一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102094001 A (43)申请公布日 2011.06.15 CN 102094001 A *CN102094001A* (21)申请号 200910200208.7 (22)申请日 2009.12.10 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 上海市农业生物基因中心 地址 201106 上海市闵行区北翟路 2901 号 (72)发明人 余舜武 吴金红 黎佳佳 廖凤贤 罗利军 (74)专利代理机构 上海百一领御专利代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31243 代理人 马育麟 (54) 发明名称 一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法 (57) 摘要 本。

2、发明提供了一种克隆水稻复杂性状相关联 基因的方法。其采用以基因组序列已公开的水稻 自然群体为基础， 采集水稻品种间复杂性状数据， 以这些材料的 DNA 为模板在琼脂糖电泳上进行 ECO-TILLING 方法分析， 将产生的多态性条带转 化为遗传学标记， 然后利用关联分析软件进行连 锁不平衡分析， 确定与性状相关联的基因并克隆 基因。本发明的克隆水稻复杂性状相关基因的方 法， 能够高效、 低成本、 快速地发现与复杂性状关 联的基因。本发明的方法对加快植物复杂性状相 关基因的克隆具有重要意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 。

3、说明书 9 页 附图 2 页 CN 102094007 A1/1 页 2 1. 一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法， 其特征在于， 其采用以基因组序列已公 开的水稻自然群体为基础， 采集水稻品种间复杂性状数据， 以这些材料的 DNA 为模板在琼 脂糖电泳上进行 ECO-TILLING 方法分析， 将产生的多态性条带转化为遗传学标记， 然后利 用关联分析软件进行连锁不平衡分析， 确定与性状相关联的基因并克隆基因。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的ECO-TILLING方法是抽提自然群体 中个体基因组 DNA， 根据基因组注释数据下载各基因家族序列， 将研究的目标基因家族设计。

4、 引物进行 PCR， 然后以一个常规品种材料为对照品种， 进行 PCR 产物两两混合， 经过变性复 性使双链杂交， 最后使用芹菜汁中抽提纯化后的CEL I酶对错配产生的拱环进行酶切， 产生 不同大小的片段。 3.根据权利要求1或2所述方法， 其特征在于， 所述的遗传学标记是经过CEL I酶酶切 后产生的多态性条带。 4. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于， CEL I 酶酶切后在 3琼脂糖凝胶上进行电 泳。 5. 根据权利要求 1-4 任意一项所述方法， 其特征在于， 所述复杂性数据是在自然栽培 条件下或人工模拟自然条件下所采集得到的形态性状数据 ： 产量、 品质、 千粒重、 花期、 。

5、株 高、 穗长和抗旱性， 这些数据在个体间呈连续分布。 6. 根据权利要求 1-5 任意一项所述方法， 其特征在于， 所述的关联分析软件为 TASSEL 软件和 EINGENSTART 软件。 7. 根据权利要求 2 所述方法， 其特征在于， 所述对照品种采用水稻日本晴。 权 利 要 求 书 CN 102094001 A CN 102094007 A1/9 页 3 一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种克隆水稻基因的方法， 具体地说， 涉及一种克隆水稻复杂性状相 关联基因的方法。 背景技术 0002 随着越来越多的植物基因组测序的完成， 从大量的基因组数据中克。

6、隆和挖掘相关 功能基因成为了人们当前的重要工作。 农作物农艺性状大部分为复杂性状， 如产量、 稻米品 质、 千粒重、 花期、 穗长、 株高和抗旱性等， 都由多个基因共同作用来控制， 且每一个基因的 贡献都比较小。针对这部分性状的研究， 目前多半采用全基因组数量性状位点作图方法来 寻找基因组中对该性状有贡献的位点， 但要进一步走到克隆相关基因， 却还要面临难以逾 越的障碍， 包括精细定位、 数量性状的鉴定和单个基因无法表现等。 0003 在自然界长期进化中， 每一种植物都拥有丰富的生态表现型， 从这些生态型中挖 掘有利基因成为当前分子生物学的重要内容。目前人们已经开发了许多分子生物技术手 段， 。

7、利用它们产生的标记来表现物种的多态性。例如简单重复序列 (SSR)、 扩增片段长度多 态性 (AFLP)、 随机扩增多态性 DNA 标记 (RAPD)、 插入缺失标记 (InDel) 和单核苷酸多态性 (SNP) 等， 但这些技术手段仍难以具体到控制植物发育的基因上。 0004 基因组测序技术的发展促使多个植物的基因组测序工作的完成， 针对基因组序列 已经知晓的情况下， 人们开发了一些加快基因组功能研究的新技术。定向诱导基因组局部 突变 (TILLING) 方法可以直接用来发现化学诱导突变造成的基因变异 (HenikoffS， Till BJ， Comai L.TILLING.Traditio。

8、nal mutagenesis meets functional genomics.Plant Physiology.2004， 135(2) ： 630-636.)， 也被用来了解自然群体中个体的多态性， 被称为 ECO-TILLING。 0005 但从当前的研究报告来看， 其多态性仅仅是用来进一步测序验证的基础， 然后利 用序列分析该位点的多态性， 是单核苷酸多态性技术的一种延伸。 到目前为止， 唯一利用该 技术在葫芦植物中寻找到一个简单遗传的抗病基因 (Nieto C， Piron F， Dalmais M， Marco CF， Moriones E， Gmez-Guillamn ML，。

9、 Truniger V， Gmez P， Garcia-Mas J， Aranda MA， Bendahmane A.EcoTILLING for the identification of allelic variants ofmelon eIF4E， a factor that controls virus susceptibility.BMC Plant Biology.2007.7 ： 34.)， 而利用 ECO-TILLING 技术克隆复杂性状相关的功能基因是目前需要克服的关键技术 难题。 0006 另外， 人们也发展了一些分析方法试图解释复杂性状， 从而将生物学标记与形态 性状联系。

10、起来。 尽管这些技术手段能够从一些方面反映这些标记在自然状态中与某些形态 性状相关联， 但这些标记目前多是基因组中随机存在的标记， 到定位到具体的相关基因还 有相当长的距离。 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A2/9 页 4 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种高效、 低成本、 快速克隆水稻复杂性状相关联基因的 方法。 0008 本发明人针对已经完成测序的基因组植物， 利用 ECO-TILLING 分析方法， 直接将 CEL I 酶酶切后的产物在 3琼脂糖凝胶上电泳， 其产生的多态性条带转化为遗传学标记， 并对自然群体的复杂性状进行连锁不平衡分析， 。

11、来寻找并克隆与复杂性状相关的基因。 0009 为了实现本发明目的， 本发明所述克隆水稻复杂性状相关基因的方法， 其采用以 基因组序列已公开的水稻自然群体为基础， 采集水稻品种间复杂性状数据， 以这些材料的 DNA 为模板在琼脂糖电泳上进行 ECO-TILLING 方法分析， 将产生的多态性条带转化为遗传学 标记， 然后利用关联分析软件进行连锁不平衡分析， 确定与性状相关联的基因并克隆基因。 0010 本发明选择已经完成了基因组测序并已公开的水稻自然群体， 能够方便地提取基 因组序列。 0011 所述复杂性数据是该植物在自然栽培条件下或人工模拟自然条件下所采集得到 的形态性状数据， 如产量、 品。

12、质、 千粒重、 花期、 株高、 穗长和抗旱性等， 这些数据在个体间呈 连续分布。 0012 所述的 ECO-TILLING 方法是抽提自然群体中个体基因组 DNA， 根据基因组注释数 据下载各基因家族序列， 将研究的目标基因家族设计引物进行 PCR， 然后以一个常规品种材 料为对照品种进行 PCR 产物两两混合， 经过变性复性使双链杂交， 最后使用芹菜汁中抽提 纯化后的 CELI 酶对错配产生的拱环进行酶切， 产生不同大小的片段。 0013 所述的遗传学标记是经过 CEL I 酶酶切后产生的多态性条带。 0014 CEL I酶酶切后的产物在3琼脂糖凝胶上电泳， 其产生的多态性条带转化为遗传 学。

13、标记。 0015 由于自然群体中个体之间基因组序列有差异， ECO-TILLING 方法就可以将这种差 异在琼脂糖电泳上表现出数量不同或大小不同的DNA条带。 以对照材料为带型0， 将产生的 不同类型的条带依次进行编号， 作为后面分析用的标记， 具体见图 1。 0016 所述的关联分析软件是指按照连锁不平衡分析原理设计的软件， 用来检测不同位 点等位基因间非随机连锁程度。水稻栽培品种主要有籼稻和粳稻两种亚型， 其群体结构 q 值为 2， 可以直接使用免费开放使用的软件有 TASSEL 软件 (Http:/www.maizegenetics. net) 和 EINGENSTART 软件 (htt。

14、p:/genepath.med.harvard.edu/ reich/Software.htm) 来分析与性状相关联的基因。 0017 本发明克隆基因采用本领域熟知的方法进行， 例如 Sambrook 等编著的 分子克 隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor LaboratoryPress， 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 先抽提所采集性状材料的RNA， 然后利用反转录试剂盒转换 成第一链 cDNA， 根据该基因的基因组注释数据设计引物， 采用保真度高的 DNA 聚合酶以第 一链 cDNA 为模板将基因的全长扩增出来， 从而得到。

15、该基因。 0018 实验证明， 本发明的克隆水稻复杂性状相关联基因的方法， 能够高效、 低成本、 快 速地发现与复杂性状关联的基因。传统使用的数量性状位点 (QTL) 作图方法克隆相关基 因， 虽能够找到相关染色体区段， 但仍需构建更大的遗传群体进行精细定位， 并对相关单株 进行性状鉴定， 精细定位后， 还需对 QTL 区间候选基因逐个进行功能鉴定， 工作量大， 成本 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A3/9 页 5 高， 周期长。由于复杂性状由多个基因共同控制， 每一个基因的效应较低， 精细定位准确鉴 定单株十分困难。例如水稻的抗旱性鉴定， 单个基因的替换。

16、常使水稻的抗旱性丧失。而利 用本发明的方法， 只需要将自然群体中所收集的各种生态型的品种进行相关的形态性状的 调查， 然后对不同基因家族进行 ECO-TILLING 分析， 利用 TASSEL 和 EINGENSTART 软件分析 相关基因， 并从相应的生态型品种中进行克隆。这样免去构建需要庞大工作量的遗传群体 和精细定位， 也不用考虑遗传群体中单个个体的性状丢失， 明显缩短基因克隆时间， 降低成 本。本发明方法对加快植物复杂性状相关基因的克隆具有重要意义。 0019 本发明还可以对 microRNA 一类基因进行相关分析， 发现该方法也完全适用于以 基因组序列为基础的非蛋白质编码基因的克隆和。

17、功能发现。 0020 本发明克隆水稻复杂性状相关联基因的方法也同样适用于其他农作物或植物的 复杂性状相关联基因的克隆。 附图说明 0021 图 1 为从芹菜汁中提取的 CEL I 酶在 SDS-PAGE 上电泳图。1， D2000 标记 ； 2-8， 粗 提的 CEL I 酶稀释 5 倍后分别上样 4-10l。 0022 图 2 为所收集的水稻抗旱品种的 ECO-TILLING 琼脂糖凝胶电泳结果。图 2A 为 CEL I 酶切前 PCR 电泳结果， 图 2B 为 CEL I 酶切后电泳结果。图 2B 下方的数字代表该带型所转 化的标记号。 0023 图 3-1、 3-2、 3-3、 3-4 。

18、为所鉴定的 4 个与抗旱相关的基因在 5 个不同品种在干旱胁 迫处理后相对表达量结果。 “前” 表示未进行处理直接取样，“中” 表示 20 PEG 6000 处理 3 小时取样，“后” 表示胁迫后复水 8 小时后取样抽提 RNA， 然后分别对这 4 个基因进行实时 荧光定量 PCR。其中， 242 代表超级旱稻 2-9， 195 代表 SALAK， 220 代表 IR30358， HH3 代表沪 旱 3 号， S1 代表深水稻 1。 具体实施方式 0024 下面实施例进一步描述本发明， 但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发 明。 0025 下列实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常。

19、规方法。 0026 下面实施例中的百分含量， 如无特别说明， 均为质量百分含量。 0027 实施例 1 0028 用本发明的方法克隆与水稻抗旱性相关联的基因 0029 水稻的抗旱性是典型的复杂性状， 有多个基因控制并与环境协作， 通过 QTL 定位 作图方法发现了 200 多个位点控制水稻抗旱性。收集了国内外 150 份各种抗旱品种， 在人 工抗旱鉴定设施上对这些品种进行抗旱性状的鉴定并克隆相关基因。 0030 1. 水稻品种田间试验及性状调查 0031 表型试验在田间梯度水分鉴定岛上进行。 所有供试品种种子(150种品种)浸种催 芽至露白后播种育秧， 并按正常田间管理方式插秧， 单行种植。采。

20、用随机区组设计， 3 重复， 种植 2 行， 每行 18 株， 按行株距 20cm20cm 种植。试验于 5 月 26 日播种， 6 月 23 日移栽， 7 月 31 号开始干旱胁迫， 8 月 31 号恢复灌水。考察基本农艺性状、 抗旱指数和抗旱级别。 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A4/9 页 6 0032 抗旱指数 ( 待测品种干旱胁迫处理产量 / 待测品种未干旱胁迫处理处 理 )( 对照品种未干旱胁迫处理产量 / 对照品种胁迫处理产量 )。其抗旱级别分为 1-9 级， 1 级表示抗旱指数 1.30， 3 级为 1.00-1.29， 5 级为 0.90。

21、-0.99， 7 级为 0.70-0.89， 9 级 为抗旱指数 0.69。 0033 2. 水稻 DNA 抽提 0034 按照 CTAB 法 (Cetyl triethylammonium bromide) 提取水稻叶片总 DNA。DNA 沉 淀物用 1mol/L NaCl 溶解， 并用 RNase A 过夜处理 ； 用 95乙醇、 76乙醇、 95乙醇依次 处理， 纯化 DNA ； TE 溶解 DNA， -20保存。对所选材料进行 DNA 浓度测定， 并根据 PCR 反应 体系， 统一稀释到约 20ng/ul。 0035 3.CEL I 酶的粗提 0036 试验用芹菜由超市购得。取芹菜鲜嫩。

22、茎， 去根茎， 洗净， 擦干。榨汁机榨取芹菜汁 液并去除残渣， 加入 BufferA， 2600g 离心 20min， 弃沉淀。取上清缓慢加入固体 (NH4)2SO4粉 末至浓度为 25， 并轻轻搅拌 30min， 13000-16200g 离心 45min， 弃沉淀。取上清缓慢加入 固体(NH4)2SO4粉末至浓度为80， 并轻轻搅拌30min， 13000-16200g离心1.5h， 弃上清。 加 入BufferB并悬浮沉淀。 BufferB透析过夜， 前三次每隔1h换一次透析液， 最后一次透析过 夜。最后将提取物分装储存于 -80备用。 0037 BufferA ： 100mmol/L 。

23、Tris-HCl， pH 7.7， 100mol/L PMSF( 苯甲基磺酰氟 )。 0038 BufferB ： 100mmol/L Tris-HCl， pH 7.7， 0.5mol/L KCl， 100mol/LPMSF。 0039 4.ECO-TILLING 技术的 PCR 反应体系及后期处理 0040 从水稻基因组数据库中下载转录因子 AP2/EREBP、 heat shocktranscription factor(HSF)、 GROWTH-REGULATING FACTOR(GRF)、 Alfin-like、 CCAAT-HAP3 和 ZIM 家族 220 个基因启动子序列， 设计。

24、并合成引物。 0041 其 20L PCR 反应体系 ： 2L 10 反应缓冲液， 1L 2mmol/LdNTP 混和液， 1L 10mol/L F 引物， 1L10mol/L R 引物， 1U ExTaq( 购自 Takara 公司 )DNA 聚 合酶， 4L 20ng/ul DNA 模板， 11LddH2O。 0042 PCR 扩增程序 ： 94 4min ； 94 30s， 60 30s， 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 10保存。扩增时根据不同引物的 Tm 值调节退火温度， 扩增反应在 Hybaid MBS 0.2S PCR 仪上进行。 0043 对照品种为日。

25、本晴， 与其它品种两两混合。杂交程序 ： 95 10min ； 95降至 85(-2/s) ； 85降至25(-0.1/s) ； 10保存。 杂交反应在Hybaid MBS 0.2S PCR 仪上进行。 0044 CEL I 酶切体系及反应条件 ： 10L 杂交 PCR 产物， 3L 10 反应缓冲液 (100mmol/L Tris-HCl， pH 7.7， 0.5mol/L KCl)， 1L CEL I， 16L ddH2O。 混匀后置于PCR 仪中 45反应 30min。扩增产物用 3琼脂糖凝胶分离。 0045 5.ECO-TASSEL 分析与抗旱相关联基因 0046 将电泳分离开的电泳条。

26、带按照各种带型进行统计， 带型统计方法按照图 2 所 示， 对每一个品种进行标记， 然后将这些数据和抗旱级别数据按照 TASSEL(Http:/www. ) 软件要求输入， 分别对转录因子 AP2/EREBP、 HSF、 GRF、 Alfin-like、 CCAAT-HAP3和ZIM家族220个基因启动子多态性进行关联分析， 以P0.001为显著相关， 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A5/9 页 7 具体结果见表 1。 0047 表 1 干旱处理下转录因子启动子与抗旱性状的关联分析结果 0048 0049 由表 1 可见， 上述获得的 8 个基因属于抗旱性。

27、状相关联的基因。其中 3 个为 AP2/ EREBP 家族基因， 该家族部分成员已经证明与植物的抗逆和乙烯反应有关， 通过关联分析也 发现与抗旱相关的也最多。 GRF和HAP3这两个家族在其他植物研究中也发现与抗旱有相关 的基因。根据我们的结果 Alfin 和 ZIM 是新发现与抗旱相关基因。 0050 6. 抗旱相关基因的克隆及在干旱处理下的 RT-qPCR 0051 选取部分与抗旱关联的基因做表达分析。挑选的材料为沪旱 3 号 ( 上海市农业 生物基因中心 )、 SALAK( 来自印度尼西亚品种 )、 IR30358( 来自国际水稻所 )、 超级旱稻 2-9( 来自中国水稻所 ) 和深水稻。

28、 1( 广西一种地方深水稻 )， 经过抗旱大棚鉴定， 它们的抗 旱级别分别为 1、 3、 7、 7、 9 级。1 级为高抗， 9 级为旱敏感。以 242 做为对照材料。这 5 个品 种材料在 20 PEG 6000 溶液模拟干旱处理 3 小时后观察到， 超级旱稻 2-9( 来自中国水稻 所 ) 和深水稻 1( 广西一种地方深水稻 ) 已经完全卷叶， SALAK 只有小叶卷曲， IR30358 卷叶 不明显， 沪旱 3 号完全不卷叶。深水稻 1 是旱敏感材料， 最先出现卷叶现象， 抗旱材料沪旱 3 号幼苗在处理前后外观基本无差别。8 小时候后复水。 0052 对上述材料取叶片分别用 TIANGE。

29、N 公司试剂盒抽提 RNA， 反转录成 cDNA， 然后 进行定量 PCR。选取用做表达分析的基因有 Os11g14010、 Os07g13170、 Os02g53690 和 Os09g39490。前三个基因与抗旱系数和抗旱指数关联， Os09g39490 与抗旱级别关联。 0053 引物序列及扩增产物长度见表 2。 0054 表 2 定量 PCR 引物设计 0055 0056 (1) 植物总 RNA 抽提纯化 0057 按照TIANGEN公司试剂盒说明书进行。 取新鲜叶片在液氮中充分研磨。 大约100mg 叶片使用 1ml TRNzol-A+； 将匀浆样品在 15-30放置 5 分钟， 使得。

30、核酸蛋白复合物完全 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A6/9 页 8 分离 ； 每使用 1ml TRNzol-A+加 0.2ml 氯仿， 盖好管盖， 剧烈振荡 15 秒， 室温放置 3 分钟。 4 12000rpm 离心 15 分钟， 取上层无色的水相溶液到新管中 ； 在得到的水相溶液中加入等 体积异丙醇， 混匀， 室温放置20-30分钟。 412000rpm离心10分钟， 去上清 ； 加入1ml 75 乙醇洗涤沉淀。4 5000rpm 离心 3 分钟， 倒出液体 ； 室温放置晾干约 2-3 分钟， 加入 50L RNase-free ddH2O 充分溶解 。

31、RNA ； 利用 Beckman 紫外分光光度计测定 A260、 A280， 检查 RNA 质 量并计算浓度以备用。 0058 (2) 第一链 cDNA 的合成 0059 参照 Promega 公司反转录系统， 在混合液中添加 4L MgCl2， 2L 反转录 10 缓 冲液， 2L dNTP 混合物， 0.5L 重组的核糖核酸酶抑制剂， 0.6L AMV 反转录 酶， 1L Oligo(dT) 引物， 2L 总 RNA， 加无核酸酶的水至终体积为 20L。将反应体系于 42温育 60 分钟， 然后将样品于 95加热 5 钟， 然后于冰上放置 5 分钟， 将第一链 cDNA 存 放于 -20备。

32、用。 0060 (3) 荧光定量 PCR 0061 PCR 使用美国 ABI7000 定量 PCR 仪， 采用宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 Premix Ex TaqTM试剂盒。反应体系包含 SYBRPremix Ex TaqTM(2)12.5L， 正 反向引物各 0.5L， 各种处理的 cDNA 模板 1L， 加水补足体积至 25L。 0062 引入看家基因 Actin 做内参， 反应程序为 ： 95 15s， 然后在 95 5s， 60 35s 下 循环 45 次， 最后 95 15s， 60 20s， 95 15s 下循环 1 次， 设定在每个循环中 60 35s 时 读取荧光值，。

33、 同时进行 ROX 值校正， 最后添加荧光 PCR 产物融解曲线分析， 其他操作详见仪 器使用说明书。设两次重复， 计算时取平均值。 0063 采用相对定量法进行分析。 Ct值是通过7000system SDSVersion1.2.3软件在PCR 的荧光域值通过手工确定为 0.2 后产生的， 根据公式 XN.q/XA.q 2-CT， 以对照为基础进行 各样品基因相对量的比较。将数据输入到 EXCEL 进行作图分析。其具体结果见图 3。 0064 可以看出抗旱品种沪旱 3 号在 Os11g14010、 Os07g13170 和 Os02g53690 的 3 个基 因中的表达趋势都与其它材料完全不。

34、同， 干旱处理后相对表达量比处理前和复水后要高， 而其它品种均在干旱处理后表达量明显下降， 说明在该品种中启动子的多态性改变了该基 因的表达， 从而增强了该品种的抗旱性。再次证明这 3 个基因与水稻的抗旱性相关联。 0065 (4) 基因克隆 0066 分别下载 Os11g14010、 Os07g13170 和 Os02g536903 个基因的基因组数据， 设计基 因全长引物， 然后以 PEG 6000 溶液模拟干旱处理 3 小时后所形成的第一链 cDNA 为模板， 进 行 PCR 扩增。 0067 其 50L PCR 反应体系 ： 5L 10 反应缓冲液， 3L 2mmol/L dNTP 混。

35、和液， 2L 10mol/L F 引物， 2L 10mol/L R 引物， 1U Pfu(Tiangen 公司 )DNA 聚合酶， 4L 20ng/ul cDNA 模板， 33L ddH2O。 0068 PCR 扩增程序 ： 94 4min ； 94 30s， 60 30s， 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 10保存。该 PCR 产物电泳后， 连接进 T- 载体， 经过测序来确认基因是否正确克隆。 0069 实施例 2 0070 用本发明的方法克隆与水稻产量相关联的 microRNA 基因 0071 水稻的生物学产量和经济学产量直接关系到水稻最后生产的稻米量， 由多个。

36、基因 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A7/9 页 9 位点控制并与环境互作。通过 QTL 定位作图发现有 2000 多个位点控制水稻的产量构成相 关性状。microRNA 是植物中发现的一种重要的非编码蛋白质的小 RNA， 对植物的发育、 生长 和抵抗生物非生物胁迫发挥重要的调控作用， 也参入了水稻产量构成的调控。 0072 1. 水稻品种田间试验及性状调查 0073 收集了国内外 150 份各种品种， 在大田正常条件下进行种植。所有供试品种种子 浸种催芽至露白后播种育秧， 并按正常田间管理方式插秧， 单本种植。采用随机区组设计， 3 重复， 种植 2 行。

37、， 每行 18 株， 按行株距 20cm20cm 种植。水稻成熟后收种、 晒干称重为经 济学产量。收割地上部， 晒干后称重为生物学产量。 0074 2. 水稻 DNA 抽提 0075 水稻 DNA 抽提方法参照实施例 1。 0076 3.CEL I 酶的粗提 0077 CEL I 酶的粗提参照实施例 1。 0078 4.TILLING 技术的 PCR 反应体系及后期处理 0079 从 miRBase 数 据 库 (http:/www.mirbase.org/index.shtml) 中 下 载 水 稻 microRNA(release 10.0) 数据， 然后在水稻基因组序列中提取相应的基因组。

38、序列， 包括前 面的启动子序列和茎环序列， 设计并合成引物。其 TILLING 技术检测和处理方法同实施例 1。对照品种为日本晴。 0080 5.TASSEL 分析与水稻产量性状相关联 microRNA 基因 0081 采用的方法同实施例 1。对 286 个 microRNA 基因关联分析发现， 所分析的结果见 表 3。 0082 表 3.microRNA 与产量性状的关联分析结果 0083 0084 为了进一步了解序列的变化情况， 对 miR159c 标记的序列进行了测序。发现与酶 切后与品种 IR68704( 来自国际水稻所 ) 带型相同的品种并不存在， 即品种 IR68704 是唯 一一。

39、个与基因组测序品种日本晴有这种差异的品种 ； 而与品种深水稻 2( 广西一种地方深 水稻 ) 带型相同的合计有 8 个品种。品种 IR68704 启动子序列在 186bp 处发生 5 个连续碱 基的插入突变， 633bp 处发生 7 个连续碱基的缺失突变。与 miR159C( 品种深水稻 2) 及日本 晴序列相比， miR159C( 品种 IR68704) 在 520bp 处插入一个 T 碱基， 即多出一个 TATA box。 增加的一个 TATA box 可能使品种 IR68704 的 miR159c 转录功能增强。 0085 4) 基因克隆 0086 分别下载miR435、 miR819f。

40、和miR159c基因组数据， 设计它们的前体物序列的全长 引物， 然后以沪旱 3 号品种的 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增。 0087 其 50L PCR 反应体系 ： 5L 10 反应缓冲液， 3L 2mmol/LdNTP 混和液， 2L 10mol/L F 引物， 2L 10mol/L R 引物， 1U Pfu(Tiangen 公司 )DNA 聚合酶， 4L 20ng/ul cDNA 模板， 33L ddH2O。 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A8/9 页 10 0088 PCR 扩增程序 ： 94 4min ； 94 30s， 60 30s， 。

41、72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 10保存。该 PCR 产物电泳后， 连接进 T- 载体， 经过测序来确认基因是否正确克隆。 0089 尽管对本发明已作了详细的说明并引证了一些具体实例， 但对本领域技术人员来 说， 只要不离开本发明的精神和范围， 作各种变化或修正是显然的。 0090 序列表 0091 上海市农业生物基因中心 0092 一种克隆水稻复杂性状相关联基因的方法 0093 0094 8 0095 PatentIn version 3.5 0096 1 0097 21 0098 DNA 0099 人工序列 0100 1 0101 agccagagct tgatg。

42、gtgga t 21 0102 2 0103 22 0104 DNA 0105 人工序列 0106 2 0107 tgccattgac atacaccaaa ca 22 0108 3 0109 20 0110 DNA 0111 人工序列 0112 3 0113 gccgcttgct gataacattc 20 0114 4 0115 22 0116 DNA 0117 人工序列 0118 4 0119 caagggtgtt tacctggtag ca 22 0120 5 0121 22 0122 DNA 0123 人工序列 0124 5 说 明 书 CN 102094001 A CN 10209。

43、4007 A9/9 页 11 0125 gcatctccaa actaatcacg ct 22 0126 6 0127 20 0128 DNA 0129 人工序列 0130 6 0131 attaatcagc ccgaccgcat 20 0132 7 0133 22 0134 DNA 0135 人工序列 0136 7 0137 tcactgccac aagaacaaaa cg 22 0138 8 0139 21 0140 DNA 0141 人工序列 0142 8 0143 cgccaagtgc cttaactatg a 21 说 明 书 CN 102094001 A CN 102094007 A1/2 页 12 图 1 图 2 图 3-1 说 明 书 附 图 CN 102094001 A CN 102094007 A2/2 页 13 图 3-2 图 3-3 图 3-4 说 明 书 附 图 CN 102094001 A 。