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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310034691.2 (22)申请日 2013.01.30 CGMCC No.7079 2012.12.31 C12P 21/00(2006.01) A23L 3/3463(2006.01) A23B 4/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (73)专利权人 大连海洋大学 地址 116000 辽宁省大连市西岗区黄河路 219 号 专利权人 张付云 (72)发明人 张付云 苍桂璐 杨阳 王维才 刘晔 (74)专利代理机构 大连非凡专利事务所 21220 代理人 曲宝威 CN 102093473 A,2011。
2、.06.15, CN 101744837 A,2010.06.23, WO 2008038810 A1,2008.04.03, WO 2006030698 A1,2006.03.23, (54) 发明名称 一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白及其在保鲜方 面的应用和应用方法 (57) 摘要 一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白及该蛋白在水 产品保鲜上的应用和应用方法， 按如下步骤制备 蛋白 ： 取菌株为螠蛏共附生蜂房芽孢杆菌进行培 养， 液体培养基配方为 ： 葡萄糖 40g/L 和蛋白胨 20g/L， pH 调配成 5 ； 每瓶装 150-250mL 液体培养 基， 温度 30-35， 转速为 150-250rp。
3、m, 摇床培养 4-6天 ； 4000r/min下离心去除菌体的发酵液50 下减压浓缩至原体积的二分之一， 加入硫酸铵， 饱 和终浓度为 90%， 4静置过夜， 过滤将沉淀用 PBS 缓冲液溶解后， 再用截留分子量为 3600 道尔顿的 透析袋透析 4 天， 取透析袋中物冷冻干燥， 得螠蛏 源蜂房芽孢杆菌蛋白。 本发明制备过程简单、 成本 低廉。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵天 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 CN 103966286 B 2016.04.27 CN 103966286 B 1/1。
4、 页 2 1.一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白， 其特征在于 ： 按如下步骤制备 ： a.取菌株为螠蛏共附生蜂房芽孢杆菌110 （Bacillus alvei 110） ， 该菌株已于2013年 1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏号: CGMCC No: 7079 ； b.对螠蛏共附生蜂房芽孢杆菌110进行培养， 蜂房芽孢杆菌110的液体培养基配方为 ： 葡萄糖 40 g/L 和蛋白胨 20 g/L， pH 调配成 5 ； c. 蜂房芽孢杆菌 110 发酵条件 ： 每瓶装 150-250 mL 液体培养基， 温度 30-35， 转速 为 150-250 。
5、rpm, 摇床培养 4-6 天 ； d. 在 4000 r/min 的条件下离心去除菌体的发酵液， 在 50下减压浓缩至原体积的二 分之一， 然后加入硫酸铵， 硫酸铵的饱和终浓度为 90%， 4静置过夜， 过滤将沉淀用 PBS 缓 冲液溶解后， 再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天， 取透析袋中物冷冻干燥， 得 螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白。 2.一种根据权利要求 1 所述的螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白在保鲜方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 103966286 B 2 1/3 页 3 一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白及其在保鲜方面的应用和应 用方法 技术领域 0001 本发明涉及食品保鲜领域， 。
6、特别是一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白及其应用和应用 方法。 背景技术 0002 水产品具有低脂肪、 高蛋白的特点， 是合理膳食结构中不可缺少的重要组分， 已成 为人们摄取动物性蛋白质的重要来源。并且鱼、 虾、 蟹等水产品肉质鲜美， 风味独特， 具有 “海鲜” 之美称， 深受广大消费者的青睐。水产品的鲜度是其最主要的品质指标， 是决定其价 格的主要因素， 另外水产品容易腐败变质， 因此加强水产品的保鲜技术研究， 延长水产品的 保质期和货架期， 使新鲜水产品能够远距离运输， 满足非沿海城市消费者对水产品的需求， 对带动水产养殖业的发展具有重大意义。 0003 水产品等目前常用的保鲜剂从来源上分可以分为。
7、化学保鲜剂和天然保鲜剂， 化学 保鲜剂虽然化学防腐剂效果快、 使用方便， 但存在一些安全隐患， 其残留还会引起化学药剂 污染， 因此人们将目光转向对副作用小、 时效长的天然防腐保鲜剂的开发。近年来， 生物保 鲜技术已有了一定的发展， 尤其在生物提取物保鲜方面进展迅速， 但仍存在很多问题。 一是 酶制剂等价格昂贵限制了其推广应用， 二是许使用的天然微生物防腐保鲜剂， 只有乳酸球 菌素和纳他霉素等少数几种， 其他生物技术应用很少， 整体发展缓慢， 品种单一。 发明内容 0004 本发明的目的是担提供一种操作简单、 成本低廉的螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白及其 应用和应用方法， 克服现有技术的不足。 000。
8、5 本发明的一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白， 按如下步骤制备 ： 0006 a. 取菌株为螠蛏共附生蜂房芽孢杆菌 110（Bacillus alvei 110） ， 该菌株已于 2012 年 12 月 31 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏 号 : CGMCC No: 7079 ； 0007 b. 对螠蛏共附生蜂房芽孢杆菌 110 进行培养， 蜂房芽孢杆菌 110 的液体培养基配 方为 ： 葡萄糖 40 g/L 和蛋白胨 20 g/L， pH 调配成 5 ； 0008 c. 蜂房芽孢杆菌 110 发酵条件 ： 每瓶装 150-250 mL 液体培养基， 温。
9、度 30-35， 转速为 150-250 rpm, 摇床培养 4-6 天 ； 0009 d. 在 4000 r/min 的条件下离心去除菌体的发酵液， 在 50下减压浓缩至原体 积的二分之一， 然后加入硫酸铵， 硫酸铵的饱和终浓度为 90%， 4静置过夜， 过滤将沉淀用 PBS缓冲液溶解后， 再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天， 取透析袋中物冷冻干 燥， 得螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白。 0010 本发明的一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白在保鲜方面的应用。 0011 本发明的一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白在保鲜方面的应用方法 ： 将螠蛏源蜂房芽 说 明 书 CN 103966286 B 3 2/3。
10、 页 4 孢杆菌蛋白配制成 200g/mL 的溶液， 用于食品的保鲜， 所述的食品包括水产品。 0012 本发明的螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白制备过程简单、 成本低廉， 从螠蛏共附生蜂房 孢杆菌菌株 110 的发酵液中所提取的蛋白有明显的抑菌保鲜活性， 可以有效的抑制微生物 繁殖， 减缓 pH 值和 TVB-N 值的升高， 减缓色泽气味的改变。因此应用于水产品或其他食品 等的保鲜效果好， 具有产业价值。 0013 本发明中的螠蛏源蜂房芽孢杆菌菌株已于 2012 年 12 月 31 日保藏于位于北京市 朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保 藏号 : 。
11、CGMCC No: 7079。 具体实施方式 0014 本发明一种螠蛏源蜂房芽孢杆菌蛋白， 按如下步骤制备 ： 0015 a. 将生产菌株螠蛏共附生蜂房芽孢杆菌 110 （Bacillus alvei 110） ， 接种于葡 萄糖 40 g/L 和蛋白胨 20 g/L， pH 为 5 的液体培养基中， 每瓶装 150 mL 或 200 mL 或 250 mL 液体培养基， 温度 30或 35， 转速为 150 rpm 或 200rpm 或 250rpm, 摇床培养 4 天或 5 天 或 6 天。该蜂房芽孢杆菌于 2012 年 12 月 31 日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号的。
12、中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏号: CGMCC No: 7079。 0016 b. 用滤纸片法检测发酵液的抑菌活性。大肠杆菌 Escherichia coli（EC） 、 变形 杆菌 Proteus vulgaris（PV） 、 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus （SA） 、 产气杆菌 Enterobacter aerogenes（EA） 和枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis（BS） 均采用现有的牛 肉膏蛋白胨培养基。上述均受赠于中科院大连化学物理研究所。将各菌种分别接种于牛肉 膏蛋白胨液体培养基中， 振荡培养 24 h。
13、 作指示菌。 0017 分别用移液枪取指示菌液 100 L 于牛肉膏蛋白胨固体培养基上， 用无菌三角涂 棒涂抹均匀， 然后用记号笔在培养皿底部的外面将牛肉膏蛋白胨固体培养基培养皿分成三 个区， 每个区分别放入一张滤纸片 （直径 6 mm） ， 再用移液枪移分别取螠蛏共附生菌株 110 的发酵物液、 75%酒精和无菌水各10 L分别滴到每个区的滤纸片中央， 置于37 培养箱 中培养 2 天。做 3 次重复处理， 阳性对照为 75% 酒精， 阴性对照为无菌水。观察指示菌的生 长情况， 测定抑菌圈的直径大小。结果表明 110 菌株发酵液对五种指示菌的抑菌直径分别 为 11 mm, 10 mm, 12。
14、 mm, 11.2 mm, 14.8 mm。 0018 c. 将 4000 r/min 离心去除菌体的发酵液在 50下减压浓缩至原体积的二分之 一， 然后加入饱和度分别为70%、 75%、 80%、 90%和95%的硫酸铵， 4静置过夜， 过滤将沉淀用 蒸馏水溶解后， 再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天， 取透析袋中物冷冻干燥， 配制成形同浓度的溶液， 用滤纸片法 （同上） 检测抑菌活性， 结果表明硫酸铵饱和终浓度为 90% 的沉淀物活性最好， 得率最高， SDS-PAGE 电泳结果表明该沉淀物为蛋白质。 0019 d鲜虾保鲜实验 ： 0020 1） 市场购买的虾立刻用冰块覆盖， 。
15、到实验室后， 挑取鲜度、 大小尽可能一致的新鲜 对虾。清洗干净， 去污， 剔出破损的和鲜度不够的虾 , 去除差异较大的个体， 然后将试样个 体随机分组， 每组 0.5 Kg， 分别用 200 mg/ L 的蜂房芽孢杆菌 110 蛋白溶液， 浸泡处理 5 min, 并以蒸馏水作对照。滤去浸泡液， 将虾装入保鲜盒中， 置于 4冷藏。每隔 24 h 进行 观察， 共观察 10 天。一直到虾的 pH 8.0 或 TVB-N35 mg N per 100 g 样品。 说 明 书 CN 103966286 B 4 3/3 页 5 0021 2） pH 的测定 ： 称取各组样品 5 g， 加入 50 mL 。
16、蒸馏水， 研磨搅拌均匀， 过滤， 取滤液 用酸度计测定， 直接读取 pH 值， 结果如表所示 110 蛋白处理的样品 pH 增加明显低于对照。 0022 0023 3） 挥发性盐基总氮 ( TVB- N) 的测定 ： 按 GB2741- 94 规定 ,TVB- N( mg/ 100 g ) 25 为一级鲜度; TVB- N( mg/ 100 g) 30 为二级鲜度。 结果如表所示110蛋白处 理的样品 TVB- N 增加明显低于对照。 0024 0025 4） 细菌总数的测定 ： 采用国标平板计数培养法， 110 蛋白处理的虾中菌落总数明 显低于对照， 计数的 4 天内均低于对照一个数量级。 。
17、0026 5） 虾的外观特征观察 ： 虾体完整性 , 体表有无光泽、 头胸甲与体节间连接紧密 ; 眼球饱满突出 ; 肌肉纹理清晰 , 有弹性 , 壳不易剥离 ; 具有对虾固有气味 , 无其他异 味。结果从处理后的第二天就能看出菌株 DNN6 蛋白处理的虾外观明显由于对照， 因此 110 蛋白保鲜效果明显。 0027 e 将蜂房芽孢杆菌 110 菌株在上述液体培养基中培养至对数生长期， 4000 rpm 离心收集菌体， 将菌体冷冻干燥， 然后分别用 5 g/kg 与 15 g/kg 的菌体剂量对小鼠进行一 次性灌胃， 结果小鼠无任何异常 ； 同时用 5 g/kg 剂量的蛋白对小鼠进行一次性灌胃， 小鼠 无任何异常。 说 明 书 CN 103966286 B 5 。