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1、(10)申请公布号 CN 102690810 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102690810 A *CN102690810A* (21)申请号 201110072615.1 (22)申请日 2011.03.24 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 深圳华大基因科技有限公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区北山路 146 号北山工业区综合楼 11F-3 (72)发明人 张耕耘 全志武 夏秋菊 张厚宝 (54) 发明名称 与谷子叶片颜。
2、色基因紧密连锁的分子标记 SIsv0690 (57) 摘要 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种分子 标记， 具体的， 涉及一种与谷子叶片颜色基因紧密 连锁的分子标记， 该分子标记含有Seq ID No.1所 示序列。 本发明还涉及扩增该分子标记的引物、 该 分子标记和引物在谷子叶片颜色基因定位或谷子 遗传育种中的用途， 以及一种谷子育种方法。 本发 明的分子标记将基因组 DNA 序列与谷子叶片颜色 基因联系起来， 有利于谷子分子标记辅助育种体 系的建立 ； 所述分子标记与谷子叶片颜色基因的 遗传紧密连锁距离为 0.15cM。本发明的分子标记 及分子标记扩增引物可以简便、 快速、 高通量地应 。
3、用于谷子育种实践和资源及品种鉴定。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 13 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 13 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记， 其特征在于 ： 所述分子标记含有 Seq ID No.1 所示序列 ； 优选的， 所述分子标记为 Seq ID No.1 所示序列。 2. 一种扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的引物对， 其特征在于 ： 所述引 物对的引物 1 含有 Seq ID No.2 所示序列， 。
4、引物 2 含有 Seq ID No.3 所示序列 ； 优选的， 引 物 1 为 Seq ID No.2 所示序列， 引物 2 为 Seq ID No.3 所示序列 ； Seq ID No.2 ： 5 -CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3 ； Seq ID No.3 ： 5 -TGCACAAAGACCCTTACGTT-3 。 3. 一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记， 其特征在于 ： 所述分子标记是由权 利要求 2 所述的引物对以叶片偏绿色的谷子基因组 DNA 为模板经 PCR 扩增得到的。 4. 根据权利要求 3 所述的分子标记， 其特征在于 ： 所述分子标记含有 Seq I。
5、D No.1 所 示序列 ； 优选的， 所述分子标记为 Seq ID No.1 所示序列。 5. 一种载体， 其特征在于 ： 含有权利要求 1、 3、 4 中任一项所述的分子标记。 6. 一种重组细胞， 其特征在于 ： 含有权利要求 5 所述的载体。 7. 权利要求 1 所述的分子标记的检测方法， 包括步骤 ： 根据权利要求 1 的分子标记的 核苷酸序列设计引物， 以被检测谷子基因组 DNA 为模板进行扩增， 并判断扩增产物中是否 存在该分子标记 ； 优选的， 所述引物为权利要求 2 所述的引物对。 8.权利要求1、 3、 4中任一项所述的分子标记或权利要求2的分子标记引物对在谷子辅 助育种或。
6、者谷子叶片颜色基因定位或检测中的用途。 9. 一种谷子叶片颜色基因定位的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括使用权利要求 1、 3、 4 中任一项所述的分子标记或权利要求 2 的分子标记引物对的步骤。 10. 一种谷子辅助育种方法， 其特征在于 ： 所述方法包括检测权利要求 1、 3、 4 中任一项 所述的分子标记或用权利要求 2 的分子标记引物对进行检测的步骤。 权 利 要 求 书 CN 102690810 A 2 1/9 页 3 与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记 SIsv0690 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种分子标记， 特别是涉及一种与谷子叶片颜 色基因紧密。
7、连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、 该分子标记和引物在 谷子叶片颜色基因定位或谷子遗传育种中的用途。 背景技术 0002 我国是谷子 (Setaria italica L.Beauv.) 的原产国， 是世界上谷子的集中种植 国， 谷子在我国的国民经济和社会生产中占有重要的地位， 对旱作生态农业建设有重要意 义。因此， 加速谷子的育种进程尤为重要。由于谷子只是区域重要性作物， 因此当前有关谷 子的研究手段和方法相对较落后， 如何应用先进科学的研究手段搞好谷子育种是一个严峻 的问题。 随着分子生物学的发展， 分子标记技术的出现， 为谷子的遗传研究及育种开辟了新 的思路和手段。开发具。
8、有我国特色的重要性状基因的分子标记并进行辅助选择育种研究， 将对提高我国谷子育种水平起到促进作用。 0003 植物叶色是叶绿体中各种色素的综合表现， 正常叶片中叶绿素占优势， 通常表现 为绿色。叶色变异是高等植物中突变频率较高且易于鉴定的突变性状。迄今为止， 在水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 大豆、 棉花、 烟草、 玉米、 向日葵、 番茄、 黄瓜、 马铃薯、 桑树等几乎所有高等 植物中都发现了叶色突变体。其突变基因直接或间接影响光合色素， 特别是叶绿素的合成 和降解， 导致各种色素的含量和比例改变， 从而引起植物叶色变异。近年来， 叶色突变体的 利用价值越来越受到关注， 现已成为研究植物光合作。
9、用机制、 叶绿素生物合成途径、 叶绿体 的发育和遗传控制机理的特殊材料， 同时叶色突变体在高光效育种和标记性状的利用上也 具有重要的应用价值。一些叶色变异被作为标记性状用于良种繁育和杂交种生产。随着拟 南芥、 水稻等模式植物基因组测序的完成， 叶色突变体在功能基因组学上的研究价值受到 越来越多的关注， 它们已成为研究光合系统结构、 基因功能及其调控机制的理想材料。 据不 完全统计， 目前报道的水稻叶色突变的相关基因已经超过 80 个， 这些突变体大致可分为白 化型、 黄化型、 条纹型、 转绿型、 斑马叶等 5 大类。但对于谷子叶色基因以及与之紧密连锁的 分子标记的研究基本没有文献报道。 发明内。
10、容 0004 本发明的目的是提供一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。 0005 本发明的另一目的是提供一种可用于 PCR 扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的 分子标记的引物对， 以及由该引物对扩增获得的分子标记。 0006 本发明的再一目的是提供上述分子标记在谷子叶片颜色基因定位、 检测以及谷子 辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。 0007 本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体， 以及含有该重组载 体的重组细胞 ； 提供一种包括使用上述分子标记的谷子叶片颜色基因的定位方法， 和使用 所述分子标记的谷子辅助育种方法。 说 明 书 CN 102690810 A 3 2。
11、/9 页 4 0008 为了实现上述目的， 本发明采用了以下技术方案 ： 0009 本发明公开了一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记， 所述分子标记含有 Seq ID No.1 所示序列 ； 优选的所述分子标记具有 Seq ID No.1 所示序列。 0010 本发明还公开了一种扩增与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的引物对， 所 述引物对的引物 1 含有 Seq ID No.2 所示序列， 引物 2 含有 Seq ID No.3 所示序列 ； 优选的 所述引物 1 具有 Seq ID No.2 所示序列， 引物 2 具有 Seq ID No.3 所示序列 ； 0011 Seq ID N。
12、o.2 ： 5 -CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3 ； 0012 Seq ID No.3 ： 5 -TGCACAAAGACCCTTACGTT-3 。 0013 本发明还公开了一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记， 所述分子标记是 由上述的引物对以叶片偏绿色的谷子基因组 DNA 为模板经 PCR 扩增得到的。 0014 优选的由上述引物对扩增得到的分子标记含有 Seq ID No.1 所示序列。 0015 在本发明的一个实施方案中， 所述分子标记 ( 含有 Seq ID No.1 所示核苷酸序列 的 DNA 片段 ) 为谷子基因组中 Seq ID No.1 所示核苷酸序列的 D。
13、NA 片段， 即所包含的 Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列， 优选的， 为谷子 基因组中 Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端的上下游序列。本领域技术人员可以理解， 只 要扩增或者检测叶片偏绿色的谷子基因组 DNA 中的该分子标记， 必然能够检测或扩增得到 含有 Seq ID No.1 所示的序列。Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端的上下游序列的长度 为适当长度， 并不特别限定， 例如， 满足分子标记的长度小于 10,000bp、 小于 5,000bp、 小于 2,000bp、 小于 1,500bp、 。
14、小于 1,200bp、 小于 1,000bp、 或者小于 800bp。 0016 在本发明的一个实施方案中， 所述分子标记 ( 含有 Seq ID No.1 所示核苷酸序列 的 DNA 片段 ) 所包含的 Seq ID No.1 的 5 端和 / 或 3 端可操作地连接有人工序列和 / 或 控制序列， 例如启动子、 增强子、 终止子、 酶切位点、 引物序列等等。其中， 术语 “可操作地” 在本发明中定义为一种如下构象， 在该构象中， 控制序列例如启动子被适当地置于 Seq ID No.1 的一个位置上， 以致该控制序列指导 Seq ID No.1 编码的多肽的产生。 0017 本发明还公开了一。
15、种重组载体， 其含有本发明的分子标记。所述重组载体可以是 插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后， 本领域技术人 员可以理解， 根据不同的需要， 将重组载体转化到合适的细胞中， 得到含有该重组载体的重 组细胞。因此， 本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。 0018 本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法， 包括下述步骤 ： 使用叶片颜色偏 绿色的谷子的基因组 DNA 作为模板， 以上述引物对进行 PCR 扩增， 得到的 632bp 扩增产物即 含有所述分子标记 ； 优选地， 还包括将 PCR 扩增产物进行纯化的步骤。 0019 对本领域技术人员而言， 可以。
16、理解， 也可以 DNA 化学合成的方法得到本发明的分 子标记。 0020 本发明还公开了所述分子标记的检测方法， 包括步骤 ： 根据上述分子标记的核苷 酸序列设计引物， 以被检测谷子基因组 DNA 为模板进行扩增， 并判断扩增产物中是否存在 该分子标记。优选的， 所述引物为上述分别含有 Seq ID No.2 和 Seq ID No.3 的引物对。 0021 例如， 可以以被检测谷子的基因组 DNA 为模板， 以上述引物 (Seq ID No.2 和 Seq ID No.3) 进行 PCR 扩增， 得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。 0022 本发明还公开了所述的分子标记。
17、在谷子叶片颜色基因定位或检测中的用途。 说 明 书 CN 102690810 A 4 3/9 页 5 0023 本发明还公开了一种谷子叶片颜色基因定位的方法， 所述方法包括使用本发明的 分子标记的步骤。 0024 本发明还公开了所述的分子标记在谷子辅助育种中的用途。 0025 本发明还公开了一种谷子辅助育种方法， 所述方法包括检测本发明的分子标记或 分子标记引物对的步骤。 0026 本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中， 本领域技术人员可以理 解， 比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选谷子叶片是否含有控制叶片颜色为偏 绿色的颜色基因 ( 例如， 可以参考， DNA 分子标记在小。
18、麦抗病育种中的用途， 陇东学院学报 ( 自然科学版 )， 2006 年 4 月第 16 卷第 1 期， P65-69)。所述检测可以是 PCR 检测的方法， 具体地， 可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。 所述检测还可以通过测序方法进行。 该谷子辅助育种方法具有简便、 快速、 高通量的优点。 0027 在本发明中， 具体地， 所述谷子可以为张谷 1 号、 谷子 A2 不育系、 张杂谷 3 号、 或张 杂谷 3 号自交产生的 F2 代。其中， 张谷 1 号、 张杂谷 3 号或张杂谷 3 号自交产生的部分 F2 代叶片颜色偏绿色 ； 谷子 A2 不育系、 张杂谷 3 号自交产生的部分 F2 代。
19、叶片颜色偏黄色。 0028 由于采用以上技术方案， 使本发明具备的有益效果在于 ： 0029 本发明提供了与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记， 该分子标记将基因组 DNA 序列与谷子叶片颜色基因联系起来， 有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立 ； 所述 分子标记与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为0.15cM。 本发明的分子标记及分子标 记扩增引物可以简便、 快速、 高通量地应用于谷子育种实践和资源及品种鉴定。 附图说明 0030 图 1 ： 分子标记引物 (Seq ID No.2 和 Seq ID No.3) 对 F2 代 480 个单株扩增的部 分结果。其中 ： 0031 泳道 1-1。
20、2 为 F2 代中 12 株谷子叶片颜色偏绿色的单株的 PCR 扩增产物 ； 泳道 13-24 为 F2 代中 12 株叶片颜色偏黄色的单株的 PCR 扩增产物。泳道 M 为 marker， 其为 100bp DNA Ladder ； 其分子量包括 ： 、 1500bp、 1000bp、 900bp、 800bp、 700bp、 600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp 以及 100bp。 具体实施方式 0032 本发明公开了一种引物对以及与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记 SIsv0690。利用本发明的引物对， 以谷子基因组 DNA 为模板进行 PCR， 可以得到。
21、与谷子叶片 颜色基因紧密连锁的分子标记， 该分子标记在本发明中命名为分子标记 SIsv0690。需要指 出的是， 本领域技术人员可以理解， 除了通过上述 PCR 扩增获得本发明的分子标记外， 还可 以通过化学合成获得本发明的分子标记。 0033 本发明的引物对分别含有序列表 Seq ID No.2 和 Seq ID No.3 所示序列， 0034 Seq ID No.2 ： 5 -CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3 ； 0035 Seq ID No.3 ： 5 -TGCACAAAGACCCTTACGTT-3 0036 本领域技术人员熟知， 在上述Seq ID No.2和Seq ID。
22、 No.3所示序列中， 可在其5 端或 3 端分别增加 1 10 个碱基， 所增加的碱基类型可根据谷子基因组 DNA 上与 Seq ID 说 明 书 CN 102690810 A 5 4/9 页 6 No.2 和 Seq ID No.3 相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定， 由此得到的引物 对与SeqID No.2和Seq ID No.3的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相 同 )。因此， 上述在 Seq ID No.2 和 Seq ID No.3 的 5 端或 3 端分别增加 1 10 个碱基 并能扩增得到基本相同 DNA 片段的引物对， 均包括在本发明的引物对中。。
23、在本发明具体的 实施方式中， 本发明的引物对优选为Seq ID No.2和Seq ID No.3所示序列。 本发明将父本 叶片偏绿色和母本叶片偏黄色的纯合子杂交， 获得 F1 代 ( 张杂谷 3 号 )， 再以 F1 代自交产 生 F2 代群体， 共 480 个单株。优选的采用 SV 分子标记开发方法， 首先对父本进行 de novo 测序(60X contig N50 ： 22K， scaffold N50 ： 320K ； Total size ： 400Mb)， 母本重测序(10X) ； 然后根据父母本测序数据， 利用华大自主开发的 SOAP 软件比较父母本之间的序列差异， 分 别在父本。
24、差异序列的 5 端和 3 端外侧约 50bp 位置， 随机选取 20bp 左右的长度设计差异 序列扩增的引物， 根据不同的差异序列设计了 1105 对引物。以父母本及 F1 的 DNA 为模板 进行扩增， 从 1105 对引物中筛选出 616 对具有多态性和有效性的引物。采用开发出的 616 对引物， 对 F2 群体的 480 个个体进行 PCR 检测， 并进行数据统计分析， 用 Map Maker3.0 软 件进行遗传图谱绘制， 得到本发明所述的与叶片颜色基因紧密连锁的分子标记， 及其扩增 引物。采用筛选出的引物对扩增得到的父本序列， 即本发明中的分子标记 SIsv0690。对 F2 个体进。
25、行性状分析， 并根据基因性状数据和表型性状数据将谷子叶片颜色基因定位在遗传 图谱上。 0037 下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。 以下实施例仅仅对 本发明进行进一步的说明， 不应理解为对本发明的限制。 0038 实施例 1 ： 谷子 F2 代分离群体的构建 0039 父本 ： 抗拿捕净， 株型高， 旗叶长而窄， 刚毛红色， 颖壳红色， 可育， 叶色偏绿， 花粉 黄白色， 抽穗期为晚期。父本为张谷 1 号种子。 0040 母本 ： 不抗拿捕净， 株型矮， 旗叶短而宽， 刚毛绿色， 颖壳绿色， 部分不育， 叶色偏 黄， 花粉棕色， 抽穗期为早期。母本为谷子 A2 不育系种子。。
26、 0041 F2 群体构建 ： 父本和母本杂交得到 F1 代 (F1 叶色为偏绿 )， F1 自交得到 F2。其中 F1 是张杂谷 3 号种子。共得 F2 代单株 480 株， 上述张谷 1 号种子、 谷子 A2 不育系种子及张 杂谷 3 号种子可参见中国专利申请 与谷子抗除草剂基因紧密连锁的分子标记 SIsv0372 ， 公开号 CN101974521A， 公布日 2011 年 2 月 16 日。 0042 实施例 2 ： 父母本以及 F1 代、 F2 代个体基因组 DNA 的提取 0043 用 CTAB 法分别提取实施例 1 中的父母本、 F1 代、 以及 480 个 F2 代个体的基因组。
27、 DNA， 具体方法如下 ： 0044 (1) 称取 1.0g 新鲜叶片， 剪碎放入研钵， 用液氮研磨后加入 3mL 1.5CTAB， 研磨 成匀浆转入 15mL 的离心管中， 然后往研钵中加入 1mL 1.5CTAB 冲洗再转入离心管中。混 匀后于 65水浴 30min， 期间不时缓慢摇匀。 0045 其中 1.5CTAB 配方如下 (1L) ： 0046 说 明 书 CN 102690810 A 6 5/9 页 7 0047 加去离子水定容至 1L， 使用前加入终浓度为 0.2 (2ml) 的巯基乙醇。 0048 (2) 待冷却至室温， 加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24 1)， 轻轻混匀。
28、， 至下层液变为 深绿色。 0049 (3)4200rpm 离心 10min， 将上层水相移到新的 15mL 离心管， 加 2 倍体积预冷的无 水乙醇， 混合静止 5min。于 -20放置 30min 沉淀 DNA。 0050 (4)4200rpm 离心 10min， 弃掉上清， 加入 1mL 75乙醇洗涤沉淀 1 次， 倒置离心管 干燥 DNA， 加入 200L TE 溶解 DNA。 0051 (5) 用 0.8的琼脂糖凝胶检测基因组 DNA。 0052 (6) 将得到的父母本以及 F1 代、 F2 代个体的基因组 DNA 存于 -20备用。 0053 实施例 3 ： 分子标记的制备 005。
29、4 以实施例 2 中提取的父本、 F1 代、 或 F2 代的基因组 DNA 为模板， 以分子标记扩增 引物对 (Seq ID No.2 和 Seq ID No.3) 进行 PCR 扩增。 0055 PCR 反应体系如下 ： 0056 0057 0058 PCR 反应程序如下 ： 0059 94预变性 5 分钟 ； 94变性 30 秒， 60退火 30 秒， 72延伸 40 秒， 运行 35 个循 环 ； 最后 72延伸 3 分钟。PCR 扩增产物可以在 4保存。 0060 经上述扩增过程得到分子标记， 优选扩增后将扩增产物进行纯化操作。纯化后进 行测序， 结果如 Seq ID No.1 所示。。
30、 0061 对本领域技术人员而言， 可以理解， 也可以通过 DNA 化学合成的方法得到该分子 标记。 0062 实施例 4 ： SV 分子标记开发 0063 父本 ： de novo 测序， 60X contig N50 ： 22K， scaffold N50 ： 320K ； Total size ： 说 明 书 CN 102690810 A 7 6/9 页 8 400Mb ； 母本 ： 重测序 10X。 0064 根据父母本测序数据， 利用华大自主开发的 SOAP 软件 ( 例如 SOAP2.20， 可以从 下载， 也可以使用其它的序列比对软件 ) 比较父母本之间 的序列差异， 然后基于差。
31、异的序列， 用 primer premier 软件设计扩增差异序列的引物 ； 基 于不同的差异序列， 一共设计了 1105 对引物。下面的表 1 中示出了其中的部分引物序列 (Seq ID No.2-Seq ID No.41) 0065 表 11105 对随机引物中的部分引物 0066 0067 说 明 书 CN 102690810 A 8 7/9 页 9 0068 分别以提取的父母本及F1代的基因组DNA为模板， 以设计的1105对引物进行PCR 扩增。 0069 PCR 反应体系 (25L) ： 0070 0071 说 明 书 CN 102690810 A 9 8/9 页 10 0072 。
32、PCR 反应程序 ： 94预变性 5min ； 然后进入 35 个循环 ： 94变性 30s， 60退火 30s， 72延伸 40s ； 循环结束后 72延伸 3min ； 4保存。 0073 PCR产物电泳检测 ： 1.2的琼脂糖凝胶120v电泳25min， EB染色10min， 照胶并记 录。 0074 引物的有效性和多态性 ： 在此有效性是指是否有扩增产物， 多态性是指父母本间 扩增产物的片段大小有差异。 0075 按照如下的筛选标准进行引物的筛选 ： 父母本及 F1 均有扩增产物， 并且父母本扩 增产物均只有一条明晰的带型且大小有差异， F1 表现为有父母本带型的杂合带型， 即有父 本。
33、和母本带型的两条带。 0076 筛选结果 ： 根据上述筛选标准， 从设计的 1105 对引物中筛选出 616 对引物。 0077 实施例 5 ： 遗传图谱构建及基因定位 0078 (1) 遗传图谱构建 0079 用开发的 616 对具有多态性的分子标记对 F2 群体的 480 个个体进行 PCR 检测， 所 用模板为制得的 F2 群体的 480 个个体的基因组 DNA。 0080 对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 得到分子标记引物对 480 个个体扩增的结果。 0081 将全部电泳结果进行数据统计分析， 具体方法如下 ： 将 F2 群体单株扩增条带为父 本型的记为 a， 扩增条带为母本型的。
34、记为 b， 扩增条带同时含有父本型和母本型的记为 h， 带 型模糊或者缺失记为-， 相当于数据缺失， 最终得到F2群体480个个体的616对引物扩增的 基因型数据。比如， 用第一对引物得到的 480 个个体的数据是 a， b， h， -， b， . 共 480 个数据， 用第二对引物得到的数据为 b， a， h， a， -， . 共 480 个数据， 共 616 对引物分别 统计， 所得即为该 F2 群体的基因型数据。 0082 用 MapMaker 3.0 软件 (Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0， S Lincoln， M Da。
35、ly， E Lander-Cambridge， MA ： Whitehead Institute， 1992) 进行遗传连锁图 谱绘制， 得到遗传连锁图。从该得到的遗传连锁图上可确定 616 对引物的位置及与谷子叶 片颜色基因的遗传距离。 0083 (2) 基因定位 0084 根据480个个体的叶片颜色表型， 与父本型性状相似的记为a(叶片偏绿色)， 与母 本型性状相似的记为b(叶片偏黄色)， 性状居于父本和母本之间的记为h。 得到480个个体 的表型数据， 将480个个体的表型数据与之前得到的480个个体的基因型数据进行比较， 相 似高则代表该标记与叶片颜色性状紧密连锁， 并将叶片颜色基因定。
36、位在遗传连锁图谱上。 0085 实施例 6 ： 与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的验证 0086 1. 在实施例 5 制得的遗传连锁图谱的基础上， 根据与谷子叶片颜色基因的遗传连 锁距离， 在与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为 0.5cM 的位置确定了分子标记引物 (Seq ID No.2 和 Seq ID No.3)， 并找到对应的父本序列位置， 上下游引物之间的序列即为 说 明 书 CN 102690810 A 10 9/9 页 11 分子标记， 其核苷酸序列如 Seq ID No.1 所示。 0087 Seq ID No.2 ： 5 CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3。
37、 ； 0088 Seq ID No.3 ： 5 -TGCACAAAGACCCTTACGTT-3 0089 2. 另外， 在实施例 5 中的对 F2 代的 480 个个体的 PCR 扩增产物的电泳中， 对于分 子标记引物 (Seq ID No.2 和 Seq ID No.3) 的扩增结果是 ： 约 360 株叶片颜色偏绿色的植 株的扩增产物均有 632bp 大小的条带， 约 120 株叶片颜色偏黄色的植株的 PCR 扩增产物均 没有 632bp 的条带 ( 部分扩增结果如图 1 所示 )。并且经测序证明该 632bp 的片段的序列 与 Seq ID No.1 相同。 0090 可见， 本发明的分。
38、子标记 (Seq ID No.1) 为与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子 标记。 0091 实施例 7 ： 分子标记克隆 0092 将实施例6中扩增获得的632bp的片段克隆到pMD18-T载体中， 获得重组载体。 将 该重组载体转化到大肠杆菌 JM109 中， 挑单克隆， 培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质 粒， 所述质粒即重组载体， 采用 M13 通用引物 ( 序列信息参考 TaKaRa 商品目录 ) 对克隆片 段进行测序， 结果显示， 重组载体中含有本发明的分子标记 (Seq ID No.1)。上述克隆、 转 化、 培养、 质粒提取等步骤参考 分子克隆实验指南第三版 ， 黄培堂等译， 科。
39、学出版社 2002 年 9 月出版。 0093 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护 范围。 说 明 书 CN 102690810 A 11 1/13 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 102690810 A 12 2/13 页 13 0003 序 列 表 CN 102690810 A 13 3/13 页 14 0004 序 列 表 CN 102690810 A 14 4/13 页。
40、 15 0005 序 列 表 CN 102690810 A 15 5/13 页 16 0006 序 列 表 CN 102690810 A 16 6/13 页 17 0007 序 列 表 CN 102690810 A 17 7/13 页 18 0008 序 列 表 CN 102690810 A 18 8/13 页 19 0009 序 列 表 CN 102690810 A 19 9/13 页 20 0010 序 列 表 CN 102690810 A 20 10/13 页 21 0011 序 列 表 CN 102690810 A 21 11/13 页 22 0012 序 列 表 CN 102690810 A 22 12/13 页 23 0013 序 列 表 CN 102690810 A 23 13/13 页 24 序 列 表 CN 102690810 A 24 1/1 页 25 图 1 说 明 书 附 图 CN 102690810 A 25 。