓冲液：称取HEPES1.192g，75mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.1％(v/v) TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，调节pH至7.4，定溶于100mL。
SD固体培养基：0.67％酵母无氨基酸培养基，0.077％Ura缺失氨基酸混合物 (Clotech)，2％半乳糖
SDG液体培养基：0.67％酵母无氨基酸培养基，0.077％Ura缺失氨基酸混合物，2％ 半乳糖
1.酵母表达载体pYES2-SgCAS的构建
以含有所述SgCAS突变基因的阳性克隆为模板，设计含有酶切位点(HindIII和 BamHI)的引物，引物序列如下：
上游引物：5’-AAGCTTATGTGGCATCTCAAGATTGG-3’
下游引物：5’-GGATCCTTAAGGGGCTCGCAGTACC-3’
PCR克隆含HindIII和BamHI的SgCAS全长基因片段。琼脂糖凝胶电泳分离检测，胶 回收目的条带，连接pMD19-T载体转化大肠杆菌，挑选阳性克隆并通过测序验证。
酵母表达载体pYES2上含有GAL1启动子，提取测序正确的阳性克隆质粒与酵母表 达载体质粒，在37℃用HindIII和BamHI对2种质粒进行双酶切反应，体系如下：
阳性克隆质粒≤2μgpYES2载体质粒≤2μg
NEBBuffer25μLNEBBuffer25μL
BSA1μLBSA1μL
HindIII1μLHindIII1μL
BamHI1μLBamHI1μL
ddH2O补至50μLddH2O补至50μL
酶切反应3h后，将酶切产物进行凝胶电泳分离，凝胶回收2种产物中的目的条带， 在T4DNA连接酶的作用下按适当比例进行连接反应，反应体系如下：
1XT4DNA连接酶反应Buffer1μL
pYES2载体酶切产物1μL
目的基因酶切产物3μL
T4DNA连接酶1μL
ddH2O补至10μL
16℃反应过夜。连接后的产物全量转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含Amp(50mg/ L)的LB固体培养基上筛选，挑取单菌落进行菌落PCR检测，经验证，23个单菌落中得到7个阳 性克隆，经酶切鉴定得到正确结果。最后将阳性克隆经测序验证正确，得到测序正确的载 体，命名为SgCAS-pYES2(见图1)，在菌液中加入等体积的30％甘油(终浓度15％)冷冻保存 于-80℃。
2.pYES2-SgCAS基因载体转化酵母IVF
转化重组质粒SgCAS-pYES2到酵母菌株IVF中，具体操作步骤如下：
1)将冻存于-80℃冰箱中的酵母菌株IVF取出，于YPD固体培养基上划板活化菌株， 在30℃培养箱中培养。挑取单菌落接种于2mL的YPD液体培养基中，30℃条件下250rpm震荡 培养过夜，至OD600达到1以上。吸取菌液转接至20mL的新鲜YPD液体培养基中，控制OD600低 于0.3，然后在30℃培养箱中继续培养3h，当OD600＝0.4～0.6时可以用来转化。
2)将菌液转移到灭菌的离心管中，4℃下2,500rpm离心5min收集菌体，弃上清。加 入适量的灭菌水重悬菌体，在4℃下2,500rpm离心5min，收集菌体，弃上清。
3)在菌体中加入1XLiAc-1XTE以重悬菌液，使1XLiAc-1XTE的终浓度为4％(v/ v)，分装到离心管中，每管100μL。
4)转化液体系如下表所示，充分混匀。
100μL重悬菌液
1μgDNA连接产物
100μg变性鲑鱼精
700μL1XLiAc-1XTE-40％PEG3350
5)混匀后的转化液于30℃培养箱中200rpm振荡培养30min。
6)在转化液中加入灭菌的DMSO88μL，轻轻混匀，然后在42℃水浴热击7min。
7)12,000rpm高速离心5s后弃上清，加入1mL的1XTE重悬菌体，重复离心弃上清。
8)加入50μL的灭菌水悬浮菌体，涂布于SD固体培养基平板上，30℃培养箱中静置 培养36-48h。
9)挑取单菌落，接种到5mL含有半乳糖的液体酵母培养基SDG中，200rpm30℃下振 荡培养36-48h，充分诱导SgCAS蛋白的表达。
3.提取酵母的次生代谢产物
检测培养基的OD600＝0.8-1.0时，4℃3,000rpm离心5min收集菌体并称重。在酵母 菌体中，按照2mL/g的比例加酵母蛋白提取缓冲液，然后加入等体积的玻璃珠，在震荡器上 震荡1min后立即置于冰上，该步骤重复5次，以充分裂解酵母菌体。4℃条件下12,000rpm离 心10min，吸取含有酵母蛋白的上清液到预冷的新离心管中，该步骤重复一次。
通过碱裂解法提取酵母中的次生代谢产物，进行GC-MS检测分析，结果如图2显示， 含有重组子SgCAS-pYES2的酵母代谢产物在20.20min出现一个明显的峰，与环阿乔醇标准 品的峰一致，而在不含重组质粒的酵母次生代谢产物中没有该峰的出现。从该峰的质谱结 果来看，样品与标准品的质谱图一致，由此证明SgCAS能够在异源的酵母中表达，而且具有 能够催化2,3-氧化角鲨烯生成环阿乔醇，说明突变的罗汉果SgCAS具有角鲨烯环化酶的功 能。
相比于本发明所构建的突变后SgCAS基因，使用相同的转基因方法和酵母宿主，转 入未进行突变SgCAS基因后，对于酵母次生代谢产物的检测结果表明，未突变的SgCAS基因， 在相同的酵母宿主中无法合成葫芦二烯醇(见图3)。
实施例3，SgCAS植物RNA干扰载体的构建及转化烟草的效果
本节试验选用红花烟草(Nicotianatabacum)作为遗传转化的材料，植物干扰载 体pBI121(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，农杆菌GV3101(Invitrogen公司)。 限制性内切酶BamHI、PacI、SalI和AscI购自NEB(北京)有限公司。
烟草遗传转化培养基
MSB0基本培养基的配置(MS+B5基本培养基)：
大量元素(10X母液I)：
成分浓度
KNO319.0g/L
NH4NO316.50g/L
KH2PO41.7g/L
MgSO4·7H2O3.7g/L
CaCl2·2H2O4.4g/L
微量元素(1000X母液II)：
成分浓度
KI0.83g/L
H3BO36.2g/L
ZnSO4·7H2O8.6g/L
Na2MnO4·2H2O0.25g/L
CuSO4·5H2O0.025g/L
CoCl2·6H2O0.025g/L
MnSO4·4H2O22.3g/L
有机元素+铁盐(100X母液III)：
成分浓度
盐酸硫胺素(维生素B1)1g/L
盐酸吡哆醇(维生素B6)0.1g/L
烟酸0.1g/L
Na2-EDTA·2H2O3.73g/L
FeSO4·7H2O2.78g/L
先按上述配方配制MS无机大量元素母液I(10X)，微量元素母液II(1000X)，有机元 素+铁盐母液III(100X)。取10X的大量元素母液100mL，100X的有机+铁盐母液10mL，1000X的 微量元素母液1mL，称取肌醇0.1g，蔗糖30g，加水定容至1L。调整pH值在5.8-6.0之间，加入 琼脂粉8g，高压蒸汽灭菌后分装。
分化培养基(MSB1)：MSB0+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA
筛选培养基(MSB2)：MSB0+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+500mg/LCef+50mg/LKan
继代培养基(MSB3)：MSB0+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+200mg/LCef+50mg/LKan
生根培养基(MSB4)：MSB0+2.0mg/L6-BA+200mg/LCef+50mg/LKan
1.SgCAS基因植物干扰载体的构建
1)分析SgCAS基因自身的酶切位点，结合pBI121载体上自带的酶切位点，我们采用 BamHI和PacI作为正向插入片段1上下游引物的酶切位点，SalI和AscI作为反向插入片段2 上下游引物的酶切位点，其中正向插入片段1和反向插入片段2是反向互补序列分别插入到 pBI121载体GUS的两侧，利用软件进行干扰片段的引物设计，PCR扩增干扰正反向片段。
表2SgCAS基因干扰载体构建的引物
名称引物序列
SgCAS-gr1-1CGCGGATCCTGCCACTTATGAACTGACC
SgCAS-gr1-2CC/TTAATTAACCCTTATCCCAAACCAAC
SgCAS-gr2-1GCGTCGACCCCTTATCCCAAACCAAC
SgCAS-gr2-2GGCGCGCCTGCCACTTATGAACTGACC
干扰序列为SEQIDNo.3所示:
TGCCACTTATGAACTGACCAGATCATACCGGTGGCTGGAGCTAATGAACCCTGCTGAAACTTTCGGCGATATTGTCA TTGACTACCCATATGTCGAGTGTACCTCAGCGGCAATTCAAGCACTTGCAATGTTCAAGAAATTATATCCTGGTCAT AGAAGGGATGAAATTGATAATTGTATTGCTAAAGCTGCGGACTTCCTTGAAAGCATACAAGCAACTGATGGATCTTG GTATGGATCTTGGGGAGTCTGCTTCACCTATGGCGGTTGGTTTGGGATAAGGG
2)分别胶回收干扰正反向片段，连接到pMD19-T载体上，筛选阳性克隆，测序验证。 将带有正反向干扰片段的质粒分别命名为pMD19-T-SgCASgr1和pMD19-T-SgCASgr2，pMD19- T-SgCASgr3和pMD19-T-SgCASgr4。
3)先将测序正确的阳性克隆质粒pMD19-T-SgCASgr1与pBI121载体通过BamHI/ PacI进行双酶切，37℃反应3h。
4)将酶切产物进行凝胶电泳分离检测，切胶回收目的片段。
5)将含有酶切位点的正向干扰片段与pBI121载体通过T4DNA连接酶在16℃下反应 过夜，反应体系如下：
T4DNA连接酶1μL
Buffer1μL
目的片段：pBI121载体(摩尔比)10:1
ddH2O补齐至10μL
将正向干扰片段连接到pBI121载体的GUS上游。
6)将测序正确的质粒pMD19-T-SgCASgr2与上一步连接有正向干扰片段的载体，用 SalI和AscI一起进行双酶切反应，酶切后的目的片段连接到上述载体的GUA下游。(
7)将连接产物全量转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含Kan(50mg/L)的LB培养 基上筛选阳性重组子，挑取单菌落通过菌落PCR及测序验证，得到阳性克隆。将构建成功的 干扰载体命名为SgCAS-pBIRNAi。
2.SgCAS-pBIRNAi载体转化农杆菌感受转化农杆菌GV3101；
1)取出冻存于-80℃冰箱的农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化。
2)取10μL的重组质粒加入到50μL感受态细胞中，全量吸出转入到0.2cm的电转杯 (BIO-RAD)中。
3)在电转仪MicroPulser(BIO-RAD)上进行电击转化，采用Ec2转化细菌模式，电压 为2.5kV，时间为4.5ms，待电转杯带金属两侧与电转仪的金属片完全接触，电击直到听到 “咔”省完成电转化。
4)在电转杯中加入400μL的LB液体培养基，反复吹吸。重复该步骤一次，全量转入 EP管中。
5)将EP管稍作离心，弃部分上清，取适量菌液涂布于含Kan(50mg/L)的LB固体培养 基上，28℃静置培养。
3.农杆菌GV3101介导的烟草转化
1)用75％的乙醇将烟草种子浸泡30s，然后用2％的NaClO2消毒10min(期间震荡以 使种子消毒彻底)，最后用无菌水冲洗4-5次，1min/次，点种于MS基本培养基上。4℃春化4-7 天后，置于组培室培养，至5-6片真叶长出，以备转化用。
2)挑取含有重组质粒pBI121-SgCS的农杆菌单菌落，接种于含Kan(50mg/L)的LB液 体培养基中，于28℃培养箱中230rpm振荡培养36-48h达到对数生长期。
3)取烟草幼嫩的新鲜叶片，用刀切成小块儿，置于MS分化培养基上，28℃下预培养 2-3天，培养条件为光周期16/8h，光照强度2,000Lux。
4)用MS培养液将对数生长期的农杆菌稀释至OD600＝0.4-0.8之间时可以做侵染 用，加入乙酰丁香酮使终浓度为100μM/L，以诱导农杆菌上的Vir基因活化促进外源基因的 整合从而提高转化效率。
5)将预培养后的烟草叶片侵染农杆菌菌液3min，用无菌滤纸吸去叶片周围附着的 菌液，然后将叶片置于MS基本培养基上，28℃黑暗条件下共培养2天。
6)将共培养后的叶片用含Cef(500mg/L)的无菌水冲洗3-5次，用无菌滤纸将周围 的水吸干，然后置于含Cef(500mg/L)和Kan(50mg/L)的MS分化培养基上，于28℃16/8h的光 周期和2,000Lux光照强度条件下正常培养。每两周更换一次继代培养基，待新芽长出后，移 至新的含有Cef(500mg/L)和Kan(50mg/L)的MS生根培养基上，促进生根长成完整植株。
结果显示，将构建成功的干扰载体SgCAS-pBIRNAi转化到农杆菌中，由农杆菌介导 分别转化烟草叶片，在含卡那霉素(50μg/mL)的MS培养基上筛选(图5)，能够在筛选培养基 上生长并且继续培养能够分化成完整的植株，初步认为是阳性转基因烟草。
4.转基因烟草的PCR鉴定及定量分析
称取约0.1g的新鲜烟草叶片，在液氮中迅速研磨，按照植物基因组DNA提取试剂盒 的说明，提取烟草DNA，琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测烟草DNA的纯度和浓度。以载体自身 的35S引物‘ACTATCCTTCGCAAGACCC’和引物SgCAS-gr1-2扩增正向干扰片段，用载体上的终 止子引物‘GATAATCATCGCAAGACC’和引物SgCAS-gr2-1来扩增反向干扰片段。通过PCR方法检 测是否将目的片段转入烟草，以验证是否为真正的转基因株系。
按照EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒说明，提取PCR鉴定的阳性烟草中总 RNA，经DNaseI消化去除基因组DNA后，采用宝生物的PrimeScriptTMRTMasterMix反转录 成cDNA，10μL反应体系如下:
5XPrimeScriptRTMasterMix2μL
TotalRNA≤0.5μg
RNaswFreeddH2O补齐至10μL
轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：
37℃15min(反转录反应)，85℃5s(反转录酶的失活反应)。
以Actin为内参基因，内参上下游引物分别为，
上游引物‘CAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC3’和下游引物‘CGATTCCTGGACCTGCCTCATC’。
利用PrimerPremier5软件设计SgCAS基因用于荧光定量的引物，上下游引物分 别为‘CAAATACAACATGCTCACC’和‘TAGCCCTTCTTAGAGTGCC’
采用实时荧光定量PCR的方法检测SgCAS基因在野生型和转基因烟草中的表达量， 反应体系为25μL。
SYBRPremixExTaqTMII(2X)12.5μL
上游引物1μL
下游引物1μL
cDNA模板1μL
ddH2O9.5μL
Total25μL
反应程序为95℃30秒，95℃5秒，59℃10秒，72℃10秒，40个循环，65℃-95℃检测熔 解曲线。采用2-ΔΔct方法对目的基因SgCAS与内参基因Actin的差异表达进行相对定量分 析。
SgCAS基因的荧光定量结果见图6。表明转基因烟草中的SgCAS基因表达量大大降 低，表明该干扰载体可以抑制烟草中CAS基因的表达。
最后，需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质， 并不解释为对本发明保护范围的限定。