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1、(10)授权公告号 CN 103160578 B (45)授权公告日 2015.01.28 CN 103160578 B (21)申请号 201310053479.0 (22)申请日 2013.02.19 C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 苏州中生达麦迪分子诊断技术有 限公司 地址 215000 江苏省苏州市锦峰路 8 号 1 号 楼 501-503 室 (72)发明人 张志栋 贾海英 易翔 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 郝传鑫 CN 101876659 A,2010.11.03, 权利要求 1-7. CN 101935703 A,2。
2、011.01.05,说明书第1页 第 4-5 段 . 高云等 .EGFR 基因突变及其检测方法的研究 进展 . 分子诊断与治疗杂志 .2011, 第 3 卷 ( 第 1 期 ),51-57. (54) 发明名称 EGFR 基因专用量子点检测试剂盒 (57) 摘要 本发明提供一种 EGFR 基因专用量子点检测 试剂盒， 所述试剂盒包括以下试剂 ： EGFR 基因特 异性 DNA 探针、 人 7 号染色体着丝粒特异性 DNA 探针、 表面经修饰的量子点水溶液、 量子点纳米 球粉末、 正硅酸乙酯溶液、 戊二醛溶液、 硅烷化试 剂、 带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末、 1- 乙 基 -3(3- 二甲基。
3、胺基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐和聚 丙烯酸。在表面修饰的量子点及量子点纳米球表 面连接 EGFR 基因的特异性探针之后， 可以很好地 识别EGFR基因及EGFR基因扩增的肿瘤细胞， 未连 接 EGFR 探针的量子点及量子点纳米球与 EGFR 基 因及肿瘤细胞不结合或结合很少。本发明提供的 检测试剂盒， 在 EGFR 基因检测中具有广阔的应用 前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曹丙洲 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 103160578 B CN 10316057。
4、8 B 1/1 页 2 1.EGFR 基因专用量子点检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括以下试剂 ： (1)10g EGFR 基因特异性 DNA 探针， 所述 EGFR 基因特异性 DNA 探针为特异性结合人 7 号染色体短臂 7p12-p14 的 DNA 片段 ； 即， 采用基因工程技术将此段 DNA 序列克隆至载体 上， 然后转化大肠杆菌， 过夜培养， 质粒提取， 酶切获得长度为 100-750bp 的 DNA 片段 ； 所述 人 7 号染色体短臂 7p12-p14 在 GenBank 中编号为 NG_007726.3 ； (2)2mL 浓度为 1.2moL/L 表面修饰有巯基丙酸的。
5、红色荧光 CdTe/ZnS 量子点水溶液， 在水溶液中该量子点表面电位为 -35 -40meV ； (3)50mg 平均粒度为 500nm 的包埋 CdTe/ZnS 量子点的牛血清白蛋白纳米球粉末 ； (4)10g 7 号染色体着丝粒特异性探针， 所述 7 号染色体着丝粒特异性 DNA 探针为 特异性结合人 7 号染色体着丝粒 7p11.1-q11.1 的 DNA 片段 ； 所述人 7 号染色体着丝粒 7p11.1-q11.1 在 GenBank 中编号为 AC019063.4 ； (5)2mL 浓度为 1.2moL/L 表面修饰有巯基丙酸的绿色荧光 CdTe 量子点水溶液， 在水 溶液中该量。
6、子点表面电位为 -35 -40meV ； (6)50mg 平均粒度为 500nm 的包埋 CdTe 量子点的牛血清白蛋白纳米球粉末 ； (7)2mol/L 正硅酸乙酯溶液 1ml ； (8)1.25戊二醛溶液1ml ； 配制方法 ： 取25戊二醛50ml与pH6.8的PBS溶液1ml混 合， 即得 ； (9) 硅 烷 化 试 剂 KH550 1ml ； 所 述 硅 烷 化 试 剂 任 选 CH2 CHSi(OC2H5)3、 CH2 CHSi(OCH3)2、 CH2 CHSi(OC2H4OCH3)3、 CH2 C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3、 HSC3H6Si(OCH3)3、 H2。
7、NC3H6Si(OC2H5)3、H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3、H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3、CH3Si(OC2H5)3、 (CH3)3SiNHSi(CH3)3中的一种 ； (10) 带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末 10mg ； 所述带羧基的聚乙二醇衍生化的磷 脂为 PE-PEG2000-COOH 或 PC-PEG2000-COOH， 其中聚乙烯醇分子量为 2000 ； 制备方法为 ： 聚 乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合， 其中构成所述聚乙二醇衍生化的磷 脂中的脂肪酸选自肉豆蔻酸、 棕榈酸或硬脂酸， 磷脂为磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱 ； (11)1g。
8、 1- 乙基 -3(3- 二甲基胺基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐粉末 ； (12) 聚丙烯酸粉末 50mg ； (13) 无水乙醇 1ml ； (14)0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 20ml， pH 值为 7.4 ； (15) 灭菌双蒸水 10ml。 权 利 要 求 书 CN 103160578 B 2 1/5 页 3 EGFR 基因专用量子点检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物医学领域， 具体地说， 涉及一种 EGFR 基因专用量子点检测试剂 盒。 背景技术 0002 EGFR 是原癌基因 c-erb-1 的表达产物， 是表皮生长因子受体 （HER） 家族成员之一。 EGFR 广泛分。
9、布于哺乳动物上皮细胞、 成纤维细胞、 胶质细胞、 角质细胞等细胞表面， EGFR 信 号通路对细胞的生长、 增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR 在多种上皮性肿瘤高 表达， 其过表达与肿瘤细胞的增殖、 活动性、 粘连性、 侵袭性、 凋亡抑制和血管生成相关， 最 终导致细胞的转化、 增殖， 抵抗细胞凋亡、 促进细胞生存， 与肿瘤的发生、 发展、 临床分期、 生 存期、 预后和对治疗反应相关。30%-40% 非小细胞患者存在 EGFR 基因扩增， 因此现在 EGFR 检测被广泛用于非小细胞肺癌的预后评价及指导治疗。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种 EGFR 基因专用量子点检测试。
10、剂盒。 0004 为了实现本发明目的， 本发明的一种 EGFR 基因专用量子点检测试剂盒， 该试剂盒 包括以下试剂 ： EGFR 基因特异性 DNA 探针、 7 号染色体着丝粒特异性 DNA 探针、 表面经修饰 的量子点水溶液、 量子点纳米球粉末、 正硅酸乙酯溶液、 戊二醛溶液、 硅烷化试剂、 带羧基的 聚乙二醇衍生化的磷脂粉末、 1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐和聚丙烯酸 ； 其中， 所述 EGFR 基因特异性 DNA 探针为特异性结合人 7 号染色体短臂 7p12-p14 （GenBank ： NG_007726.3） 的 DNA 片段 ； 所述人 7 号染色体着丝粒特异性。
11、 DNA 探针为特异性结合人 7 号 染色体着丝粒 7p11.1-q11.1（GenBank:AC019063.4） 的 DNA 片段。 0005 所述表面经修饰的量子点水溶液和量子点纳米球粉末中的量子点是指 CdSe、 CdTe、 CdSe/ZnS（在 CdSe 表面包覆一层 ZnS 所形成的核壳结构的量子点） 、 CdTe/ZnS（在 CdTe 表面包覆一层 ZnS 所形成的核壳结构的量子点） 、 CdTe/CdSe（在 CdTe 表面包覆一层 CdSe 所形成的核壳结构的量子点） 、 InP、 InAs、 InGaAs、 InGaP、 InGaP/ZnS（在 InGaP 表面包 覆一层Z。
12、nS所形成的核壳结构的量子点） 等中的任一种纳米粒子， 或任意几种纳米粒子的组 合。 0006 所述表面经修饰的量子点水溶液的浓度为 1.2mol/L， 用于量子点表面修饰的试 剂为巯基乙酸、 巯基丙酸、 二巯基丁二酸、 巯基乙胺、 白蛋白、 纤维素、 聚苯乙烯、 聚乙二醇、 磷脂、 二氧化硅等中的至少一种。 0007 所述量子点纳米球粉末是指量子点包埋于白蛋白、 乙基纤维素或聚苯乙烯等聚合 物中所形成的粉末， 纳米球粒度为 50-1000nm。 0008 所 述 硅 烷 化 试 剂 任 选 CH2 CHSi(OC2H5)3、 CH2 CHSi(OCH3)2、 CH2 CHSi(OC2H4OC。
13、H3)3、 CH2 C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3、 HSC3H6Si(OCH3)3、 H2NC3H6Si(OC2H5)3、 H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3、 H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3、 CH3Si(OC2H5)3、 (CH3)3SiNHSi(CH3)3等中的一 说 明 书 CN 103160578 B 3 2/5 页 4 种。 0009 所述带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末， 其结构式为 PE-PEG2000-COOH 或 PC-PEG2000-COOH， 制备方法为 ： 聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合， 其中构成所述聚乙二醇衍。
14、生化的磷脂中的脂肪酸选自肉豆蔻酸、 棕榈酸或硬脂酸， 构成所 述聚乙二醇衍生化的磷脂中的磷脂为磷脂酰乙醇胺 （PE） 或磷脂酰胆碱 （PC） 。 0010 所述正硅酸乙酯溶液的浓度为 2mol/L。 0011 所述戊二醛溶液的浓度为 1.25%。 0012 所述试剂盒中还包括无水乙醇、 磷酸盐缓冲液、 灭菌双蒸水中的中的至少一种。 其 中， 磷酸盐缓冲液的浓度为 0.1mol/L。 0013 本发明还提供所述试剂盒在检测非小细胞肺癌组织细胞中 EGFR 基因是否扩增中 的应用。 0014 检测 EGFR 基因需要一个能特异性识别 EGFR 基因的探针， 以及连接在探针上的标 记物 ( 如荧光染。
15、料或同位素示踪剂 )， 连接荧光或同位素示踪剂的探针， 谓之 “检测探针” 。 探针和靶序列双链 DNA 变性后杂交， 互补的异源单链 DNA 分子在适宜的温度和离子强度下 退火形成稳定的异源双链 DNA， 通过荧光标记显示出来。本发明检测 EGFR 基因的原理是利 用与荧光染料量子点相连接的对 EGFR 基因特异的探针 （GLP EGFR） ， 杂交到病变组织细胞 的 7 号染色体短臂 （7p12-p14） 上， 然后在荧光显微镜下观察， 在组织原位直接显示此基因 扩增与否的情况。同时用连接在荧光染料量子点的标记了绿色荧光信号的对 7 号染色体着 丝粒特异的探针 （CSP7） 作为对照， 杂。
16、交到 7 号染色体着丝粒 （7p11.1-q11.1） 上， 这种双探 针同标记的方法， 进一步保证了观察的准确性。 0015 本发明中的荧光染料选用量子点， 量子点是一种直径在 110 纳米之间的半导体 纳米微晶， 是一种近年来研究较多的新型荧光染料。 与传统有机荧光染料相比， 量子点的荧 光更稳定持久， 荧光强度更高， 激发光谱更宽， 荧光发射光谱更窄。 0016 EGFR 探针能特异性地识别 EGFR 基因， 而对其他基因不识别， 因此， 当连接量子点 的 EGFR 探针与未知细胞 （或未知组织） 作用后， 可通过细胞 / 或组织中结合荧光量子点的个 数来判断 EGFR 基因是否扩增。可。
17、见， EGFR 基因探针与量子点连接， 可作为检测 EGFR 基因 的特异性生物探针， 可以组成试剂盒为研究者提供方便。 0017 本发明的优点在于 ： 0018 本发明将EGFR基因特异性探针， 人7号染色体着丝粒特异性探针与荧光染料量子 点及连接试剂组成试剂盒， 能特异性地识别 EGFR 基因和 7 号染色体着丝粒， 而对其他基因 不识别， 因此， 当连接量子点的 EGFR 探针和连接量子点的着丝粒探针与未知细胞 ( 或未知 组织 ) 作用后， 可通过细胞 / 组织中结合的两种荧光量子点的比值来判断 EGFR 基因是否扩 增， 在临床上具有实用价值， 市场前景广阔。 具体实施方式 0019。
18、 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0020 实施例 1EGFR 基因专用量子点检测试剂盒 0021 EGFR 基因专用量子点检测试剂盒， 该试剂盒中装有插片， 插片上设有多个供试剂 说 明 书 CN 103160578 B 4 3/5 页 5 管插入的孔， 所述试剂盒中包括 12 管装有不同材料的试剂管， 分别为 ： 0022 (1)10g EGFR 基因特异性 DNA 探针， 所述 EGFR 基因特异性 DNA 探针为特异性结 合人 7 号染色体短臂 7p12-p14（。
19、GenBank ： NG_007726.3） 的 DNA 片段 ； 即， 采用基因工程技 术将此段 DNA 序列克隆至载体上， 然后转化大肠杆菌， 过夜培养， 质粒提取， 酶切获得长度 为 100-750bp 的 DNA 片段。 0023 (2)2mL浓度约为1.2moL/L表面修饰有巯基丙酸的红色荧光CdTe/ZnS量子点水 溶液， 在水溶液中该量子点表面电位为 -35-40meV ； 0024 (3)50mg平均粒度为500nm的包埋CdTe/ZnS量子点的牛血清白蛋白(BSA)纳米球 粉末 (CdTe/ZnS/BSA nanospheres) ； 0025 (4)10g7号染色体着丝粒特。
20、异性探针， 所述7号染色体着丝粒特异性DNA探针为 特异性结合人 7 号染色体着丝粒 7p11.1-q11.1（GenBank:AC019063.4） 的 DNA 片段 ； 0026 (5)2mL 浓度约为 1.2moL/L 表面修饰有巯基丙酸的绿色荧光 CdTe 量子点水溶 液， 在水溶液中该量子点表面电位为 -35-40meV ； 0027 (6)50mg平均粒度为500nm的包埋CdTe量子点的牛血清白蛋白(BSA)纳米球粉末 (CdTe/BSA nanospheres) ； 0028 (7)2mol/L 正硅酸乙酯溶液 1ml ； 0029 (8)1.25% 戊二醛溶液 1ml。配制方。
21、法 ： 取 25% 戊二醛 50ml 与 pH6.8 的 PBS 溶液 1ml 混合， 即得。 0030 (9) 硅烷化试剂 (KH550， 硅烷化试剂任选 CH2 CHSi(OC2H5)3、 CH2 CHSi(OCH3)2、 CH2 CHSi(OC2H4OCH3)3、 CH2 C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3、 HSC3H6Si(OCH3)3、 H2NC3H6Si(OC2H5)3、 H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3、 H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3、 CH3Si(OC2H5)3、 (CH3)3SiNHSi(CH3)3中 的 一 种 )1ml ； 0031 。
22、(10)带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂(PE-PEG2000-COOH或PC-PEG2000-COOH)粉 末 10mg， 其中聚乙烯醇分子量约为 2000。制备方法为 ： 聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分 子上的含氮碱基结合， 其中构成所述聚乙二醇衍生化的磷脂中的脂肪酸选自肉豆蔻酸、 棕 榈酸或硬脂酸， 磷脂为磷脂酰乙醇胺 （PE） 或磷脂酰胆碱 （PC） 。 0032 (11)1g1- 乙基 -3(3- 二甲基胺基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 粉末 ； 0033 (12) 聚丙烯酸粉末 50mg ； 0034 (13) 无水乙醇 1ml ； 0035 (14)0.1mol/L 磷酸盐缓。
23、冲液 20ml， pH 值为 7.4 ； 0036 (15) 灭菌双蒸水 10ml。 0037 实施例 2EGFR 基因专用量子点检测试剂盒在 EGFR 基因检测中的应用 0038 针对实施例 1 中制备的试剂盒， 量取 CdTe/ZnS 量子点 (QDs) 水溶液 400L， 向其 中加入无水乙醇与正硅酸乙酯的混合溶液 40L( 无水乙醇占混合溶液总量的 25%)， 室温 下振荡 48h 后停止振荡， 置于 4冰箱中备用。 0039 向 上 述 硅 量 子 点 (QDs/SiO2) 水 溶 液 中 加 入 硅 烷 化 试 剂 溶 液 (KH550) 和 戊 二 醛 (glutaraldehy。
24、de) 的 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液， 于 室 温 下 振 荡 2h 后， 获 得 (QDs/ SiO2)-KH550-glutaraldehyde。 0040 将 EGFR 探针溶解于磷酸盐缓冲液中， (QDs/SiO2)-KH550-glutaraldehyde 水溶液 说 明 书 CN 103160578 B 5 4/5 页 6 (200L) 中加入 EGFR 探针磷酸盐缓冲液， 其中， QDs/SiO2与探针的摩尔比约为 1:5， 于 4 条件下振荡过夜后， 即获得 EGFR 量子点探针。 0041 7 号染色体着丝粒量子点探针的制备方法与 EGFR 量子点探针的制备方法相同， 将 。
25、制备的 EGFR 量子点探针和 7 号染色体着丝粒量子点探针混合后与 200L 的不含血清的细 胞培养液 (RPMI-1640) 混合， 置于 4冰箱中备用。 0042 将探针混合物滴于正常人的细胞玻片杂交区域， 立即加盖盖玻片， 封片胶封住盖 玻片边缘， 避免盖玻片与玻片之间产生气泡。 玻片置于杂交仪中83变性5分钟， 42杂交 16 小时。洗片后在荧光显微镜下观察。 0043 对照实验 ： 0044 按 上 述 相 同 的 方 法 将 未 连 接 EGFR 基 因 探 针 的 量 子 点 (QDs/ SiO2)-KH550-glutaraldehyde)与正常人的细胞玻片进行杂交， 将未连。
26、接7号染色体着丝粒 特异探针的量子点与正常人的细胞玻片进行杂交， 共培育后荧光显微镜下观察。 0045 结果显示， 与 EGFR 量子点探针和着丝粒量子点探针共培育后的每个细胞均有两 个量子点红色荧光和两个量子点绿色信号。可见， 本发明提供的量子点试剂盒能很好地特 异性识别 EGFR 基因。 0046 实施例 3EGFR 基因专用量子点检测试剂盒在 EGFR 基因检测中的应用 0047 针对实施例 1 中制备的试剂盒， 将 5mg 的带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂 (PE-PEG2000-COOH)溶解于5ml三氯甲烷溶液中(三氯甲烷为常用溶剂， 因此可不作为试剂 盒的一部分 )， 取该溶液 1。
27、ml( 剩余 4ml 于 4冰箱中保存备用 ) 置于梨形瓶中， 旋转蒸发挥 去三氯甲烷成薄膜， 进一步用氮气吹干薄膜。 0048 向 该 薄 膜 中 加 入 CdTe/ZnS 量 子 点 (QDs) 水 溶 液 1ml， 超 声 波 振 荡 45min， 获 得 QDs-(PE-PEG2000-COOH)。 加 入 1- 乙 基 -3(3- 二 甲 基 胺 基 丙 基 ) 碳 二 亚 胺 盐 酸盐 (EDC) 的磷酸盐缓冲液， 30min 后， 加入 EGFR 探针， 其中， 三者间的摩尔比为 ： QDs-(PE-PEG2000-COOH) EDC EGFR 探针 1:3.6:3， 在 4反应。
28、过夜。 0049 将获得量子点探针混合物与肺癌阳性组织切片进行杂交。作为对照， 将未连接 EGFR 基因探针的量子点 (QDs-(PE-PEG2000-COOH) 与肺癌阳性组织切片进行杂交， 将未连 接 7 号染色体着丝粒特异探针的量子点与肺癌阳性组织切片按上述相同方法进行杂交。 0050 结果显示， 连接 EGFR 探针的量子点几乎与所有肺癌细胞结合， 每个细胞中有两个 以上的红色荧光， 与绿色量子点荧光的比值大于或等于 2。而对照实验中， 只有少量的红色 荧光或绿色荧光。这些结果表明 EGFR 探针连接的量子点能有效识别 EGFR 基因及 EGFR 基 因扩增的癌细胞。 0051 实施例。
29、 4EGFR 基因专用量子点检测试剂盒在 EGFR 基因检测中的应用 0052 针对实施例 1 中制备的试剂盒， 称取包埋 CdTe/ZnS 量子点 (QDs) 的牛血清白蛋白 (BSA) 纳米球粉末 (QDs-BSA)10mg， 分散于 1ml 灭菌双蒸水中， 超声波分散约 15min 后， 向其 中加入聚丙烯酸(PAA)粉末， 继续超声波分散， 约30min后， 静置约10min， 然后离心， 用灭菌 双蒸水洗涤沉淀， 获得 (QDs-BSA)/PAA 纳米球， 再分散于磷酸盐缓冲液中。 0053 向 (QDs-BSA)/PAA 溶液中加入 1- 乙基 -3(3- 二甲基胺基丙基 ) 碳二。
30、亚胺盐酸盐 (EDC)的磷酸盐缓冲液， 反应30min后， 加入EGFR探针， 其中， (QDs-BSA)/PAA纳米球与EGFR 探针的摩尔比约为 1 1000， 4反应过夜。然后进行实验。 说 明 书 CN 103160578 B 6 5/5 页 7 0054 将获得量子点探针混合物与肺癌阴性组织切片进行杂交。作为对照， 将未连接 EGFR 基因探针的量子点 (QDs-(PE-PEG2000-COOH) 与肺癌阴性组织切片进行杂交， 将未连 接 7 号染色体着丝粒特异探针的量子点与肺癌阴性组织切片按上述相同方法进行杂交。 0055 荧光显微镜下发现， 连接 EGFR 探针的量子点几乎与所有细胞结合， 每个细胞中有 两个红色荧光和两个绿色荧光， 红色与绿色量子点荧光的比值小于 2。而对照实验中， 只有 少量的红色荧光或绿色荧光。 这些结果表明EGFR探针连接的量子点能有效识别EGFR基因。 0056 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103160578 B 7 。