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1、(10)申请公布号 CN 102618575 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618575 A *CN102618575A* (21)申请号 201110274233.7 (22)申请日 2011.09.16 C12N 15/85(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) (71)申请人 江苏普罗赛生物技术有限公司 地址 213164 江苏省常州市武进区常武中路 801 号常州科教城科技 3 号楼 D 座 9 楼 (72)发明人 柴笑梅 朱月珍 杨宣武 周慧芳 王小娟 江永海 (54) 发明名称 哺乳动物细胞大规。
2、模生产重组人 IGF1-Fc 融 合蛋白的实验技术 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 将 人 胰 岛 素 样 生 长 因 子 -1 与人免疫球蛋白 IgG1 的 Fc 段融合基因 (IGF1-Fc) 转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋 白产物的技术。本发明旨在建立用哺乳动物细胞 大规模生产具有生物学活性的 IGF1-Fc 蛋白的方 法。 在工业生产中满足生产成本降低、 简化工艺流 程、 提高产品产量和质量的总体要求。采用本方 法， 可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高 纯度高生物活性的 IGF1-Fc 蛋白。本项技术应用 于 IGF1-Fc 蛋白的大规模生产， 能够明显降低成 本、 。
3、简化工艺流程， 提高产品产量和质量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的 IGF1-Fc 蛋白的方法， 其特征在 于该方法通过如下步骤用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的 IGF1-Fc 蛋白 ： 制备 转染用质粒和 PEI、 质粒转染 293T 细胞和表达、 蛋白纯化等四个步骤。 2.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的IGF1-Fc蛋白的 方法， 特征。
4、在于所述的 IGF1-Fc 是通过哺乳动物细胞中制备纯化的 3.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的IGF1-Fc蛋白的 方法， 特征在于所述的 IGF1-F 的表达为分泌性的可溶性蛋白 4.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的IGF1-Fc蛋白的 方法， 特征在于所述的具有生物学活性的 IGF1-Fc 作为生物制剂应用于研究和临床诊断 权 利 要 求 书 CN 102618575 A 2 1/4 页 3 哺乳动物细胞大规模生产重组人 IGF1-Fc 融合蛋白的实验 技术 技术领域 0001 本发明涉及一种将人胰岛素样生长因子 -1 与人免疫球蛋白 。
5、IgG1 的 Fc 段融合基 因 (IGF1-Fc) 转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。 背景技术 0002 1.IGF-1 蛋白的生物学作用与应用前景 0003 胰岛素样生长因子 -1(IGF1)， 又称为促生长因子 ( 即 somatomedin C)， 是一种由 生长激素诱导、 通过旁分泌或自分泌方式产生的小分子细胞因子(约70氨基酸)， 因其结构 与胰岛素类似而得名， 是生长激素发挥生理作用必须的一种活性蛋白， 在生长发育及成人 的合成代谢过程中发挥重要功能。 0004 IGF1 对机体的生长发育至关重要。IGF1 是生长激素首要的效应因子， 在细胞生 长、 分化及损伤修复。
6、过程中发挥重要功能。IGF1 是体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂， IGF1与其受体IGF1R结合能够激活AKT信号通路， 从而诱导细胞的分裂增殖， 并抑制细胞程 序性死亡 ； IGF1 对于细胞分化相关蛋白的表达十分重要， 其与某些生长因子协同作用可促 进效应细胞的分化和成熟 ； IGF-1 还参与创伤愈合的过程。实验证明， 损伤的神经、 肌肉和 内皮细胞中 IGF-1 浓度增加。IGF1 表达缺陷能引起个体发育不良甚至侏儒， 例如 Laron 综 合症。外源的重组 IGF1 能够矫正这种缺陷。IGF1 自身可以作为药物用于与发育缺陷相关 疾病的治疗。 0005 IGF1 对于机体的代谢功能。
7、也扮演着重要角色。IGF1 能促进糖原的合成和乳酸分 泌并抑制糖原分解， 增加集体对葡萄糖和氨基酸的吸收， ， 达到降低血糖的目的 ； IGF-1 还 能作用于脂肪细胞， 促进脂肪分解和糖原合成， 从而降低血脂水平。有研究表明， 将 IGF1 用 于胰岛素非依赖型的糖尿病患者能明显降低其血液中葡萄糖的浓度， 疗效显著。 另外， IGF1 在骨的合成代谢中也发挥着重要的作用。IGF1 可促进软骨细胞分裂增殖及软骨基质的形 成， 并刺激合成软骨基质特异型胶原蛋白 -II 型胶原 ； IGF1 还能增强成骨细胞中某些代谢 酶类的活性， 对于骨的正常结构和功能是必需的。IGF1 将用于骨质疏松症中防治。
8、能收到明 显的效果。目前， 国际上很多公司已经开展 IGF1 蛋白作为治疗药物的技术和产品开发， 例 如， Genentech， Cephalon， Chiron 等。Tercica 和 Insmed 公司的 IGF1 相关产品 (Increlex 和 iPlex) 已经通过美国 FDA 的审批上市。 0006 IGF1 的过度表达与肿瘤的发生和发展有密切关系， 临床研究证实人体多种肿瘤组 织或血液中 IGF1 和或其受体的表达明显高于正常组织。在体内许多肿瘤， 如肺癌、 结肠癌、 乳癌、 前列腺 癌、 膀胱癌等肿瘤组织中高表达， 其在外周循环中表达水平也升高。 流行病学 研究表明， 循环中 。
9、IGF-1 水平升高与很多恶性肿瘤的发病率呈正相关， 提示 IGF1 可能参与 了某些肿瘤的发生发展过程。 IGF1可望作为相关肿瘤的重要检测指标用于早期的诊断或预 后的评价 ； 另外， IGF1 还可作为肿瘤治疗上的新靶点， 阻断其产生、 其与受体相互作用， 或 其信号通路的效应因子如癌基因的表达， 对于阻断肿瘤细胞向周围组织的扩散转移或肿瘤 说 明 书 CN 102618575 A 3 2/4 页 4 的复发可能有重要意义。 0007 除此之外， IGF1 还与其它一些疾病， 如心脏病、 脊髓侧索硬化症、 衰老等关系密切。 IGF1 作为靶分子的研究将为许多疾病的早期诊断和治疗提供了新的方。
10、向， 在药物研究及临 床检验中具有广阔的市场前景。 0008 2.Fc 融合蛋白的表达 0009 免疫球蛋白 IgG 的 Fc 融合蛋白是指在基因水平将目的基因同 IgG 的 Fc 片段基因 相连而表达的重组蛋白， 同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域， 从而赋予了重组蛋白 许多新的特性， 拓展了蛋白在科研、 制药及临床等方面的应用。 0010 在重组蛋白表达的过程中， Fc重组蛋白易于结合Protein A， 从而简化了蛋白的纯 化过程 ； Fc 片段可以方便地进行流式、 免疫组化和免疫共沉淀等方法检测， 可用于感兴趣 的基因研究 ； 体外实验中， Fc 融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体。
11、用来研究受体 - 配 体反应和信号通路 ； 此外， Fc 重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术， 如作为抗原制备人类 全抗体库。 0011 另外， Fc 片段还赋予了重组蛋白一些其它特性， 增加了其在在制药和临床方面的 应用价值。融合蛋白中加入重链的恒定区， 其半衰期明显延长， 延长了其在体内的半衰期 ； Fc 段能穿过胎盘、 结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用等 ； 重组蛋白含有的铰链区结构 域使其形成二聚体或多聚体， 增强了其抗原结合力。以上这些特点拓展了融合蛋白在感染 性疾病、 自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面的临床应用前景。 0012 3. 研究现状 0013 目前国际上生产的 IG。
12、F1-Fc 重组蛋白基本都是采用大肠杆菌或酵母表达系统获 得的， 蛋白产物未经糖基化或糖基化程度不高， 活性和毒素含量难以满足临床诊断和治疗 的目的。用哺乳动物细胞生 IGF1-Fc 重组蛋白是生产科研和临床用 IGF1 的重要途径， 对于 推动临床诊断环节的新型生物技术发展和临床药物开发具有重要意义。 发明内容 0014 本发明旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的 IGF1-Fc 蛋白的 方法。 在工业生产中满足生产成本降低、 简化工艺流程、 提高产品产量和质量的总体要求。 0015 本发明包括制备转染用质粒和 PEI、 质粒转染 293T 细胞和表达、 蛋白纯化及等四 个步骤。。
13、用 PEI 作为转染试剂， 其作为 “质子海绵” 可以高效地结合双链 DNA， 把其带入目的 细胞中， 蛋白产物可在短暂的时间(一般可以表达一周的时间)内获得一过性表达从而获 得大量的蛋白。 0016 本发明所用的 293T 细胞是工业生产人临床用蛋白最为常见的一种细胞。不仅表 达水平高， 蛋白翻译后加工方式如糖基化等与体内天然蛋白相似， 而且无潜在的生物危害 性， 自身分泌的蛋白很少从而简化了后续的纯化过程， 特别适于分泌型细胞因子或趋化因 子等产物的大规模生产。而且这种细胞可以通过驯化在无血清培养基中生产， 对于降低工 业生产的成本是必需的。细胞密度能够提高数十倍甚至数千倍， 大大提高了蛋。
14、白产量。 0017 采用本方法， 可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的 IGF1-Fc 蛋白。本项技术应用于 IGF1-Fc 蛋白的大规模生产， 能够明显降低成本、 简化工艺 流程， 提高产品产量和质量。 说 明 书 CN 102618575 A 4 3/4 页 5 附图说明 ： 0018 图1是SDS-PAGE鉴定ProteinA亲和层析柱纯化后的IGF1-Fc重组蛋白SDS-PAGE 电泳分析结果图 (1. 洗脱液 E-1 ； 2. 洗脱液 E-2 ； 3. 洗脱液 E-3 ； 4.Prestained Marker ； 5. 还原条件下的 E-1 ； 6. 还原条件下的。
15、 E-2 ； 7. 还原条件下的 E-3) 0019 图 2 是 IGF1-Fc 蛋白经 superdex 200 纯化柱纯化的峰图 0020 图 3 是 SDS-PAGE 分析 IGF1-Fc 蛋白经 superdex 200 纯化柱各管洗脱液电泳结果 图 0021 图 4 是 SDS-PAGE 鉴定经 superdex 200 进一步纯化的 IGF1-Fc 蛋白电泳结果图 具体实施方式 0022 1. 转染用质粒的制备 0023 用去除内毒素的质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)制备转染所需连有IGF1-Fc 基因的表达质粒 pR-IGF1-Fc。方法见说明书。用 200l TE 缓冲液。
16、溶解质粒， 紫外分光光 度计测其浓度。 0024 2. 转染用 PEI 的制备 0025 1) 在 500ml 的烧杯中倒入 450ml Milli-Q 制备的超纯水 ； 0026 2) 天平称量 500mg 线性 PEI( 购自 Poly Science 公司 )， 加入烧杯中， 磁力搅拌器 不断搅动 ； 0027 3) 逐滴加入预先配好的 12M 浓 HCl 使其 pH 2.0( 大约需要 800l)。搅动 PEI 溶液约 2-3 小时 ； 0028 4) 加入预先配制的 10M NaOH 溶液将 pH 调至 7.0( 大约需要 500l)。用 Milli-Q 超纯水将 PEI 溶液定容至。
17、 500ml。 0029 5)0.22-m 滤膜过滤 PEI 溶液， 分装成 1ml/ 管， -20保存。 0030 3. 质粒转染 293T 细胞 0031 1) 转染前 1 天 ( 约 24 小时 )， 将 293T 细胞用无抗、 含 10胎牛血清的 DMEM 完全 培养基重悬， 按照 5105/ml 铺入 150mm 培养皿中， 每瓶加入 25mL， 5 CO2 培养箱中培养过 夜 ； 0032 2) 转染当天， 将所需的 Opti MEM 培养基 ( 或磷酸盐缓冲液 ) 预热到 25 -37。 冰上溶解连按 IGF1-Fc 基因的表达质粒和 PEI ； 0033 3) 在 5mL 的 。
18、Ep 管中加入 2.5ml Opti MEM/PBS， 加入 43.75g 连有 IGF1-Fc 基因 的质粒 DNA( 紫外分光光度计测其浓度后， 加入洗脱缓冲液调整浓度至 1ug/ul)， 在振荡器 上轻轻涡旋 ； 0034 4) 加入 262.5L1mg/ml 的 PEI， 立即在振荡器上振荡 3 次， 每次 3 秒钟。室温下 将混合液孵育 15 分钟 ； 0035 5) 取出预先铺入培养皿的细胞， 将 DNA/PEI 混合液加入细胞培养液中， ， 轻轻摇晃 培养瓶混匀 ； 将细胞放入培养箱中继续培养。 0036 4. 表达产物收集及纯化 0037 1) 转染 6 小时后， 将细胞培养皿。
19、完全中培养基吸出， 加入 25ml 无血清培养基 说 明 书 CN 102618575 A 5 4/4 页 6 (serum free media， SFM)。同时加入 4mM L- 谷氨酰胺的和 1mM 的丙酮酸钠后继续培养 ； 0038 2) 转染后 2 天和 4 天分别换液并且加入新鲜的 SFM 及 L- 谷氨酰胺和 1mM 的丙酮 酸钠。收集细胞上清 ( 注意不要把细胞去掉 )， 12， 000rpm/min 离心 10min 去死细胞和细胞 碎片 ； 0039 3) 将上清与等体积的结合 / 漂洗缓冲液 (0.15M NaCl， 20mM Na2HPO4， pH8.0)。与 此同时，。
20、 用超纯水洗涤蛋白纯化柱， 再用 1ml 结合 / 漂洗缓冲液洗柱子 ； 0040 4) 吸取 1ml ProteinA 的 Resin 加入纯化柱， 使其中的液体流尽 ； 加入 5mL 结合 / 漂洗缓冲液平衡柱子， 使其流速为 1ml/min ； 0041 5) 将稀释后的上清液上柱， 调节流速为 0.5ml/min ； 0042 6)20mL 结合 / 漂洗缓冲液洗柱， 调节流速为 2ml/min ； 0043 7)最后用41ml 0.1M洗脱缓冲液(glycine， pH 2.5)洗脱蛋白产物， 用1.5ml离 心管收集液体， 管中预先加入 110ul 1M pH 8.5 的 Tris。
21、-Cl 调节 pH 值。紫外分光光度计及 SDS-PAGE 测蛋白浓度及纯度见附图 1( 洗脱液 E-1 ； 2. 洗脱液 E-2 ； 3. 洗脱液 E-3 ； 0044 4.Prestained Marker ； 5. 还原条件下的 E-1 ； 6. 还原条件下的 E-2 ； 7. 还原条件 下的 E-3). 0045 5. 凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白 0046 将洗脱的蛋白产物混合后浓缩至约 0.5ml， 上 superdex 20010/300 进一步纯化。 上柱前先用 S200gel filtration column buffer(50mM Tris pH8.0， 100mM NaCl) 平衡柱 子， 上样后用相同的缓冲液淋洗蛋白， 组分收集器收集洗脱液 0.5ml/ 管。superdex 200 纯 化峰图见附图 2 及 SDS-page 分析纯化纯度结果见附图 3， 经 superdex 200 进一步纯化， SDS-page 验证获得的是高纯度的蛋白， 蛋白纯度 95见附图 4。 说 明 书 CN 102618575 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618575 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618575 A 8 。