技术领域
本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及黄瓜雄性不育基因相关SNP的 标记及应用。
背景技术
黄瓜(CucumissativusL)是我国最重要的蔬菜作物之一，在科技部“十一五”国 家科技支撑计划开展的“主要蔬菜作物雄性不育育种关键技术集成与良种产业化”重点项 目中，黄瓜被列为重要攻关项目。雄性不育基因在很多作物中都有发现，但是，在国内外的 文献报道中，至今极少发现有关黄瓜雄性不育基因的报道，更没有与黄瓜雄性不育基因任 何相关标记的开发。
2012年春我们首次在一个高代自交系里发现了黄瓜雄性不育突变体，经验证，该 不育性状由细胞核隐性基因控制，雄性不育在其他作物中报道很多，但罕有黄瓜雄性不育 的报道。以往定位一个新基因的方法，通常利用已有的RAPD、SCAR、AFLP、SSR等分子标记开 发的引物，在差异性状的植物基因组中，大量的扩增，跑胶，筛选差异的条带，需要耗费大量 的人力，物力和时间，也只能是将基因初步定为在一个很宽的区域，不能精细的定位一个基 因。
发明内容
本发明采用重测序与集群分离分析相结合的方法，精细的定位了此次黄瓜雄性不 育基因，为不育基因的克隆打下良好的基础。本发明具有快速、简便、稳定、可靠、低成本、不 受环境条件影响等优点，不仅为黄瓜花粉发育的研究提供理论基础，也在黄瓜杂交育种中 具有很大的应用价值。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种黄瓜雄性不育性相关基因SNP的特异性引物，其核苷酸序列如下所示：
引物对1：
正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’
反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGCGTA3’
引物对2：
正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’
反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGTGGC3。
本发明进一步公开了黄瓜雄性不育性相关基因SNP的特异性引物进行标记的方 法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）将“YL-5”雄性不育系为母本与远缘品种“D37-1”为父本进行杂交，得到杂种F1，由 杂种F1自交得到F2代群体，F2代分离群体中存在雄性可育和雄性不育两种表型；
（2）通过CTAB法提取父本，母本，F2代每个单株基因组DNA，形成4个混池，对这4个混池 的DNA进行重测序，对测序得到的原始双端序列进行质量评估并过滤得到清晰读数，将清晰 读数与参考基因组序列进行比对，基于比对的结果，使用GATK软件包进行SNP的检测和注 释；
（3）根据SNP的检测结果，筛选两个混池间有差异的碱基位点，混池间不一致或为杂合 型的SNP位点，并确定SNP在基因组中的位置，以及是否引起基因的非同义突变，从而影响编 码的蛋白序列，性状相关侯选区域的选择通过混池的基因型频率差异进行筛选，使用SNP- index关联算法选择候选区域；
(4)根据筛选出的SNP位点，使用软件WebSNAPER设计等位基因特异PCR引物，开发了与 不育性状相关的共显性SNP分子标记；设计时要求引物长度为17-25bp，复性温度50-62 ℃，GC含量为40-60％，利用引物3’端错配策略将引物3’端的第2-4位碱基进行 一个碱基的错配处理，有效区分了该位点在双亲间的差异，鉴定黄瓜的育性。
本发明更进一步公开了黄瓜雄性不育性相关基因SNP的特异性引物在精细定位黄 瓜雄性不育基因区域方面的应用；其中的适用于选育雄性不育黄瓜的共显性SNP分子标记 的核苷酸序列如下所示：
引物对1：
正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’
反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGCGTA3’
引物对2：
正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’
反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGTGGC3。
实验结果表明：采用该方法对黄瓜基因组DNA进行PCR扩增，根据条带的有无， 和深浅对比，可以在苗期甚至萌芽时期有效鉴别黄瓜的育性，更好的应用于杂交育种中不 育黄瓜植株的筛选，可免去大量的田间测试工作，提高选择效率，还可以通过分子标记进行 聚合育种，再和转基因技术相结合，最终实现品种设计育种理念的新突破。
本发明的技术关键点在于：雄性不育性状的本身。以及通过重测序与集群分离分析方 法结合的方法定位不育基因，研究结果表明：这种方法可以快速有效地得到与不育性状相 关的基因及与基因相关联的SNP标记，进而为基因的精细定位、克隆转化、苗期育性的鉴定 以及杂交优势育种奠定基础。
本发明公开的黄瓜雄性不育基因相关的SNP分子标记与现有技术相比所具有的积 极效果在于：
（1）本发明利用重测序与BSA相结合的方法，只用了4个月就可以获得雄性不育相关分 子标记和精细定位区域，周期短、成本低、效率高，可为在其他物种中开发功能性分析标记 提供重要的成功案例，也为分子育种、系统进化、种质资源鉴定中分子标记提供了一种重要 的开发途径。
（2）SNP的密度比微卫星标记更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提 供一系列标记；由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组中SNP往往只需+/-的分析，而不 用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选SNP，节省研究时间；与SSR位点相比，SNP 是高度稳定的；由于处于基因编码区的SNP（cSNP），可能会直接影响产物蛋白质的结构或 基因表达水平，因此它们可能代表某些遗传机理中的一些作用因素。
（3）目前，在作物育种中已经应用的分子标记绝大多数是与某个基因或某个性状 连锁的侧翼标记，并非功能基因自身的分子标记。因而，这些标记的绝大多数在实际意义上 不能与目标基因共分离，选择效率在很大程度上受标记与目标基因遗传距离的限制，在分 子标记辅助选择中具有较大的局限性。而我们开发的SNP标记直接标记目标基因本身，使研 究者直接通过功能分子标记选择目标基因，能够极大地提高分子标记选择的效率。
附图说明：
图1:为SNP分子标记在F2分离群体中的验证；
注：图1中，F代表父本，纯合可育；M代表母本，不育；1-22代表F2代单株，其中1、3、4、5、 18、20、21为纯合可育，6、7、9、14、15、16、22为杂合可育，2、10、11、12、13、17、19为不育。每个 样本左边条带显示为引物对Chr3-320626[T/G]-1-2扩增结果，右边条带为显示引物对 Chr3-320626[T/G]-3-2扩增结果；
图2:SNP-index在全基因组上的分布图；注：横坐标表示染色体的位置；纵坐标表示 SNP测序深度值；图中散点表示计算得到混池之间基因型频率的显著差异值；图中曲线表示 混池之间基因型频率的显著差异值的拟合值；水平虚线表示拟合值为99%的阈值线；
图3：各类型变异在染色体的分布；注：从外到里依次为：染色体坐标、SNP密度分布、 InDel密度分布在基因组上的分布(单位为兆）；
图4：重测序生物分析流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件所述的条件进行。其中“YL-5”雄性不育系（出自天津市农科院武清实验田的一种高代自 交系）、“D37-1”（出自天津市农科院武清实验田的一种高代自交系）均出自天津科润黄瓜 研究所（对外可免费提供）。
实施例1：
黄瓜雄性不育性状相关的SNP分子标记的获得，包括以下步骤：
（1）将“YL-5”雄性不育系为母本与远缘品种“D37-1”为父本进行杂交，得到杂种F1，由 杂种F1自交得到F2代群体，F2代分离群体中存在雄性可育和雄性不育两种表型（方法参见 河南农业科学，2012，（41）11:14-18，侯磊磊）。
（2）通过CTAB法提取父本，母本，F2代每个单株基因组DNA，形成4个混池，对这4个 混池的DNA进行重测序，对测序得到的原始读数(双端序列)进行质量评估并过滤得到清晰 读数，将其与参考基因组序列进行比对，基于比对结果，使用GATK软件包进行SNP的检测和 注释。
（3）根据SNP的检测结果，筛选两个混池间有差异的碱基位点（混池间不一致或为 杂合型的SNP位点），并确定SNP在基因组中的位置，以及是否引起基因的非同义突变，从而 影响编码的蛋白序列。性状相关侯选区域的选择通过混池的基因型频率差异进行筛选，使 用SNP-index关联算法选择候选区域。
(4)根据筛选出的SNP位点，使用软件WebSNAPER设计等位基因特异PCR引物，开发 了与不育性状相关的共显性SNP分子标记。设计时要求引物长度为17-25bp，复性温度 50-62℃C，GC含量为40-60％，同时，利用引物3’端错配策略将引物3’端的第 2-4位碱基进行一个碱基的错配处理，有效区分了该位点在双亲间的差异。
实施例2
基于全基因组重测序的Super-BSA技术
（1）通过CTAB法提取5株父本、5株母本、F2群体中不育和可育各50个单株每个单株基因 组DNA，分别等量混合形成5个混池。
（2）技术路线
提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段（0.2-5Kb）， 加上接头,进行cluster制备（Solexa）或E-PCR（SOLiD），最后利用Paired-End（Solexa） 或者Mate-Pair（SOLiD）的方法对插入片段进行重测序。重测序结果是在全基因组水平上扫 描并检测与不育性状相关的基因序列差异和结构变异，实现遗传进化分析及重要性状候选 基因预测。
实施例3
雄性不育性状相关SNP标记的应用
利用引物对Chr3-320626[T/G]-1-2和Chr3-320626[T/G]-3-2分别扩增分析双亲和 F2代的基因组DNA，PCR反应体系如下：
1×PCRbuffer，1.35mMMgCl2，0.08mMdNTPs，1.0UTaqDNA聚合酶(均购 自MBIFermentas，Lithuania公司)，100ngDNA，正、反向引物各0.45μM，ddH2O 补充至终体积20μl。热循环参数为：95℃C3min；95℃C30sec，复性温度58℃30 sec，72℃C1min，35个循环；72℃C5min，1个循环；4℃C保存，反应是在PTC- ALD1244PCR仪上完成。两个材料均进行两次重复。扩增产物在水平电泳槽上1.5％琼脂 糖凝胶电泳检测，使用1×TAE缓冲液(0.04MTris-acetate，0.001MEDTA，pH8. 0)，电压8V/cm，电泳35min。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存。引物对Chr3- 320626[T/G]-1-2可以扩增可育基因，Chr3-320626[T/G]-3-2可以扩增不育基因。下图（图 1）利用这两个引物对有效的鉴别了黄瓜的育性。
实施例4
黄瓜雄性不育基因SNP分子标记获得方法在定位黄瓜雄性不育基因方面的应用。本发 明人通过试验获得一种适用于选育雄性不育黄瓜的共显性SNP分子标记，它的核苷酸序 列如下所示：
引物对1：编号为Chr3-320626[T/G]-1-2
正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’
反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGCGTA3’
引物对2：编号为Chr3-320626[T/G]-3-2
正向引物：5’AGCCATCAAAATCCAAGCTTGTT3’
反向引物：5’TTTTGAGTCTTCTAGTTATCGTGGC3’
注：标注粗体下划线碱基(如T)代表该碱基在引物设计时进行了错配处理。制备用 于选育雄性不育黄瓜的共显性SNP分子标记的方法，按照以下步骤：
利用重测序技术得到的SNP位点信息，筛选得到第三号染色体第320626个碱基发生突 变，由T突变为G.采用引物3’端错配技术策略(Drenkard等，Asimpleprocedurefor theanalysisofsinglenucleotidepolymorphismsfacilitatesmap-basedcloning inArabidopsis.PlantPhysiol，2000124：1483-1492)，利用软件WebSNAPER，设计了 等位基因特异PCR引物对Chr3-320626[T/G]-1-2和Chr3-320626[T/G]-3-2。将引物对 Chr3-320626[T/G]-1-2和Chr3-320626[T/G]-3-2进行PCR扩增，得到与雄性不育性状 连锁的共显性SNP分子标记(即本发明的目标分子标记）。
结论：
利用本次开发的SNP分子标记，对黄瓜基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带的有 无，有效鉴别黄瓜的育性，可以更好的应用于杂交育种中不育黄瓜植株的筛选。
SEQUENCELISTING
<110>天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所
<120>黄瓜雄性不育基因相关SNP标记及应用
<160>4
<170>PatentInversion3.5
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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agccatcaaaatccaagcttgtt23
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ttttgagtcttctagttatcgcgta25
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<212>DNA
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