技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩 增，具体地说，涉及功能性微生物多样性分析用针对β-葡萄糖苷水解酶基因的引物和使用所 述引物的多重扩增。
背景技术
β-葡萄糖苷水解酶是微生物降解纤维素反应中的限速酶，他作用于由葡聚糖内切酶和葡 聚糖外切酶分解纤维素产生的纤维二糖分子和一些更小的寡聚糖分子，将其水解生成葡萄糖 分子供微生物利用，因此β-葡萄糖苷水解酶在自然界碳循环中发挥着重要的作用。自然界中 能产生β-葡萄糖苷水解酶的微生物种类繁多，不同微生物的β-葡萄糖苷水解酶按其分子结构 特征分属为配糖水解酶家族1(GH1)和配糖水解酶家族3(GH3)两类，同一家族中的β- 葡聚糖苷酶基因同源性较高，这使β-葡萄糖苷水解酶基因具备了作为分子标记基因应用于复 杂微生态环境中功能性微生物群落多样性的研究。
本研究通过数据库获得不同微生物β-葡萄糖苷水解酶基因序列，经DNAMAN6.0软件 进行序列同源性比对后分别设计β-葡萄糖苷水解酶GH1家族的通用简并引物，和β-葡萄糖 苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物，以及β-葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的 通用简并引物。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种功能性微生物多样性分析用引物和使用 该引物的多重扩增，所述引物能良好的反应实验对象中参与降解纤维素的功能性微生物的多 样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。
其技术方案为：
一种功能性微生物多样性分析用引物，选择通用简并引物3对：GH1F和GH1R-GC； GH3BR和GH3BF-GC；GH3ER和GH3EF-GC。
进一步优选，所述通用简并引物为GH1F和GH1R-GC。
进一步优选，所述通用简并引物为GH3BR和GH3BF-GC。
进一步优选，所述通用简并引物为GH3ER和GH3EF-GC。
一种多重扩增检测方法所述方法用于来源土壤，沉积物，人畜胃肠道的环境样品的分 析，该方法包括本发明所述的引物进行扩增。具体方法如下：
β-葡萄糖苷水解酶GH1家族基因的PCR扩增
(1)引物：选择通用简并引物GH1F和GH1R-GC
(2)反应体系及反应参数：模板为纯化后的DNA
加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50μL
(3)反应条件：
35个循环后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
β-葡萄糖苷水解酶GH3家族(细菌来源)基因的PCR扩增
(1)引物：选择通用简并引物GH3BR和GH3BF-GC
(2)反应体系及反应参数：模板为纯化后的DNA
加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50μL
(3)反应条件：
35个循环后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
β-葡萄糖苷水解酶GH3家族(真菌来源)基因的PCR扩增
(1)引物：选择通用简并引物GH3ER和GH3EF-GC
(2)反应体系及反应参数：模板为纯化后的DNA
加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50μL
(3)反应条件：
35个循环后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
样品DNA的提取
改进的细菌基因组DNA的提取方法：
DNA提取液的配制：100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH8.0
(1)称取3g新鲜的堆肥样品，加入13.5mLDNA提取液中；
(2)加入50μL的蛋白酶K(20mg/mL)，于225r/min摇床上37℃摇动30min；再加入1.5mL 的20％SDS，65℃水浴1.5h，每隔10～20min颠倒混匀一次；
(3)室温6,000r/min离心10min，收集上清转移到50mL离心管中，沉淀加入4.5mL提 取液和20％的SDS0.5mL，涡旋震荡20s，65℃水浴10min；
(4)室温6,000r/min离心10min，收集上清合并于上次上清。重复上述操作，收集上清 与前两次上清合并；
(5)上清与等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1体积比)充分混合，6,000r/min离心10min， 吸取上层水相转移至另一50mL离心管中；
(6)以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1h，室温16,000r/min离心15min，收集核酸沉淀；
(7)用预冷的70％乙醇洗涤沉淀，用200μL的TE溶解沉淀。
真菌基因组DNA的提取：
(1)称取0.5g玻璃珠放入1.5mL的离心管中，加入0.4g的样品，加入1mlBufferSLX/ 巯基乙醇。在漩涡震荡器上震荡5min；
(2)在70℃水浴中放置10min，每隔2～3min混匀一次。3000～5000r/min室温离心5min， 转移800μL的上清液到一个新的2mL的离心管中，加入270μL的buffer SP2震荡30S混合 均匀；
(3)冰浴5min，在13000r/min4℃离心5min，转移上清到一个新的2mL的离心管中，加 0.7体积的异丙醇，充分混匀(来回颠倒离心管20次)，4℃13000r/min离心10min用来沉 淀DNA；
(4)小心弃掉上清，确定没有将DNA沉淀吸出，用滤纸将液体吸干，加200μL Elution Buffer至离心管中，震荡10S后加入50μL 的HTR Reagent(使用前要摇匀)，震荡混匀10S；
(5)室温放置2min，13000r/min离心2min；转移上清至一新的1.5mL的离心管中，加 入等体积的XP2 Buffer，震荡混匀10S；
(6)将上述离心管中液体的700μL放置到提供的HiBind DNA column中，室温10000r/min 离心1min，弃掉上清液，将柱子重新放回收集管中，重复一次后加300μL XP2 Buffer，室 温10000r/min离心1min；
(7)倒掉上清液，再将柱子放回新的收集管中，再用700μL用无水乙醇稀释过的SPW Wash Buffer，10000r/min离心1min，倒掉上清液，重复再加700μL的SPW Wash Buffer后 离心；
(8)弃掉液体将柱子放入一个空的收集管中13000r/min室温离心2min，这一步骤很重 要，处理不当会影响下游操作；
(9)将柱子放置到新的1.5mL的离心管中，加入30μL的去离子，13000r/min离心1min 洗脱DNA，重复一次。
变性梯度凝胶电泳
采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，其中尿素浓度40％～70％。电泳采用D-code DGGE系统 (Bio-Rad)，电泳缓冲液为1×TAE，在130V固定电压下电泳17h，进行硝酸银染色。
条带的克隆序列分析
从DGGE胶中选择特异条带切下，用去离水冲洗净后放入灭菌离心管中，加30μL的去离 子水，放于4℃冰箱12-14h；
用测序引物(不带GC夹子)再次扩增，扩增产物与pMD18-T载体连接后转化感受态细 胞，提取质粒DNA后进行双酶切鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的引物具有很好的通用性和实用性，能良好的反应实验对象中参与降解纤维 素的功能性微生物的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分 析。
附图说明
图1是堆肥样品总DNA中β-glucosidase基因GH1家族的PCR扩增结果图；
图2是自然堆肥β-葡萄糖苷水解酶GH1家族DGGE图谱；
图3是堆肥样品总DNA中β-glucosidase基因GH3家族(细菌)的PCR扩增结果；
图4是自然堆肥β-葡萄糖苷水解酶GH3家族(细菌)DGGE图谱；
图5堆肥样品总DNA中β-glucosidase基因GH3家族(真菌)的PCR扩增结果；
图6自然堆肥β-葡萄糖苷水解酶GH31家族(真菌)DGGE图谱。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
本发明通过数据库获得不同微生物β-葡萄糖苷水解酶基因序列，经DNAMAN6.0软件进 行序列同源性比对后分别设计β-葡萄糖苷水解酶GH1家族的通用简并引物(GH1F，GH1R， GH1R-GC)，和β-葡萄糖苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物(GH3BF，GH3BR， GH3BF-GC)以及β-葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用简并引物(GH3EF，GH3ER， GH3EF-GC)。
β-葡萄糖苷水解酶GH1家族基因阳性微生物群落的组成
简并引物扩增β-葡萄糖苷水解酶基因(GH-1家族)得到约400bp的目的片段，反应特异 性好。结果显示堆肥样品DNA中目的条带扩增效果见图1。
从图2中可以观察到堆肥第3-12天(即高温期的前期)条带与堆肥其他时期明显不同。 堆肥第14-26天(即高温期的后期及降温期)条带图谱变化不大，同高温期的前期条带图谱 差别明显。在高温堆肥处理农业固体废弃物过程中，高温期前期多糖和淀粉类等易分解物质 降解迅速，而这一时期纤维素分解缓慢，随着堆肥进程的发展易分解的有机质分解殆尽后纤 维素类物质开始大量为微生物所分解利用。这解释了本研究中堆肥高温期β-葡萄糖苷水解酶 GH1家族条带的变化趋势，即高温期后期及降温期条带的指示菌与纤维素类物质分解有关 联。堆肥第31天堆体进入腐熟期，之前出现的条带消失且没有新条带出现，指示尽管该时期 仍为纤维素类物质快速分解期，但没有或很少有β-葡萄糖苷水解酶GH1家族条带指示菌参 与，这在PCR结果中已有体现。
β-葡萄糖苷水解酶GH3家族基因阳性微生物群落的组成
简并引物扩增β-葡萄糖苷水解酶基因(GH-3家族原核微生物来源)得到约370bp的目的 片段，反应特异性好。结果显示堆肥第20，22，26，31天样品DNA中目的条带扩增效果不明 显见图3。
从图4中可以观察到堆肥的不同时期即高温期前期和高温期后期及降温腐熟期图谱条带 区别明显，结合PCR结果可知在纤维素物质快速降解的时期(即高温期中后期和降温腐熟 期)，具有β-葡萄糖苷水解酶基因GH-3家族的原核微生物没有或有很少种类和数量的细菌参 与纤维素物质的分解。
简并引物扩增β-葡萄糖苷水解酶基因(GH-3家族真核微生物来源)得到约500bp的目的 片段，反应特异性好。结果显示堆肥第20，22，26，31天样品DNA中目的条带扩增特异性好 见图5。
从图6中可以观察到堆肥的高温期末期和降温腐熟期条带变化不大，降温腐熟期条带多 样性略有增加，这与一般好氧堆肥进程中真菌菌群的动态变化是一致的，即高温期数量降低， 降温腐熟期数量及种类增加。表明具有β-葡萄糖苷水解酶基因GH-3家族的真菌在堆肥的高温 期后期和降温期参与纤维素的分解，并取代细菌在堆肥的低温阶段即第二中温期发挥重要的 功能。
附：本发明所涉及的引物序列：
GH-3-E家族
上游引物GH3EF(750bp)
5→3：ggtggtcgcRRYtggga
5→3：ggtggtcgc(ag)(ag)(ct)tggga
下游引物GH3ER(1210bp)
5→3：ccaggcatcggWcatRtc
5→3：ccaggcatcgg(ta)cat(ag)tc
对应序列：ga(tc)atg(at)ccgatgcctgg
GH-3-B家族
上游引物GH3BF
5→3：ttcggcgaaga(tc)cc
5→3：ttcggcgaagaYcc
上游引物GH3BFGC
5→3：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGttcggcgaagaYcc 下游引物GH3BR
5→3：acgcctt(ct)(ga)(at)a(ag)cc
5→3：acgccttYRWaRcc
GH-1家族
上游GH1F
5→3：cctaccagat(tc)ga(ag)gg 16bp 63℃
5→3：cctaccagatYgaRgg 16bp 63℃
下游GH1R
5→3：gaggaag(ag)tccca(ag)tg 16bp 64℃
5→3：gaggaagRtcccaRtg 16bp 64℃
下游GH1RGC
5→3：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGgaggaagRtcccaRtg