技术领域
本发明涉及一种转录因子突变体，特别涉及一种核转录因子突变体 rFoxO3a-MTSS及其重组载体与应用。
背景技术
核转录因子FoxO3a可通过调节Bim、Fas ligand(FasL)、TNFR2、p27、 p53、抗氧化物酶等多种下游靶基因的转录而发挥促细胞凋亡、细胞周期阻滞及 抗氧化等不同的生物学功能。既往研究表明，FoxO3a广泛分布于哺乳动物的多 种组织和细胞中，并参与糖代谢、骨骼肌的分化发育、血管发生、抑制细胞增 殖、抑制心肌肥厚等生理和病理过程。因此，研究不同病理及生理条件下FoxO3a 转录因子的功能越来越受到人们的广泛关注。Akt是哺乳细胞中广谱存在的经典 信号分子，可通过促进FoxO3a的磷酸化而使其失活，从而给体内研究FoxO3a 基因的功能造成了巨大困难。
目前，国内外的研究重点放在了人类组织及细胞中FoxO3a的功能研究。在 人体组织及细胞中，FoxO3a在体内可被其上游调控因子Akt磷酸化其Thr-32、 Ser-253及Ser-315等位点而导致转录因子FoxO3a失活。然而，大鼠已经成为研 究人类重大疾病的经典模式动物，尤其是在一些需要进行外科手术的疾病模型 中，大鼠比小鼠更具有优势，越来越受到人们的关注。然而，人源及大鼠来源 的FoxO3a基因序列存在一定差异，而且其在体内被Akt激活的位点不同。因此， 本发明利用基因操作技术，构建大鼠FoxO3a基因的突变体及其重组质粒，使其 能够摆脱Akt磷酸化的影响而在体内持续活化，为利用大鼠模型研究FoxO3a基 因的功能及相关疾病的治疗提供了强有力的手段，可广泛应用于FoxO3a基因相 关的大鼠细胞及动物模型研究，具有重要的科学意义与应用价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种核转录因子 突变体rFoxO3a-MTSS。
本发明的另一目的在于提供含有编码上述核转录因子突变体 rFoxO3a-MTSS核苷酸序列的重组载体。
本发明的再一目的在于提供上述重组载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS，其氨基酸序列如下所示： MAEAPASPVPLSPLEVELDPEFEPQSRPRSCWPLQRPELQASPAKPSGETAADSMIPEE60 DDDEDDEDSGGRGSSAMVIGGGVSSALGSGLLLEDSARLLSPGGQDLGTGPASSAGALSG 120 GTQTQLQPQQPLPPPQPGAAGGSGQPRKCSSRRNAWGNLSYADLITRAIESSPDKRLTLS 180 QIYEWMVRCVPYFKDKGDSNSSAGWKNSIRHNLSLHSRFMRVQNEGTGKSSWWIINPDGG 240 KSGKAPRRRAVMDNSNKYTKSRGRAAKKKAALQAAPESADDSPSQLSKWPGSPTSRSSD 300 ELDAWTDFRSRTNNASTVSGRLSPILASTELDDVQDDDGPLSPMLYSSSASLSPSVSKP 360 CTVELPRLTDMAGTMNLNDGLAENLMDDLLDNIALPPSQASPPGGLMQRSSSFPYTAKSS 420 GLGSPTSSFNSTVFGPASLNSLRQSPMQTIQENRPATFSSVSHYGNQTLQDLLTSDSLSH 480 SDVMMTQSDPLMSQASTAVSAQNARRNVMLRNDPMMSFAAQPTQGSLVNQNLLHHQHQTQ 540 GALGGSRALSNSVSNMGLSDSSSLGSAKHQQQSPVSQSMQTLSDSLSGSSLYSASANLPV 600 MGHDKFPSDLDLDMFNGSLECDMESIIRSELMDADGLDFNFDSLISTQNVVGLNVGNFTG 660 AKQASSQSWVPG*672
编码上述核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS的核苷酸序列如下所示： 1ATGGCAGAGG CACCAGCCTC CCCGGTCCCG CTCTCTCCGC TCGAAGTGGA GCTGGACCCA 61 GAGTTCGAGC CACAGAGTCG GCCACGCTCC TGTTGGC CCCTGCAGAG GCCGGAGCTG 121 CAGGCGAGCC CGGCCAAGCC CTCGGGGGAG ACGGCGGCAG ACTCCATGAT CCCCGAGGAG 181 GACGACGATG AAGACGACGA GGACAGCGGC GGCCGAGGCA GCTCGGCCAT GGTGATCGGT 241 GGCGGCGTGA GCAGTGCGCT GGGCTCCGGG CTGCTCCTCG AAGATTCGGC CAGGCTGCTG 301 TCTCCCGGAG GGCAGGACCT CGGGACGGGG CCAGCGTCCT CCGCAGGCGC GCTGAGTGGG 361 GGCACGCAGA CGCAGCTGCA GCCTCAGCAG CCACTGCCAC CGCCGCAGCC GGGGGCGGCT 421 GGGGGCTCTG GGCAACCGAG GAAATGCTCC TCGCGGCGGA ATGCCTGGGG GAACCTGTCC 481 TACGCTGACC TGATCACCCG CGCCATCGAG AGCTCCCCGG ACAAACGGCT CACTTTGTCC 541 CAGATCTACG AGTGGATGGT GCGCTGTGTG CCCTACTTCA AGGATAAGGG CGACAGCAAC 601 AGCTCTGCGG GCTGGAAGAA CTCCATCCGC CACAACCTGT CACTGCACAG CCGTTTCATG 661 CGGGTTCAGA ACGAAGGGAC TGGCAAGAGC TCTTGGTGGA TCATCAACCC CGATGGGGGA 721 AAGAGTGGGA AGGCTCCCCG GCGGCGGGCC GTCTGG ACAACAGCAA CAAGTACACC 781 AAGAGCCGAG GCCGGGCAGC CAAGAAGAAG GCGGCCCTGC AGGCTGCCCC AGAGTCGGCA 841 GACGACAGCC CTTCCCAACT CTCCAAGTGG CCGGGCAGCC CCACATCCCG CAGCAGCGAC 901 GAGCTGGACG CCTGGACCGA CTTCCGCTCG CGCACCAATAACGCCAG CACCGTGAGC 961 GGCCGCCTGT CACCCATCTT GGCGAGCACG GAGCTGGATG ACGTCCAGGA CGATGACGGG 1021 CCCCTCTCCC CCATGCTCTA CAGCAGCTCT GCCAGCCTGT CGCCTTCCGT AAGCAAGCCG 1081 TGTACCGTGG AGCTGCCGCG GCTGACTGAC ATGGCGGGCA CCATGAATCT GAACGATGGG 1141 CTGGCCGAGA ACCTCATGGA TGACCTGCTA GATAACATCG CGCTCCCGCC CTCCCAGGCG 1201 TCGCCTCCTG GCGGGCTTAT GCAGCGGAGC TCCAGCTTCC CGTACACCGC CAAGAGCTCC 1261 GGCCTGGGCT CCCCAACCAG CTCCTTTAAC AGTACCGTGT TCGGACCTGC GTCACTCAAC 1321 TCCCTGCGCC AGTCGCCCAT GCAGACCATC CAGGAGAACA GACCAGCCAC CTTTTCTTCC 1381 GTGTCGCACT ACGGCAACCA GACACTCCAA GACCTGCTCA CTTCGGACTC GCTCAGCCAC 1441 AGCGATGTCA TGATGACCCA GTCAGACCCC TTGATGTCTC AGGCTAGCAC CGCTGTGTCC 1501 GCCCAGAACG CCCGCCGGAA CGTGATGCTT CGCAACGACC CAATGATGTC CTTTGCCGCC 1561 CAGCCTACCC AGGGGAGTTT GGTCAATCAG AACTTGCTCC ACCACCAGCA CCAAACCCAG 1621 GGCGCTCTTG GTGGCAGCCG TGCCTTGTCA AATTCTGTCA GCAACATGGG CTTGAGTGAC 1681 TCCAGCAGCC TCGGCTCAGC CAAACACCAG CAGCAGTCTC CCGTCAGCCA GTCTATGCAA 1741 ACCCTCTCGG ACTCTCTCTC AGGCTCCTCA CTGTATTCAG CCAGTGCAAA CCTTCCCGTC 1801 ATGGGTCACG ACAAGTTCCC CAGTGACTTG GACCTGGACA TGTTCAATGG GAGCTTGGAG 1861 TGTGACATGG AGTCCATCAT CCGTAGCGAA CTCATGGATG CCGATGGGTT GGATTTTAAC 1921 TTTGACTCCC TCATCTCCAC ACAGAACGTT GTTGGTTTGA ACGTGGGGAA CTTCACTGGT 1981 GCTAAGCAGG CCTCATCTCA AAGCTGGGTG CCAGGCTGA
一种重组载体，含有编码上述核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS的核苷酸 序列；
所述的重组载体优选为将编码上述核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS的核 苷酸序列克隆到真核细胞表达载体上得到；
所述的真核细胞表达载体优选为pEGFP-N1；
所述的重组载体优选为pEGFP-rFoxO3a-MTSS，其通过如下具体步骤制备 得到：
(1)根据NCBI数据库中大鼠FoxO3a(rFoxO3a)基因(NM_001106395) 的序列信息，设计PCR引物，扩增野生型大鼠FoxO3a基因的CDS编码区的全 长序列，并将其克隆到pEASY-T3克隆载体中，得到重组载体 pEASY-rFoxO3a-CDS；
(2)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体 pEASY-rFoxO3a-CDS中编码FoxO3a肽链中第32位苏氨酸的碱基ACG突变为 GCG，从而将野生型大鼠FoxO3a肽链中第32位的苏氨酸替换为丙氨酸，得到 突变体重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32；
(3)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体 pEASY-rFoxO3a-MT32中编码FoxO3a肽链中第252位丝氨酸的碱基TCC突变 为GCC，从而将突变体pEASY-rFoxO3a-MT32所编码肽链中第252位的丝氨酸 替换为丙氨酸，得到突变体重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252；
(4)利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒，设计突变引物，将重组载体 pEASY-rFoxO3a-MT32S252中编码FoxO3a肽链中第314位丝氨酸的碱基TCC 突变为GCC，从而将突变体pEASY-rFoxO3a-MT32S252所编码肽链中第314位 的丝氨酸替换为丙氨酸，得到突变体重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252S314；
(5)设计5’端分别包含Xho I及Sac II酶切位点的引物序列对，以突变体重 组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252S314为模板扩增突变后的FoxO3a基因编码序 列(不包含终止密码子)，将其克隆到pEGFP-N1表达载体上，得到突变体重组 载体pEGFP-rFoxO3a-MTSS。
步骤(1)中所述的PCR引物为CDS-F与CDS-R，其序列如下所示：
CDS-F：5’-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3’；
CDS-R：5’-CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3’；
步骤(2)中所述的突变引物为MT32-F及MT32-R，其序列如下所示：
MT32-F：5’-TGTGCGTGGCCCCTGCAGAGGCCGGAGCT-3’；
MT32-R：5’-GGAGCGTGGCCGACTCTGTGGCTCGAACT-3’；
步骤(3)中所述的突变引物为MS252-F及M S252-R，其序列如下所示：
MS252-F：5’-GTCGCCATGGACAACAGCAACAAGTACAC-3’；
MS252-R：5’-GGCCCGCCGCCGGGGAGCCTTCCCACTCTT T-3’；
步骤(4)中所述的突变引物为MS314-F及MS314-R，其序列如下所示：
MS314-F：5’-AATGCCAACGCCAGCACCGTGAGCGGCCG-3’；
MS314-R：5’-GGTGCGCGAGCGGAAGTCGGTCCAGGCGT-3’；
步骤(5)中所述的包含Xho I及Sac II酶切位点的引物为CDSM-F与 CDSM-R，其序列如下所示：
CDSM-F：5’-CCGCTCGAGATGGCAGAGGCACCAGCCTC-3’；
CDSM-R：5’-TCCCCGCGGGCCTGGCACCCAGCTTTGAG-3’；
所述的重组载体可应用于研究FoxO3a基因的功能以及FoxO3a基因有关疾 病的靶向治疗。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
与野生型FoxO3a基因编码的蛋白相比，本发明中的核转录因子突变体 rFoxO3a-MTSS在其编码肽链的第32、252及314等三个位点的氨基酸同时存在 突变，均突变为丙氨酸。所述突变体编码的融合蛋白可在细胞内有效表达，能 够避免细胞内Akt蛋白的磷酸化而保持体内持续激活状态，不仅可实现细胞内 FoxO3a的稳定高表达，同时为利用大鼠模型研究FoxO3a基因的功能及相关疾 病的治疗提供了强有力的手段，可广泛应用于FoxO3a基因相关的大鼠细胞及动 物模型研究，具有重要的科学意义与应用价值。
附图说明
图1是本发明所述重组载体pEGFP-rFoxO3a-MTSS转染293T细胞的荧光 显微镜图，其中，对照为空白对照组，pEGFP-N1为空载体pEGFP-N1转染组， pEGFP-rFoxO3a-WT为重组载体pEGFP-rFoxO3a-WT转染组，
pEGFP-rFoxO3a-MTSS为重组载体pEGFP-rFoxO3a-MTSS转染组；荧光为荧光 显微镜观察图片；白光为白光显微镜观察图片；合并为合并图片；转染时间为 24小时；放大倍数为200倍。
图2是利用Western blotting技术检测重组载体pEGFP-rFoxO3a-MTSS转染 293T细胞后rFoxO3a蛋白及其上游调控因子Akt的表达变化，其中，对照为空 白对照组，pEGFP-N1为空载体pEGFP-N1转染组，pEGFP-rFoxO3a-WT为重 组载体pEGFP-rFoxO3a-WT转染组，pEGFP-rFoxO3a-MTSS为重组载体 pEGFP-rFoxO3a-MTSS转染组；转染时间均为72小时。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。
实施例1rFoxO3a基因的CDS片段扩增及克隆
(1)引物设计
通过GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)查询大鼠 FoxO3a基因的mRNA信息，用Primer Primer5.0软件设计引物CDS-F与CDS-R， 用于扩增大鼠FoxO3a基因CDS编码区。其中，所述引物序列为：
CDS-F：5’-GAGAGGAGAGAGCAAGAGCCCA-3’；
CDS-R：5’-CTCAGTGATCCTTCAGCCTGGC-3’；
(2)大鼠FoxO3a基因编码区CDS的PCR扩增
用TRIzol试剂盒(Invitrogen)提取SD大鼠(购买于广东省医学实验动物中 心)心脏组织总RNA，并用反转录试剂盒(TOYOBO)合成cDNA，并稀释至 200ng/μL。以cDNA为模板，用KOD-Plus-Neo高保真酶(TOYOBO)进行PCR 扩增，具体反应体系如下所示：
表1大鼠FoxO3a基因编码区CDS的PCR扩增反应体系
cDNA模板(200ng/μL) 1μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL dNTPs(2mM) 5μL MgSO4(25mM) 3μL CDS-F(10pmol/μL) 1.5μL CDS-R(10pmol/μL) 1.5μL KOD-Plus-Neo(1.0U/μL) 1μL 灭菌蒸馏水 32μL Total 50μL
将上述反应体系混匀，按照下列条件进行PCR反应：94℃预变性2分钟， 98℃变性10秒钟，68℃退火与延伸1分钟，反应40个循环，4℃保存。
(3)将上述扩增的PCR产物片段进行电泳，并用凝胶回收试剂盒(Qiagen) 进行切胶回收，取DNA片段20ng、pEASY-T3克隆载体(北京全式金生物技术 有限公司)1μL放入一新灭菌的离心管中，并补充DDW(超轻水，deuterium depleted water)至5μL，于25℃反应10分钟。取连接产物2μL转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞(TransGen)，接种于含有IPTG及X-gal的LB固体培养基中培 养过夜，挑选白色克隆进行菌落PCR鉴定及测序验证，获得重组质粒 pEASY-rFoxO3a-CDS。
实施例2重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32的制备
(1)突变引物MT32-F及MT32-R设计：根据引物设计原则及突变要求，利 用Primer Primer5.0软件设计突变引物。所述突变引物序列如下所示：
MT32-F：5’-TGTTGGCCCCTGCAGAGGCCGGAGCT-3’；
MT32-R：5’-GGAGCGTGGCCGACTCTGTGGCTCGAACT-3’；
其中，所述MT32-F引物中小写字母碱基g为突变后的碱基，可将野生型基 因中的密码子ACG突变为gCG，从而将其所编码的苏氨酸突变为丙氨酸。
(2)将上述突变引物稀释至10pmol/μL，模板质粒DNA (pEASY-rFoxO3a-CDS)稀释至50ng/μL，利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试 剂盒(TOYOBO)进行突变反应，具体反应体系如下所示：
表2质粒pEASY-rFoxO3a-CDS突变反应体系
灭菌DDW 35μL 10×Buffer for iPCR 5μL 2mM dNTPs 5μL MT32-F(10pmol/μL) 1.5μL MT32-R(10pmol/μL) 1.5μL 质粒模板DNA(50ng/μL) 1μL KOD-Plus-DNA Polymerase 1μL Total Volume 50μL
将上述反应体系混匀，按照如下条件进行PCR反应：94℃预变性2分钟， 98℃变性10秒钟，68℃退火与延伸1分钟，反应10个循环，4℃保存。在上 述反应液中加入Dpn I酶2μL，于37℃反应1小时。然后取Dpn I酶处理后的 PCR产物2μL，灭菌蒸馏水7μL，Ligation high连接酶5μL，T4PNK1μL置于 一新的离心管中，于16℃反应1小时。取上述反应液10μL转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，接种于含有IPTG及X-gal的LB固体培养基中培养过夜，挑选白色 克隆进行菌落PCR鉴定及测序验证，获得突变体重组载体，命名为 pEASY-rFoxO3a-MT32。上述突变体重组载体将pEASY-rFoxO3a-CDS质粒中编 码FoxO3a肽链中第32位苏氨酸的碱基ACG突变为GCG，从而将野生型大鼠 FoxO3a肽链中第32位的苏氨酸替换为丙氨酸。
实施例3重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252的制备
(1)突变引物MS252-F及M S252-R设计：根据引物设计原则及突变要求， 利用Primer Primer5.0软件设计突变引物。所述突变引物序列如下所示：
MS252-F：5’-GTCATGGACAACAGCAACAAGTACAC-3’；
M S252-R：5’-GGCCCGCCGCCGGGGAGCCTTCCCACTCTTT-3’；
其中，所述MS252-F引物中小写字母碱基g为突变后的碱基，可将野生型基 因中的密码子TCC突变为gCC，从而将其所编码的丝氨酸突变为丙氨酸。
(2)将上述突变引物稀释至10pmol/μL，以突变体质粒 pEASY-rFoxO3a-MT32为DNA模板，并将模板质粒DNA稀释至50ng/μL，利 用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒(TOYOBO)进行突变反应，具体反应体 系如下所示：
表3质粒pEASY-rFoxO3a-MT32突变反应体系
灭菌DDW 35μL 10×Buffer for iPCR 5μL 2mM dNTPs 5μL MS252-F(10pmol/μL) 1.5μL MS252-R(10pmol/μL) 1.5μL 质粒模板DNA(50ng/μL) 1μL KOD-Plus-DNA Polymerase 1μL Total Volume 50μL
将上述反应体系混匀，按照实施例2中所述反应条件进行突变反应，并取反 应液10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于含有IPTG及X-gal的LB固 体培养基中培养过夜，挑选白色克隆进行菌落PCR鉴定及测序验证，获得突变体 重组载体，命名为pEASY-rFoxO3a-MT32S252。上述突变体重组载体将 pEASY-rFoxO3a-MT32质粒中编码FoxO3a肽链中第252位丝氨酸的碱基TCC突 变为GCC，从而将突变体重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32所编码肽链中第252 位的丝氨酸替换为丙氨酸。
实施例4：重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252S314的制备
(1)突变引物MS314-F及MS314-R设计：根据引物设计原则及突变要求， 利用Primer Primer5.0软件设计突变引物。所述突变引物序列如下所示：
MS314-F：5’-AATAACGCCAGCACCGTGAGCGGCCG-3’；
M S314-R：5’-GGTGCGCGAGCGGAAGTCGGTCCAGGCGT-3’；
其中，所述MS314-F引物中小写字母的碱基g为突变后的碱基，可将野生型 基因中的密码子TCC突变为gCC，从而将其所编码的丝氨酸突变为丙氨酸。
(2)将上述突变引物稀释至10pmol/μL，以突变体质粒 pEASY-rFoxO3a-MT32S252为DNA模板，并将模板质粒DNA稀释至50ng/μL， 利用KOD-Plus-Mutagenesis突变试剂盒(TOYOBO)进行突变反应，具体反应 体系如下所示：
表4pEASY-rFoxO3a-MT32S252突变反应体系
灭菌DDW 35μL 10×Buffer for iPCR 5μL 2mM dNTPs 5μL MS314-F(10pmol/μL) 1.5μL MS314-R(10pmol/μL) 1.5μL 质粒模板DNA(50ng/μL) 1μL KOD-Plus-DNA Polymerase 1μL Total Volume 50μL
将上述反应体系混匀，按照实施例2中所述反应条件进行突变反应，并取最 终反应液10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于含有IPTG及X-gal的 LB固体培养基中培养过夜，挑选白色克隆进行菌落PCR鉴定及测序验证，获得 突变体重组载体，命名为pEASY-rFoxO3a-MT32S252S314。上述突变体重组载体 将重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252中编码FoxO3a肽链中第314位丝氨酸的 碱基TCC突变为GCC，从而将突变体重组载体pEASY-rFoxO3a-MT32S252所编 码肽链中第314位的丝氨酸替换为丙氨酸。
实施例5表达核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS融合蛋白的重组载体 pEGFP-rFoxO3a-MTSS的构建
(1)PCR引物设计：根据引物设计原则，利用Primer Primer5.0软件设计 PCR引物CDSM-F与CDSM-R，用于在突变载体pEASY-rFoxO3a-MTSS中扩增 已突变的rFoxO3a基因的编码序列。所述引物序列如下所示：
CDSM-F：5’-CCGCTCGAGATGGCAGAGGCACCAGCCTC-3’；
CDSM-R：5’-TCCCCGCGGGCCTGGCACCCAGCTTTGAG-3’；
其中，所述正向引物CDSM-F序列中斜体加下划线标记的序列为Xho I酶切 位点，所述反向引物CDSM-R序列中斜体加下划线标记的序列为Sac II酶切位点。
(2)PCR扩增：以突变载体pEASY-rFoxO3a-MTSS载体为模板DNA，用 上述引物对及KOD-Plus-Neo高保真酶(TOYOBO)进行PCR扩增，具体反应体 系与反应条件同实施例1所示。其中，所扩增的突变后的rFoxO3a核苷酸序列不 包含终止密码子。
(3)将上述PCR产物用Xho I及Sac II酶(TOYOBO)在37℃条件下酶切 反应1小时，然后将反应产物进行凝胶电泳，并用凝胶回收试剂盒(Qiagen)切 胶回收1.2Kb的线性片段。
(4)取上述切胶回收的PCR产物5μL，经过Xho I及Sac II酶切的pEGFP-N1 载体(BD biosciences Clontech)2μL，Ligation high Ver.2连接试剂7μL，16℃ 反应1小时。取上述反应液10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于含有 氨苄青霉素(100μg/mL)LB固体培养基中，在37℃培养过夜，挑选阳性克隆 并进行测序验证。所构建的重组表达载体命名为pEGFP-rFoxO3a-MTSS。所述表 达载体可表达rFoxO3a-MTSS突变体与绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白。
(5)利用上述条件，构建野生型rFoxO3a基因的表达载体，命名为 pEGFP-rFoxO3a-WT。
实施例6：核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS融合蛋白在293T细胞中的表 达
(1)实验分组：实验分为空白对照组、pEGFP-N1转染组， pEGFP-rFoxO3a-WT转染组，pEGFP-rFoxO3a-MTSS转染组等共4组，所有组别 的细胞数量及培养条件一致。
(2)具体转染方法：将1×105个293T细胞(ATCC，美国)接种于24孔板， 用DMEM(10％的血清、无抗生素)培养基培养24小时，待细胞长到80％融合， 去除原有培养基，分别加入100μL含有500ng质粒DNA与2μL的2000转染试剂(Invitrogen)的Medium(Invitrogen)，放入37℃的培 养箱中继续培养。
(3)荧光显微镜检测：细胞转染24小时后进行荧光显微镜观察并进行拍照。 结果表明，与对空白照组相比，三个实验组均有大量的绿色荧光蛋白表达，其 转染效率均在50％以上。(图1)。
实施例7：核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS的活性检测
将实施例6所述的细胞继续培养至72小时，利用蛋白质裂解液(碧云天) 提取总蛋白质，并用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定试剂(Bradford)测定 其蛋白浓度。具体实验方法请参照文献(Xu-Feng Qi,Dong-Heui Kim,Yang-Suk Yoon,Jian-Hong Li,Soon-Bong Song,Dan Jin,Xue-Zhu Huang,Yung-Chien Teng, Kyu-Jae Lee.The adenylyl cyclase-cAMP system suppresses TARC/CCL17and MDC/CCL22production through p38MAPK and NF-кB in HaCaT keratinocytes.Mol Immunol,2009,46(10):1925-1934.)执行，使用FoxO3a、phospho-FoxO3a、Akt 及-β-actin抗体(均购买于Cell Signaling Technology公司)进行检测，并用IPP6.0 软件对蛋白条带进行灰度分析。结果表明，空白对照组及pEGFP-N1载体转染组 具有FoxO3a蛋白及其磷酸化状态的基础表达，pEGFP-rFoxO3a-WT转染组 FoxO3a蛋白及其磷酸化状态的表达与空白对照组无明显差异，然而， pEGFP-rFoxO3a-MTSS转染组FoxO3a蛋白的表达显著升高，而磷酸化的FoxO3a 表达明显减少。同时，在四组细胞中具有FoxO3a蛋白的上游负调控因子Akt的 表达(图2)。上述实验结果表明，本发明所述的核转录因子突变体rFoxO3a-MTSS 在体内可避免其上游调控因子Akt的磷酸化，进而在体内保持持续激活状态。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。