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1、(10)申请公布号 CN 102618649 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618649 A *CN102618649A* (21)申请号 201210098418.1 (22)申请日 2012.04.01 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 广州市权诚生物科技有限公司 地址 510650 广东省广州市天河区长兴路美 景街 68 号 (72)发明人 许继国 曾华 詹惠娜 许夏宇 (74)专利代理机构 北京纽乐康知识产权代理事 务所 11210 代理人 史静 (54) 发明名称 一种鸡矮脚相关的分子检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种鸡矮脚相关的。
2、分子检测方 法， 包括以下步骤 ： 从被检个体的血样中提取 DNA ； 根据基因序列突变特征设计适当引物， 扩增 目的基因 ； 琼脂糖凝胶电泳， 进行分型 ； 以及根据 分型结果， 判断待检个体是否有利于育种实践。 本 发明的有益效果为 ： 通过设计三条引物， 对待检 个体的目的基因进行扩增， 通过琼脂糖凝胶电泳 的方法对待检个体进行基因分型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种鸡矮脚相关的分子检测方法， 其特征在于， 。
3、包括以下步骤 ： 从被检个体的血样中提取 DNA ； 根据基因序列突变特征设计适当引物， 扩增目的基因， 所述引物包括三条， 分 别 为 ： 1）引 物 名 称 为 GHRF， 引 物 序 列 为 ggtatcaatcttggagcttcaat ； 2）引 物 名 称 为 GHRF1， 引物序列为 tgacgtgaacagaagtgcatgac ； 以及 3）引物名称为 GHRR， 引物序列为 cctcgaagtttaataaatgt ； 琼脂糖凝胶电泳， 进行分型 ； 以及 根据分型结果， 判断待检个体是否为性连锁矮个体。 2. 根据权利要求 1 所述的一种鸡矮脚相关的分子检测方法， 其特征。
4、在于 ： 性连锁矮小 个体扩增产物序列 ： Ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaagtatggaaatgcctgtcccagactacacttctatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaaactcagaatgtcattttggtactttactggtcacaca agccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttttgtttgtttt cctcgaagtttaataaatgt。 权 利 要 求 书 CN 102618649 A 2 。
5、1/4 页 3 一种鸡矮脚相关的分子检测方法 技术领域 0001 本发明涉及动物遗传育种分子标记辅助选择技术领域， 具体提供导致鸡性连锁矮 小的突变的检测方法。 背景技术 0002 性连锁矮小鸡 （Sex-linked Dwarf Chicken， SLD） 具有基础代谢低， 耗料少， 饲养 密度大， 成本低等优点， 因而在肉蛋鸡育种中有很高的经济价值。 0003 目前已知能导致鸡矮小表型的基因有 8 种， 它们有的是隐性致死， 有的作用方式 不详， 有的表现为常染色体遗传， 有的表现为性染色体遗传， 其中引起人们广泛注意并应用 于实际。它被认为是唯一对鸡本身健康无害而对人有益的突变基因。在 。
6、dw 基因的存在下 可导致鸡生长速度的下降, 使鸡的体形变小。 因而它在肉鸡与蛋鸡育种中具有很高的经济 价值。 0004 性连锁矮小是由于 GHR 基因突变造成的。鸡 GHR 基因定位在 Z 染色体短臂上， 共 编码 608 个氨基酸 （包括 16 个氨基酸的信号肽） 。其中外显子 1 长度不一， 调控转录的起 始 ； 翻译起始位点位于外显子2上， 该外显子编码前体蛋白的信号肽 ； cGHR基因缺少外显子 3（和人的 GHR 基因比较） ； 外显子 4 7 编码 GHR 蛋白的细胞外结构域 ； 外显子 8 编码蛋白 的跨膜结构域 ； 外显子 9 10 编码蛋白的细胞内结构域。 0005 199。
7、1 年 Burnside 等克隆了鸡的 GHR 基因， 并对 SLD 鸡产生的分子基础进行了研 究， 发现鸡 GHR 在功能上的缺陷可能是导致性连锁矮小鸡的遗传基础。而最直接的证据来 自鸡肝细胞培养实验 ： 对性连锁矮小鸡肝细胞转染介导重组正常的生长激素受体基因后， 肝细胞能够正常地响应生长激素的生物功能， 类胰岛素生长因子 I(IGF-I) 的产量显著地 增加， 这充分地表明肝细胞恢复了对生长激素的结合活性。因此， 通常人们认为由 dw 基因 控制的鸡性连锁矮小表型， 是由性染色体上的 GHR 基因的变异引起。GHR 处于 GH-GHR-IGF 轴上， 通过介导生长激素 （Growth Ho。
8、rmone， GH） 来调控 IGF-I 的表达， 从而在体内起着重要 的调节生长发育的作用。鸡的生长激素受体 （Chicken Growth Hormone Gene, cGHR） 基因 在各种组织中都有表达， 但在肝脏、 肌肉、 脂肪等组织中的表达量较高。 对成年鸡鸡肝的GHR 的 RNA 进行 Northern 杂交发现三种转录子， 这些不同长度的转录子在不同组织中都有表 达。研究认为， 表达不同长度的转录子与选择性剪切 cGHR 基因中 3 个终止转录的 poly(A) 信号有关。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种鸡矮脚相关的分子检测方法， 根据 GHR 基因突变的特 点， 。
9、通过设计三条引物， 对待检个体的目的基因进行扩增， 通过琼脂糖凝胶电泳的方法对待 检个体进行基因分型。 0007 本发明的目的是通过以下技术方案来实现 ： 一种鸡矮脚相关的分子检测方法， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 102618649 A 3 2/4 页 4 从被检个体的血样中提取 DNA ； （2） 根据基因序列突变特征设计适当引物， 扩增目的基因 ； （3） 琼脂糖凝胶电泳， 进行分型 ； 以及 （4） 根据分型结果， 判断待检个体是否为有利于育种实践的性连锁矮小个体， 其中， 性 连锁矮小个体扩增产物序列 ： Ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaacccc。
10、aagtatggaaatgcctgtcccagactacacttctatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaaactcagaatgtcattttggtactttactggtcacaca agccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttttgtttgtttt cctcgaagtttaataaatgt。 0008 本发明的有益效果为 ： 通过设计三条引物， 对待检个体的目的基因进行扩增， 通过 琼脂糖凝胶电泳的方法对待检个体进行基因分型。 附图说明 0009 图 1 是。
11、本发明所述一种鸡矮脚相关的分子检测方法的流程图 ； 图 2 是对不同个体进行基因分型的琼脂糖凝胶电泳图， 其中 1-5 为非 DW 突变个体纯合 子 ； 5-10 为 DW 突变纯合子， 表型矮脚 ； 11-15 为 DW 突变杂合子。 。 具体实施方式 实施例 0010 1. 抽取待检个体血样 样品分别来源于华农畜牧场、 湛江遂深家禽有限公司。翅下静脉抽取约 0.3ml 血液， 置 于装有 70 微升抗凝剂的 0.5ml 的离心管中。 0011 2.DNA 的抽提 采用苯酚 - 氯仿抽提法 （奥斯泊等， 1998） 提取鸡基因组 DNA。取 30 L 抗凝全血于 1.5 mL 离心管中， 分。
12、别加入 470 L 1 SET 缓冲液、 12.5 L 20% SDS 和 5 L10 mg/ mL 蛋白酶 K， 混合均匀后置于 55水浴过夜 ； 然后用 Tris 饱和酚抽提 2-3 次， 氯仿 - 异戊 醇 （23 ： 1） 抽提 1 次， 无水乙醇 （-20） 沉淀， 75% 乙醇洗涤并烘干， 最后加入 300 L 灭菌 后的 1 TE 溶液， 放于 55 水浴溶解过夜。DNA 溶液于 -20或 -70长期保存， 使用前 取出按一定比例稀释成 PCR 模板。 0012 3. 目的片段扩增 PCR 程序 ： 95 3， 30 循环 （95 30， 55 30， 72 30） ， 72 5。
13、， 16保存。 0013 引物序列表 引物名称 引物序列 （5-3） GHRFggtatcaatcttggagcttcaat GHRF1tgacgtgaacagaagtgcatgac GHRRcctcgaagtttaataaatgt 4. 琼脂糖凝胶电泳分型 根据电泳条带进行基因分型， 根据育种需要进行选淘个体。 0014 物种 ： 鸡 (chicken) ； 材料 ： 基因组 DNA ； 基因 ： GHR 说 明 书 CN 102618649 A 4 3/4 页 5 SEQ NO ： 1 性连锁矮小个体扩增产物序列 Ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaag。
14、tatggaaatgcctgtcccagactacacttctatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaaactcagaatgtcattttggtactttactggtcacaca agccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttttgtttgtttt cctcgaagtttaataaatgt。 0015 SEQ NO ： 2 非矮小个体扩增产物序列 ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaagtatggaaatgcctgtcccaga。
15、ctacacttctatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaactgcactgcctgtgccagagaaagaatttaacatgtc ttgtggctatgtgagcacagaccagctgaacaaaatcatgccgtagcaattctttgactagatgtttgcagtatttc acagcagagtcagcttgggcttgtgtgctgaaaccaaaatgaagtctaaacgtttgtcgtggttcttacaagtttat ctcgattgttgaaacataaaatattcatcaaaatattcctcttgttctgtaa。
16、atattatctatgaatttgtcttgag actgcttaactagctgtgactgtcttgttcttgtgggtgttgatttttgtgatactaaacattgaaatgactatgtt taatgtacagtaaatcatgctttttgataaagctatagataaggtggtctaaaatctgagaacttagtaaaaatcat gcagttgacggagatctttctatcagtaattgggaactgagcatgaaagtgaaaaaaaaaacacaaaaatagtttga ataaaatatctattttgatctatataaattaataaaatat。
17、attttaatattttagtcacaaaagcttagatgtttta tattacactacatgatgtagtttaattatgatggcccatccaaggaatgtaagcactgcagtcttgaaaaggagttt tctgttttataagagttttgtttgcagcaaaaattaaaaacagattttacagagccattttatacctccaaagaaat ctgtcgagaaattttgaaatattttaggaacttagagtaatcgatcctgttgctttcttatggtaactaatatagaa atagacatgaaatttaaagttttgtaga。
18、aaactttaaactatacaaaatatttggacaaaaatttctgttcttcatc aaattctggttaatgataatatacttttttaaagcaaggtttcaatgaccacagtattaagtagtatggaagtacac tttcattgaaaatttttgaaaacacatgaataagctctggtgatttagcagcataatcttttcgtatttgaccaact tctgaagccctccaatggacaagctaccactacagttattagacagtgacacatgaaatattgattaagaaaataag gacttcaggatttggc。
19、cagcagttgattttttaagctacaaatagatttaaaggcttcaacgaaacacaggaattga atacggtgttgttaaaaaggatttttcctctttgcctaacagcatctcctctgactgagctaggcagacttcttagg aaagaaaggaggtgagaaaaccaaaaccaagtgggaaagttctctttattcttaagtatataaagaacttgacagag ctttgcaatgagtttttattgcttcagaagttaccttattaggctatagctgcatcatatcagggttcttctgataa agca。
20、aatggggatgttcattgcctttctctgacgtgaacagaagtgcatgacgtgcagtgaatgcagatcttgctca tgatgtctcccactgaactcactgatgctctctttgtgaccaagggctacaggactgagcccaaacattgggtggga tttttacgttcagaacgtactctatggtaaatgtgcattaggtattctgctaatttgctgctatatttttctaacag ctacattatttagttacatataaaatttcatagatgatagacactaatgcaagtaaagcctatgtttgtt。
21、tggaaaa agtttcttactctgtttctattgccaaaaatagttaaatacctcaatcaaactcagaatgtcattttggtactttac tggtcacacaagccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttt tgtttgttttcctcgaagtttaataaatgt。 0016 序列表 序列 1 ： 性连锁矮小个体扩增产物序列 Ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaagtatggaaatgcctgtcccagactacacttctatt c。
22、atattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaaactcagaatgtcattttggtactttactggtcacaca 说 明 书 CN 102618649 A 5 4/4 页 6 agccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttttgtttgtttt cctcgaagtttaataaatgt。 0017 序列 2 ： 非矮小个体扩增产物序列 ggtatcaatcttggagcttcaatggcagaaaccccaagtatggaaatgcctgtcccagactacacttc。
23、tatt catattgttcactctccacaaggccttgtgctcaatgcaactgcactgcctgtgccagagaaagaatttaacatgtc ttgtggctatgtgagcacagaccagctgaacaaaatcatgccgtagcaattctttgactagatgtttgcagtatttc acagcagagtcagcttgggcttgtgtgctgaaaccaaaatgaagtctaaacgtttgtcgtggttcttacaagtttat ctcgattgttgaaacataaaatattcatcaaaatattcctcttgttctgtaaatattatct。
24、atgaatttgtcttgag actgcttaactagctgtgactgtcttgttcttgtgggtgttgatttttgtgatactaaacattgaaatgactatgtt taatgtacagtaaatcatgctttttgataaagctatagataaggtggtctaaaatctgagaacttagtaaaaatcat gcagttgacggagatctttctatcagtaattgggaactgagcatgaaagtgaaaaaaaaaacacaaaaatagtttga ataaaatatctattttgatctatataaattaataaaatatattttaata。
25、ttttagtcacaaaagcttagatgtttta tattacactacatgatgtagtttaattatgatggcccatccaaggaatgtaagcactgcagtcttgaaaaggagttt tctgttttataagagttttgtttgcagcaaaaattaaaaacagattttacagagccattttatacctccaaagaaat ctgtcgagaaattttgaaatattttaggaacttagagtaatcgatcctgttgctttcttatggtaactaatatagaa atagacatgaaatttaaagttttgtagaaaactttaa。
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28、gttcattgcctttctctgacgtgaacagaagtgcatgacgtgcagtgaatgcagatcttgctca tgatgtctcccactgaactcactgatgctctctttgtgaccaagggctacaggactgagcccaaacattgggtggga tttttacgttcagaacgtactctatggtaaatgtgcattaggtattctgctaatttgctgctatatttttctaacag ctacattatttagttacatataaaatttcatagatgatagacactaatgcaagtaaagcctatgtttgtttggaaaa agtttcttactctgtttctattgccaaaaatagttaaatacctcaatcaaactcagaatgtcattttggtactttac tggtcacacaagccattattcgccggtcagaagatgtgtctttcagtttctatttaactttccttatgtcagtgttt tgtttgttttcctcgaagtttaataaatgt。 说 明 书 CN 102618649 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618649 A 7 。