技术领域
本发明涉及一种CA-4碳酸酯类衍生物及其制备方法和用途，属于碳酸酯类化合物合成技 术领域。
背景技术
Combretastatins A-4（CA-4）是从南非灌木矮生柳树(Combretum caffrum)树皮中分离得到 的天然抗有丝分裂的茋类化合物，其中Combretastatin-4(CA-4)是这类化合物中抗肿瘤活性最 好毒性最小的化合物之一，最早于1982年由Pettit等人分离、鉴定。CA-4能够识别肿瘤组织 和正常组织内皮细胞的差异，选择性抑制肿瘤细胞微管蛋白的聚合，抑制肿瘤血管增生，从 而作为一种强效的微管聚合抑制剂发挥抗肿瘤作用。由于CA-4的水溶性极差，限制了其临 床应用。然而CA-4的磷酸酯前药（CA-4P）目前已进入Ⅲ期临床研究。
构效关系研究表明，CA-4结构中二苯乙烯的顺式结构和3，4，5-三甲氧基苯基是抗肿瘤 活性的必要条件。而4′-甲氧基和3′-羟基则不是其活性的必要基团。CA-4极不稳定，顺式结 构见光易异构成活性很低的反式构型，3′-羟基在空气中易氧化成醌。
CN101362736A公开了一种苯并磺酰胺类CA－4类似物、合成方法及应用。化合物具有 如通式I的结构，在结构特点上，与CA-4的化学结构具有较大的差别。制备方法是以N－叔 丁基－苯磺酰胺衍生物为原料，在金属试剂作用下产生相应的碳负离子，再分别与含甲氧基 和其它官能团取代的苯甲醛反应，生成仲醇，然后用氧化剂把仲醇进行氧化，再利用三甲基 硅氯/NaI/乙腈试剂诱导的新型环合反应，合成一系列构象限制的CA－4类似物。目标化合物 体外细胞生长抑制活性试验结果表明可作为抗肿瘤药物应用。
CN102219811A提供了一类CA-4衍生物(通式II)、制备方法、以及对肿瘤血管抑制作用。 通式（II）的化合物如下：
该衍生物是将CA-4中的羟基通过丙二酸、丁二酸等连接臂与氨基糖分子中的氨基偶联， 得到多靶点的血管生成抑制剂。药理实验证明，本发明化合物可以用于治疗各种与血管生成 相关的疾病，这些疾病包括各种癌症和慢性炎症，以及其它血管原性的疾病。该类化合物在 原CA-4的结构中增加了1个糖基，增大了该化合物的水溶性，与本发明申请的设计理念恰 好相反。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一类新的CA-4碳酸酯类衍生物、制备方法及用途。
本发明的技术方案如下：
一、化合物
CA-4碳酸酯类衍生物，是具有通式6的化合物，
其中，R为C1-18直链或支链的链状烷基、苯基或苄基。
根据本发明优选的，R为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH3、-CH2CH2CH2CH3、 -CH2CH(CH3)CH3、-CH2CH2CH2CH2CH3、-CH2(CH2)10CH3、-CH2(CH2)14CH3、-Ar、-CH2Ar （Ar表示苯环）。
根据本发明优选的，CA-4碳酸酯类衍生物是下列化合物之一：
为了表达简介明了，在本说明书中通用以上11种具体化合物的编号，含义相同。
二、制备方法
本发明的CA-4碳酸酯类衍生物（式6的化合物）是CA-4分子中的羟基被含有侧链的氯 甲酸酯取代而制得的。
本发明的CA-4碳酸酯类衍生物的制备方法，使下式CA-4化合物：
与式5化合物
在吡啶存在下于溶剂中进行酯化反应制得式6化合物；
其中，式5中的R与式6中的R含义相同，R为C1-18直链或支链的链状烷基、苯基或苄 基；
反应温度10～30℃，CA-4化合物与式5化合物的用量摩尔比为1:2～6，反应时间12～48 小时。
根据本发明优选的，式5化合物（含有侧链的氯甲酸酯）为氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、 氯甲酸正丙酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸正丁酯、氯甲酸异丁酯、氯甲酸正戊酯、氯甲酸苯酯、 氯甲酸苄酯、氯甲酸正十二烷基酯或氯甲酸正十六烷基酯。
根据本发明优选的，所述溶剂是二氯甲烷、三氯甲烷。
根据本发明，一个优选的方案，CA-4碳酸酯类衍生物的制备方法，步骤如下：
（1）CA-4化合物用无水二氯甲烷溶解，CA-4化合物与二氯甲烷比例为1：1.5～20，单 位mmol/mL，置于0℃酒精浴中，搅拌冷却至0℃；
（2）按CA-4化合物与吡啶比例为1：1.5～2，单位mmol/mL，加入无水吡啶，搅拌5 分钟；按CA-4化合物与式5化合物摩尔比为1:2～6，滴加式5化合物，通入氮气保护，在0 ℃搅拌30分钟，使反应物充分混合均匀，然后，
（3）于10～30℃温度下继续搅拌反应12～48小时，得产物。
继续以下步骤可得到纯化产品：
（4）产物纯化：将上述步骤（3）的产物通过柱层析色谱分离得到纯化产品。纯化产品 外观为浅黄色糖浆状物或者浅黄色固体。
根据本发明，进一步优选的，所述反应温度为20～25℃，CA-4化合物与式5化合物的用 量摩尔比为1:3～4，反应时间为24～36小时。
上述方法所用原料CA-4可为天然植物中提取的，也可按照文献方法（Gaukroger,K.et al, The Journal of Organic Chemistry,2001,66,8135）制得。本发明提供以下CA-4的制备方法：
（1）CA-4的制备：①3，4，5-三甲氧基苯乙酸（化合物1）、异香草醛（化合物2）、 醋酸、三乙胺140℃回流3小时发生柏金缩合（Perkin缩合），生成3′-羟基乙酰化产物，该 乙酰化产物3再水解17小时生成2-（3,4,5-三甲氧基苯基）-3′-羟基-4′-甲氧基-（E）苯乙烯 酸（化合物3）。②化合物3与铜粉和喹啉于220℃发生脱羧反应生成CA-4。快速柱层析色 谱法分离得到纯的CA-4。
以3，4，5-三甲氧基苯乙酸（化合物1）为初始原料合成本发明目标化合物的合成路线 如下：
三、组合物
根据本发明，一种药物组合物，其中含有任一种式6化合物和药学上可接受的载体或药用 辅料。
所述的药物组合物制成不同剂型的药物制剂。可按照药剂学常规生产工艺制成片剂、胶 囊剂、滴丸和栓剂的剂型之一。
所述的不同剂型的药物制剂详细说明如下：
1、CA-4碳酸酯类衍生物胶囊剂的制备
取CA-4碳酸酯类衍生物，以CA-4碳酸酯类衍生物重量为基数计，加入淀粉12～14重量 倍，糊精2～3重量倍,少量的微晶纤维素和硬脂酸镁,混匀,制粒,整粒,装入胶囊壳,即得。
2、CA-4碳酸酯类衍生物滴丸的制备
取一种CA-4碳酸酯类衍生物，以CA-4碳酸酯类衍生物重量为基数计，加入3～5倍重量 体积比（g/mL）的无水乙醇，溶解，滤过，将滤液加入6～8重量倍的聚乙二醇4000熔融液 中，60℃水浴恒温搅拌，挥尽乙醇，85℃条件下滴制滴丸，以二甲基硅油为冷凝液冷却，收 集滴丸，即得。
3、CA-4碳酸酯类衍生物栓剂的制备
取一种CA-4碳酸酯类衍生物，加入已加热融化的36型半合成脂肪酸甘油酯中，搅拌， 50℃条件下注入栓模中，凝固，刮平，取出，即得。或者，
取一种CA-4碳酸酯类衍生物，加入已加热融化的PEG4000和PEG6000（7:1质量比） 的混合物中，搅拌均匀，注入涂有液状石蜡的栓模中，冷却凝固，刮平，取出，即得。
4、CA-4碳酸酯类衍生物软膏剂的制备
取液体石蜡或植物油中的一种，加入凡士林或羊毛脂中的一种，再加入尼泊金类抑菌剂 如尼泊金乙酯，研匀，即得其油脂性软膏剂基质。然后加入一种CA-4碳酸酯类衍生物，研 匀，即得。或者，
取硬脂酸、单硬脂酸甘油脂、白凡士林、甘油或液体石蜡中的一种或若干种，加入油酸和尼泊 金类抑菌剂如尼泊金乙酯，加热至80℃左右使熔化，搅拌均匀，再加入一种CA-4碳酸酯类衍生 物药物，搅拌均匀，得含药的油相。另取十二烷基硫酸钠、海藻酸钠或吐温80中的一种或者两 种，加入蒸馏水、乳化剂三乙醇胺，加热至约80℃，搅拌均匀，得水相。在80℃条件下，将 水相缓缓加入到油相中，边加入边搅拌，至均匀，冷却至室温，即得。
本发明的具有抗肿瘤作用的CA-4碳酸酯类衍生物及其药物组合物制剂用于肿瘤的治疗。
四、医药用途
根据本发明，CA-4碳酸酯类衍生物的医药用途，其特征在于式6化合物（CA-4碳酸酯类 衍生物）在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其是在制备抗人乳腺癌或白血病药物中的应用。
本发明提供的系列CA-4碳酸酯类衍生物，用人乳腺癌细胞MCF-7和人白血病细胞K562 细胞株进行初步活性筛选，发现这些CA-4衍生物对测试的肿瘤细胞均有很强的抑制增殖作 用，活性与CA-4相似，IC50值均达到了nM数量级，其中某些化合物显示了比CA-4更高的 抗肿瘤活性，如CA-4与氯甲酸乙酯的反应产物CA-4碳酸乙酯（化合物6-2），对上述测试 细胞的IC50值在0.0013-0.0025μM之间，均小于CA-4的IC50值。更为详细的实验将在具体实 施方式中加以说明。
本发明对CA-4的结构修饰是在保留顺势结构和3,4,5-三甲氧基苯基活性部分的基础上， 对3′-羟基进行结构改造，引入一系列长链，由于空间位阻作用，阻碍CA-4双键的异构化， 从而增加其稳定性，保留其抗肿瘤活性。
本发明的特点是以天然产物CA-4为先导化合物，将一系列甲酸酯接到CA-4的羟基侧链 上得到一系列的CA-4衍生物。这是一类结构全新的化合物，初步药理活性筛选试验表明这 些化合物均具有较好的抗肿瘤活性，某些化合物表现出比CA-4更优的抗肿瘤活性。本发明 设计合理，制备简单，适于实用。
附图说明
图1为实施例1的产物化合物6-1的氢谱。
具体实施方式
本发明结合实例作进一步的说明。以下的实例是说明本发明的，而不是以任何方式限制 本发明。
实施例1：CA-4碳酸甲酯(化合物6-1)的制备
使CA-4与氯甲酸甲酯酯化反应，得通式6中R为甲基的化合物6-1。
步骤如下：CA-4（0.316g，1mmol）用20mL无水CH2Cl2溶解，转移至50mL三颈瓶， 放置0℃酒精浴中，搅拌冷却至0℃。加入无水吡啶2ml，搅拌5分钟。缓慢滴加氯甲酸甲酯 0.3mL（3.9mmol），滴加完后，通入氮气保护，在0℃搅拌30分钟后，移至室温下继续搅拌 24小时，停止反应，得到CA-4的氯甲酸甲酯的修饰产物粗品。通过柱层析色谱分离得到浅 黄色糖浆状物，收率：61%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.09-7.15(m,2H,Ar-H×2),6.87(d,J=8.7Hz,1H,Ar-H), 6.49(s,2H,Ar-H×2),6.46(s,2H,=C-H×2),3.86(s,3H,OCH3),3.84(s,3H,OCH3),3.82(s,3H, OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2).
实施例2：CA-4碳酸乙酯(化合物6-2)的制备
使CA-4与氯甲酸乙酯进行酯化反应，得通式6中R为乙基的化合物6-2。步骤操作过 程、反应时间、反应温度、各试剂的量及反应物摩尔比均与实施例1相同，所不同的是用氯 甲酸乙酯代替氯甲酸甲酯，得到浅黄色糖浆状物，收率62%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.86(d,J=9.3Hz,1H,Ar-H), 6.50(s,2H,Ar-H×2),6.45(s,2H,=C-H×2),4.27(q,J=7.2Hz,2H,OCH2),3.83(s,3H,OCH3), 3.81(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,OCH3×2),1.34(t,J=7.2Hz,3H,CH3).
实施例3：CA-4碳酸正丙酯(化合物6-3)的制备
使CA-4与氯甲酸正丙酯进行酯化反应，得通式6中R为正丙基的化合物6-3。步骤操作 过程、各试剂的量与实施例1相同，所不同的是用氯甲酸正丙酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4 与氯甲酸正丙酯的摩尔比为1:5，10℃条件下反应时间为12小时，得到浅黄色糖浆状物，收 率52%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.87(d,J=9Hz,1H,Ar-H), 6.50(s,2H,Ar-H×2),6.45(s,2H,=C-H×2),4.18(t,J=6.9Hz,2H,OCH2),3.83(s,3H,OCH3), 3.82(s,3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2),1.69-1.80(m,2H,CH2),0.99(t,J=7.8Hz,3H,CH3). 实施例4：CA-4碳酸异丙酯(化合物6-4)的制备
使CA-4与氯甲酸异丙酯进行酯化反应，得通式6中R为异丙基的化合物6-4。步骤操作 过程、反应时间、各试剂的量及反应物摩尔比均与实施例1相同，所不同的是用氯甲酸异丙 酯代替氯甲酸甲酯，在20℃条件下进行反应，得到浅黄色糖浆状物，收率58%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.10-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.85(d,J=9.0Hz,1H,Ar-H), 6.50(s,2H,Ar-H×2),6.84(s,2H,=C-H×2),4.88-4.96(m,1H,OCH),3.83(s,3H,OCH3),3.82(s, 3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2),1.35(d,J=6.3Hz,6H,CH3×2).
实施例5：CA-4碳酸正丁酯(化合物6-5)的制备
使CA-4与氯甲酸正丁酯进行酯化反应，得通式6中R为正丁基的化合物6-5。步骤操作 过程、反应温度、反应时间与实施例1相同，所不同的是用氯甲酸正丁酯代替氯甲酸甲酯，
加入的CA-4与氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:3.5，得到浅黄色糖浆状物，收率63%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.85(d,J=8.1Hz,1H,Ar-H), 6.50(s,2H,Ar-H×2),6.45(s,2H,=C-H×2),4.22(t,J=6.6Hz,2H,OCH2),3.84(s,3H,OCH3), 3.82(s,3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2),1.66-1.75(m,2H,CH2),1.38-1.50(m,2H,CH2),0.96(t, J=7.2Hz,3H,CH3).
实施例6：CA-4碳酸异丁酯(化合物6-6)的制备
使CA-4与氯甲酸异丁酯进行酯化反应，得通式6中R为异丁基的化合物6-6。步骤操作 过程实施例1相同，所不同的是用氯甲酸异丁酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4与氯甲酸异 丁酯的摩尔比为1:5.6，反应在温度为20℃条件下进行，反应时间为12h，得到浅黄色糖浆状 物，收率58%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.86(d,J=8.4Hz,1H,Ar-H), 6.50(s,2H,Ar-H×2),6.46(s,2H,=C-H×2),4.01(d,J=6.6Hz,2H,OCH2),3.84(s,3H,OCH3), 3.82(s,3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2),1.97-2.10(m,1H,CH),0.98(d,J=6.6Hz,6H, CH3×2).
实施例7：CA-4碳酸正戊酯(化合物6-7)的制备
使CA-4与氯甲酸正戊酯进行酯化反应，得通式6中R为正戊基的化合物6-7。步骤操作 过程实施例1相同，所不同的是用氯甲酸正戊酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4与氯甲酸正 戊酯的摩尔比为1:2.4，反应在室温条件下进行，反应时间为48h，得到浅黄色糖浆状物，收 率54%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.09-7.13(m,2H,Ar-H×2),6.86(d,J=8.7Hz,1H,Ar-H), 6.48(s,2H,Ar-H×2),6.44(s,2H,=C-H×2),4.20(t,J=6.9Hz,2H,OCH2),3.82(s,3H,OCH3), 3.81(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,OCH3×2),1.67-1.77(m,2H,CH2),1.31-1.42(m,4H,CH2×2), 0.84-0.97(m,3H,CH3).
实施例8：碳酸正十二烷基酯(化合物6-8)的制备
使CA-4与氯甲酸十二烷基酯进行酯化反应，得通式6中R为十二烷基的化合物6-8。步 骤操作过程实施例1相同，所不同的是用氯甲酸十二烷基酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4 与氯甲酸十二烷基酯的摩尔比为1:2.5，反应在30℃条件下进行，反应时间为36小时，得到 浅黄色糖浆状物，收率54%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.85(d,J=8.1Hz,1H,Ar-H), 6.49(s,2H,Ar-H×2),6.46(s,2H,=C-H×2),4.21(t,J=6.9Hz,2H,OCH2),3.84(s,3H,OCH3), 3.82(s,3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2),1.65-1.77(m,2H,CH2),1.20-1.45(m,18H,CH2×9), 0.88(t,J=6.9Hz,3H,CH3).
实施例9：碳酸正十六烷基酯(化合物6-9)的制备
使CA-4与氯甲酸十六烷基酯进行酯化反应，得通式6中R为十六烷基的化合物6-9。步 骤操作过程实施例1相同，所不同的是用氯甲酸十六烷基酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4 与氯甲酸十六烷基酯的摩尔比为1:2，反应在温度20℃条件下进行，反应时间为12小时，
得到浅黄色固体，收率45%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2),6.85(d,J=8.4Hz,1H,Ar-H), 6.49(s,2H,Ar-H×2),6.45(s,2H,=C-H×2),4.21(t,J=6.9Hz,2H,OCH2),3.84(s,3H,OCH3), 3.82(s,3H,OCH3),3.70(s,6H,OCH3×2),1.65-1.78(m,2H,CH2),1.20-1.47(m,26H,CH2×13), 0.88(t,J=6.9Hz,3H,CH3)ppm.
实施例10：CA-4碳酸苯酯(化合物6-10)的制备
使CA-4与氯甲酸苯酯进行酯化反应，得通式6中R为苯基的化合物6-10。步骤操作过 程实施例1相同，所不同的是用氯甲酸苯酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4与氯甲酸苯酯的 摩尔比为1:6，反应持续在温度15℃条件下进行，反应时间为24小时，得到浅黄色糖浆状物， 收率57%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.36-7.41(m,2H,Ar-H×2),7.19-7.25(m,4H,Ar-H×4), 7.13-7.17(m,1H,Ar-H),6.88(d,J=8.4Hz,1H,Ar-H),6.50(s,2H,Ar-H×2),6.47(s,2H, =C-H×2),3.86(s,3H,OCH3),3.83(s,3H,OCH3),3.68(s,6H,OCH3×2).
实施例11：CA-4碳酸苄酯（化合物6-11)的制备
使CA-4与氯甲酸苄酯进行酯化反应，得通式6中R为苄基的化合物6-11。步骤操作过 程实施例1相同，所不同的是用氯甲酸苄酯代替氯甲酸甲酯，加入的CA-4与氯甲酸苯酯的 摩尔比为1:5，反应在温度10℃条件下进行，反应时间为18小时，得到浅黄色糖浆状物，收 率50%。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.32-7.44(m,5H,Ar-H×5),7.11-7.14(m,2H,Ar-H×2), 6.85(d,J=8.4Hz,1H,Ar-H),6.49(s,2H,Ar-H×2),6.45(s,2H,=C-H×2),5.24(s,2H,OCH2), 3.83(s,3H,OCH3),3.78(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,OCH3×2).
实施例12：CA-4碳酸酯类衍生物片剂的制备
实施例1所得的CA-4碳酸酯类衍生物10g，加入淀粉100g，糊精50g，蔗糖粉5g，羧甲 基淀粉钠17.5g，混匀，制成颗粒，整粒，加入滑石粉1.5g，羧甲基淀粉钠17.5g,混匀，压制 成1000片。
实施例13：CA-4碳酸酯类衍生物胶囊剂的制备
实施例2所得的CA-4碳酸酯类衍生物20g，加入淀粉250g，糊精45g，微晶纤维素3.5g， 混匀，制成颗粒，整粒，加入硬脂酸镁1.5g，混匀，装入胶囊壳1000粒，即得。
实施例14：CA-4碳酸酯类衍生物滴丸的制备
实施例4中所得的CA-4碳酸酯类衍生物10g，加入30～50ml无水乙醇，微热溶解，滤 过，将滤液加入85g的聚乙二醇4000熔融液中，60℃水浴恒温搅拌，挥尽乙醇，85℃条件下 滴制滴丸，滴距3cm，以二甲基硅油为冷凝液，控制冷凝液温度20℃至0℃梯度冷却，收集 滴丸，制得滴丸约1000粒。
实施例15：CA-4碳酸酯类衍生物栓剂的制备（1）
取实施例7中所得的CA-4碳酸酯类衍生物2g，另取36型半合成脂肪酸甘油酯（市售） 98g，置水浴上加热融化，待温度降至约60℃时，加入准备好的CA-4衍生物，搅拌至约50 ℃，注入栓模中，凝固，刮平，取出，制得栓剂100粒。
实施例16：CA-4碳酸酯类衍生物栓剂的制备（2）
取实施例7中所得的CA-4碳酸酯类衍生物1g，另取87g的PEG4000和12g的PEG6000， 混合加热至融化，再将所取得CA-4衍生物加入融化的PEG混合物中，继续加热搅拌均匀， 然后注入涂有液状石蜡的栓模中，冷却凝固，刮平，取出，制备栓剂100粒。
实施例17：CA-4碳酸酯类衍生物软膏剂的制备（1）
取液体石蜡3mL，加入羊毛脂10g，再加入尼泊金乙酯0.2g，研匀，即得其油脂性软膏 剂基质。将实施例2所得的CA-4碳酸乙酯1g加入上述软膏基质中，研匀，即得。
实施例18：CA-4碳酸酯类衍生物软膏剂的制备（2）
取单硬脂酸甘油脂5g，液体石蜡4.5mL,加入油酸0.5g，尼泊金乙酯0.2g，80℃水浴中研匀， 将实施例2所得的药物CA-4碳酸乙酯1.5g加入，搅拌均匀，得含药的油相。另取十二烷基硫 酸钠1.8g，甘油2.5g，乳化剂三乙醇胺0.2g，加入蒸馏水12mL，80℃水浴中搅拌均匀，得水 相。80℃水浴条件下，将水相缓缓加入油相中，边加边搅拌至混合均匀，冷却至室温，即得。
实施例19：CA-4碳酸酯类衍生物对不同肿瘤细胞的体外抑制作用
1.实验材料
细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7、人白血病细胞K562。
培养基：RPMI1640培养基，含10%胎牛血清。
药物及配置：药物为上述合成的CA-4碳酸酯类类似物，药物首先溶于DMSO，然后用 培养基稀释后加入细胞中。
2.实验方法
⑴肿瘤细胞体外培养
选取肿瘤细胞MDA-MB-231，MCF-7，K562，A549于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵 育，待细胞长到80%-90%时传代，用于以后实验所需。
⑵WST-1法测定CA-4碳酸酯类衍生物对不同肿瘤细胞的体外抑制作用
将肿瘤细胞以合适浓度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养六小时后加不同浓度的 药，使最终体系为200μL，每个浓度设5个复孔。细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育 72h后，每孔加入WST-1溶液10μL，37℃恒温箱放置2h避光，用酶标仪于450nm和630nm 双波长下测定各孔的OD值，计算细胞抑制率。
细胞抑制率%=（对照组OD值-用药组OD值）/对照组OD值×100%用Bliss法求出IC50。
⑶实验结果
CA-4碳酸酯类衍生物作用于肿瘤细胞72h后，测定OD值，计算IC50值。结果参见表1。 结果表明，这类化合物都具有显著的抗肿瘤活性，大部分化合物的抗肿瘤活性与CA-4接近， 其中活性最好的化合物是化合物6-2，该化合物表现出比CA-4更强的肿瘤细胞抑制作用，其 IC50值在0.0013-0.0025μM之间。
表1CA-4碳酸酯类衍生物72小时对肿瘤细胞的体外抑制作用